Amino Asitler Yapısı ve Fonksiyonları-II PDF

Amino Asitler Yapısı ve Fonksiyonları-II Prof. Dr. Tahir KAHRAMAN KBÜ Tıp Fakültesi T. Biyokimya AD 1 Amino asitler: Peptid bağ oluşumu İki amino asit birleşerek peptid bağı veya amid bağı oluşturur Kondensasyon tipi bir birleşme, su...

Amino Asitler Yapısı ve Fonksiyonları-II Prof. Dr. Tahir KAHRAMAN KBÜ Tıp Fakültesi T. Biyokimya AD 1 Amino asitler: Peptid bağ oluşumu İki amino asit birleşerek peptid bağı veya amid bağı oluşturur Kondensasyon tipi bir birleşme, su çıkar Birinci aminoasidin ɑ-karboksil grubu ile diğer amino asidin ɑ-amino grubu birleşerek Bu tip bir kondensasyon tepkimesi sulu ortamda kendiliğinden gerçekleşmez Amino ve karboksil grupları iyon olduğu halde amid halde artık iyonik değildir. Alanin Serin Alaninilserin Amino asitler: Peptid bağ oluşumu Peptid zincirindeki aminoasit sayısı 2, dipeptid, 3 tripeptid, oligopeptid (4-20) polipepetid (20 den fazla) Amino ucu Karboksil ucu 4 lü oligopepetid Amino asitler: Peptid bağ oluşumu Protein peptid bağı ve ɑ-karbon atomundaki yan gruplardan oluşuyor Peptid bağı hep aynı olduğuna göre bu tekdüze (homojen) zincirdeki tek değişken yer, R yada yan gruplar Amino asitler: Peptid bağ oluşumu 1 2 3 4 -İlk amino asit? 22 21 Peptidler: net yük -Bu peptidin net yükü nedir? Peptidler: net yük -polipeptid’ün yükü? -Hangi pH da? -pH 5 deki net yükü nedir? Amino asitler: Peptid bağ oluşumu -pH 5 de ~ net +2 yüklüdür - + - + + +  Proteinin aminoasit içeriğinin belirlenmesi Proteinin hangi amino asitlerden oluştuğunu nasıl anlarız?  Proteinin aminoasit içeriğinin belirlenmesi Proteini saflaştır, ortamda tek bir çeşit protein olması lazım Amino asit içeriğini belirlemek için peptid bağlarının kırılması ve aminoasitlerin tek tek ayrılması gerekli Normal olarak asitle peptid bağları kırılabilir. Protein----6 M HCl---Amino asitler Ortamdaki aminoasitler kormotoğrafik olarak hem birbirlerinden ayrıştırılır hem de oranları belirlenir Amino asit analizi  Proteinin aminoasit içeriğinin belirlenmesi Amino asit analizi 1. Parçalanmış protein 2. fenilizotiosiyanat (phenylisothiocyanate)(PITC) pH 9.0 muamele edilirse feniltiokarbomil (PTC)–amino asit türevi oluşur 3. Bu amino asit türevleri HPLC de kısa zincirli hidrokarbon bağlanmış silika kolonunda ayrıştırılır, hidrofobikliklerine göre kolonda birbirlerinden ayrıştırılır 4. Kolondan çıkan amino asit türevlerinin kons. göre sinyal üretilir, UV detektörü ile 254 nm dalga boyunda sinyaller grafik (peak) olarak zaman karşı elde edilir. 5. Her bir amino asit farklı zamanlarda geleceğinden birbirlerinden farklı pikler (farklı amino asitler) ve amino asit konsantrasyonuna göre pik alanı (veya yüksekliği) belirir. 6. Kolondan bilinen amino asit türevlerinin geldiği zaman ve verilen konsantrasyona göre ürettiği grafik alanından yararlanılarak, bilinmeyen amino asitlerin neler olduğu ve konsantrasyonları belirlenir. Peptid bağlarının kırılması: Hidroliz 110°C, 16 - 72 saat Amino asit türevlendirmesi: PTC Fenilizotiyosiyonat Amino asit fenyltiyokarbamil–amino asit HPLC Kolonu ayrışması  hidrofobik Asp+Asn Glu+Gln Proteinin aminoasit içeriğinin belirlendi ! Ya diziliş sırası? Bunu nasıl belirlerim ?  Proteindeki amino asit diziliş sırasının belirlenmesi 1950 Pehr Edman bir teknik geliştirdi Proteini Fenilizotiyosiyonat (PITC) kullanarak amino grubundan tek tek kırarak belirledi Burada PITC ile sadece amino ucu tepkimeye girmektedir Feniltiokarbamil-peptid türevi oluşmaktadır. Bu madde anhidroz bir asitle muamele edildiğinde (örnek olarak trifluoroasetik asit) amino ucundan kırılmaktadır. Anilinotiazolinon türevi oluşmaktadır. Bu madde ekstrakte edilirek (butil klorit ile) geri kalan peptidten ayrılır ve be olduğu belirlenir. Edman amino asit dizilişi belirleme tekniği Edman amino asit dizilişi belirleme tekniği H+  Edman amino asit dizilişi belirleme tekniği Geri kalan peptid zinciri tekrar aynı işlemlere tabi tutuluyor.. Edman parçalanması ile protein dizilişinin belirlenmesi 1. 2. 3. … Disülfit bağları kırılınca ne olur? Kır zincirlerini…  Protein dizilişini belirleme: Edman parçalanması Protein zincirindeki disülfit bağlantıları tiol içeren moleküllerle kırılabilir. 2-merkaptoetanol en sıklıkla kullanılır Sisteinler oksijen varlığında tekrar oksitlenerek –S-S- bağı oluşturmasın diye kapatılmalıdır. Alkilleme: Ör iodoasetat ile S-karboksimetilsistein lere dönüştürülür Edman parçalanması yolu ile çok pikomol düzeyindeki proteinlerin bile amino asit dizilişleri belirlenebilir. Ancak zincir uzadıkça işler karışmaya başlayabilir Diziliş sırasını belirlemede Edman yöntemine nasıl yardımcı olabiliriz? Proteazlarla büyük protein molekülü küçük peptidlere ayrılabilir proteaz  Protein dizilişini belirleme: Proteaz parçalaması Proteinleri parçalayan enzimlerle proteinleri küçültebiliriz. Proteazlar proteindeki peptid bağlarını parçalar Çeşitli proteazlar proteini farklı noktalardan keserler Bu parçacıklar tek tek Edman parçalanması ile amino asit dizilişleri belirlenir. Sonra tüm protein parçaları bir araya getirilir Tripsin, lys ve arginine yan grupları arasından proteini kırar Staphylococcus aureus V8 proteazı Glu ve Asp yan gruplarının yanından keser Kimotripsin, aromatik veya hidrofobik yan grupların yanından keser (Phe, Tyr, Trp gibi) Protein dizilişini belirleme: Proteaz parçalaması Protein dizilişini belirleme: başka nasıl bir yol olabilir? DNA---Protein  DNA--Protein Doğrudan protein zincirinin belirlenmesine ek olarak Dolaylı olarak DNA veya Gen dizilişinden protein zinciri çıkarılabilir Ör: Triptofan aminoasidi yeri ve miktarı doğrudan bulunabilir Yine Asp ve Asn yerleri belirlenebilir Nasıl? Tek bir kodonla belirleniyor. Diğer aminoasitler birden fazla kodonla belirlenebildiğinden olasılıklar söz konusu oluyor Sonradan değiştirilen amino asitler belirlenemiyor Veya zincirin bir kısmı sonradan kesilerek uzaklaştırılmış ise gen de yararlanarak protein zinciri sadece ham olarak belirlenebiliyor Frederick Sanger 1953 Frederick Sanger bir proteinin (insulin) protein dizilişini bulduğu için 1956 da Nobel Ödülünü aldı 1980 Yılında DNA’nın zincir sıralamasını belirleme yöntemi geliştirdiği için 2. Nobel ödülünü aldı. Frederick Sanger (1918– )  Proteinler Bugün… Binlercesinin dizilişi belirlendi, Binlercesinin 3 boyutlu biçimsel mimarisi belirlendi, Veri tabanı oluşturuldu, Protein Data Bank Protein dizilişini belirlemek Neler sağlar?  Protein dizilişi Aynı protein bir çok canlıda belirlendi Bunlar birbiriyle kıyaslandığında Bunların tarihsel akrabalıkları ortaya çıktı Protein zincir benzerliğinden yola çıkarak türler birbiriyle ilişkilendirildi Daha sonra yaşamın ağacı oluşturuldu.. Farklılıklardan yararlanarak ne tür özellikler kazanıldığı veya kaybedildiği belirlendi Sitokrom c Filogenetik ağacı (Evrim Ağacı): Schwartz, R. M., and Dayhoff, M. O. (1978). Origins of prokaryotes, eukaryotes, mitochondria, and chloroplasts. Science  Standart amino asitlerin kimyasal tepkimeleri Amino asitlerin amino grupları ile verdikleri tepkimeler Amino asitlerin karboksil grupları ile verdikleri tepkimeler Amino asitlerin amino ve karboksil gruplarının birlikte verdikleri tepkimeler Amino asitlerin R grupları ile verdikleri tepkimeler (renk tepkimeleri) Amino asitlerin tüm gruplarının katılımı ile verdikleri tepkime 41 Amino asitlerin amino grupları ile verdikleri tepkimeler: Asitamid (peptit) oluşumu Metillenme ile betainlerin oluşumu Sanger tepkimesi Van Slyke reaksiyonu Sörensen titrasyonu Aldehitlerle Schiff bazı oluşması Deaminasyon ile -keto asitlerin oluşması 42 Bir amino asidin NH2 grubu ile bir başka amino asidin COOH grubu arasından su çıkışıyla iki amino asit arasında peptit bağı oluşur ve böylece peptitler meydana gelir. 43 Amino asitler zwitterion durumunda iken, NH3 grubundaki 3 hidrojenin yerine CH3 grupları geçerek betainler oluşur. Lipotropik maddeler, betain, metiyonin, kolin, inositol gibi karaciğerde yağlanmayı önleyici maddelere denir. Kolin, serinin dekarboksilasyon ve metilasyonu sonucu oluşur. Kadaverin; ölüm sonrası lizinin karboksilasyonu ile oluşur. 44 Amino asitlerin amino grupları, 1-fluoro-2,4- dinitrobenzen ile açık sarı bir bileşik olan 2,4- dinitrofenilamino asit oluşturur. Bu tepkime Sanger tepkimesi olarak bilinir. 45 Amino asitler, nitröz asitle reaksiyona girerek azot gazı açığa çıkmasına neden olurlar. Bu tepkime Van Slyke reaksiyonu olarak bilinir. 46 Amino asitler, nötral veya hafif alkalik çözeltilerde formaldehit ile reaksiyona girerek mono- veya dimetilol türevleri meydana getirirler. Bu tepkime Sörensen titrasyonu olarak bilinir. 47 Amino asitlerin aldehitlerle reaksiyonu sonucunda Schiff bazı (N=CH) oluşur. 48 Amino asitlerin deaminasyon ile -keto asitler oluşur. 49 Amino asitlerin karboksil grupları ile verdikleri tepkimeler: Asitamid (peptit) oluşturma Tuz oluşturma Amid oluşturma Ester oluşturma Dekarboksilasyon 50 Amino asitlerin karboksil grubundan karbondioksit çıkmasıyla biyojen aminler oluşur. Histidinden histamin, Lizinden kadaverin, Ornitinden putressin, Tirozinden tiramin, Triptofandan triptamin oluşumu önemlidir. 51 Amino asitlerin amino ve karboksil gruplarının birlikte verdikleri tepkimeler: Ninhidrin tepkimesi Cu2+, Ni2+, Co2+ gibi ağır metal katyonlarıyla kompleks tuzlar oluşması Diketopiperazin türevleri ve polimerler oluşması 52 Ninhidrin çözeltisi ile kaynatılan bir -amino asit, mavi- menekşe renkli bir kompleks verir. 53 Amino asitlerin R grupları ile verdikleri tepkimeler (renk tepkimeleri): Ksantoprotein tepkimesi aromatik halka Millon tepkimesi fenil Pauly tepkimesi fenil veya imidazol Nitroprussiyat tepkimesi sülfhidril Ehrlich tepkimesi indol Kurşun sülfür oluşumu tepkimesi tiyol (SH) veya disülfit (SS) 54 Ksantoprotein tepkimesi: Yapısında aromatik halka bulunan fenilalanin ve triptofan gibi amino asitler için karakteristiktir. Böyle bir amino asit veya protein çözeltisi üzerine konsantre nitrik asit ilave edildiğinde önce, ısıtılırsa sarı bir renk meydana gelir. Daha sonra alkali ilave edilmesi halinde sarı renk koyu portakal sarısı veya turuncu diyebileceğimiz renge dönüşür. 55 Millon tepkimesi: Yapısında fenil grubu bulunan fenilalanin ve tirozin gibi amino asitler, eser miktarda nitröz asit içeren nitrik asitte çözülmüş cıva nitrat ile ısıtmakla kırmızı renk verirler. Pauly tepkimesi: Yapısında fenil ya da imidazol grubu bulunan fenilalanin, tirozin, histidin gibi amino asitler, alkali ortamlarda sulfanilik asit ve sodyum nitrit karışımı ile tepkimeye girerlerse kırmızı renk verirler. 56 Nitroprussiyat tepkimesi: Yapısında serbest sülfhidril grubu bulunan sistein gibi amino asitler, seyreltik amonyum hidroksitte çözülmüş sodyum nitroprussiyat ile kırmızı renk verirler. Ehrlich tepkimesi: Yapısında indol grubu bulunan triptofan gibi amino asitler, sülfürik asitte çözülmüş p- dimetilaminobenzaldehit ile reaksiyona sokulursa kırmızımsı pembe bir renk oluşur. 57 Kurşun sülfür oluşumu tepkimesi: Yapısında tiyol (SH) veya disülfit (SS) grubu bulunan amino asitler NaOH ile kaynatıldığında H2S veya Na2S oluşur; ortama kurşun asetat çözeltisi ilave edildiğinde siyah renkli PbS çöker. 58 Amino asitlerin tüm gruplarının katılımı ile verdikleri tepkime: Amino asitlerin amino grupları, karboksil grupları ve varsa SH grupları, Cu2+, Co2+, Mn2+, Fe2+ gibi birçok ağır metal iyonlarıyla kompleks kelatlar (şelatlar) oluştururlar. 59 Amino asitleri tanımlama deneyleri Amino asitlerin amino grupları ile verdikleri reaksiyonlara dayanan tanımlama deneyleri: Van Slyke deneyi: Nitröz asitle azot gazı çıkışı Amino asitlerin amino ve karboksil gruplarının birlikte verdikleri reaksiyonlara dayanan tanımlama deneyleri: Ninhidrin deneyi: Ninhidrin ile mavi-menekşe renk Amino asitlerin renk reaksiyonlarına dayanan tanımlama deneyleri: Ksantoprotein deneyi: Konsantre nitrik asit ile ısıtma sonucu fenil halkasıyla sarı renk 60  Nonstandart amino asitler Nonstandart amino asitler, bir standart amino asit bir protein yapısına girdikten sonra bir değişim reaksiyonu sonucu türemiş amino asitlerdir. 4-Hidroksiprolin 5-Hidroksilizin 6-N-metillizin -karboksi glutamat Desmozin Selenosistein 61 4-Hidroksiprolin: Prolin türevidir. Bitki hücre duvarı proteinlerinde ve bağ dokusunun fibröz proteini olan kollajende bulunur. 5-Hidroksilizin: Lizin türevidir. Kollajenin yapısında bulunur. 62 6-N-metillizin: Lizin türevidir. kasların kontraktil proteini olan miyozinde bulunur. -karboksi glutamat: Glutamat türevidir. Pıhtılaşma faktörü protein olan protrombinde (Faktör II) ve Ca2+ bağlayan diğer belli proteinlerde bulunur. 63 Desmozin: Dört lizin kalıntısı içerir. fibröz protein olan elastinde bulunur. Selenosistein: Serinin oksijenden daha çok selenyum içeren türevidir. Glutatyon peroksidaz enziminde ve diğer birçok proteinde bulunur. 64 Proteinlerin yapısında bulunmayan amino asitler: -amino asitler: Ornitin Sitrülin Arjinino süksinik asit Homosistein Homoserin Sistein sülfinik asit Dihidroksifenilalanin (DOPA) 5-Hidroksi triptofan Amino grubu -karbonda olmayan amino asitler: -alanin H3N+-CH2-CH2-COO- -aminobutirik asit (GABA) Taurin -aminoizobutirik asit 65  Peptitler Peptitler, amino asitlerin polimerleridirler. Kuramsal olarak, bir amino asidin -karboksil grubunun OH’i ile diğer amino asidin -amino grubu arasından su ayrılarak peptit bağı oluşur. 66 Peptit bağlarındaki rezonans veya mezomeri nedeniyle OC N bağı %50 çift bağ niteliği kazanmıştır. Çift bağların eksen etrafında dönmeleri sınırlı olduğundan, peptit bağı oluşumuna katılan grupların atomları (3C, O, N ve H atomları) bir düzlemde bulunurlar. Peptit bağı, rijit ve düzlemseldir. 67 İki amino asitten dipeptit, Üç amino asitten tripeptit,… 10’a kadar olan amino asitten oligopeptit, daha çok amino asitten ise polipeptit meydana gelir. Proteinler, yüzlerce amino asitten oluşan polipeptitlerdir. 68 Bir peptitteki amino asit üniteleri, sıklıkla amino asit kalıntıları olarak adlandırılırlar. 69 Peptidin bir ucunda serbest -amino grubuna sahip amino asit kalıntısı bulunur ki bu uca amino-terminal uç veya N- terminal uç denir. Peptidin diğer ucunda ise serbest - karboksil grubuna sahip amino asit kalıntısı bulunur ki bu uca da karboksil-terminal uç veya C-terminal uç denir. 70 Alışkanlık olarak kısa peptitler, N-terminal kalıntı solda ve C-terminal kalıntı sağda olmak üzere, dizideki amino asitler soldan sağa doğru belirtilerek isimlendirilirler. Ancak, en sağdakinden önceki amino asitlerin ismindeki “en” soneki, “il” soneki ile değiştirilir. 71 Fizyolojik etkiye sahip dipeptitler: Karnozin, -alanil histidin yapısındadır Anserin (metil karnozin), -alanil-N'-metil histidin yapısındadır Aspartam (Nutrasweet), L-aspartil-L-fenilalanil metil ester yapısındadır. Yapay tatlandırıcı olarak kullanılır. 72 Fizyolojik etkiye sahip tripeptitler: Glutatyon (GSH; GSSG), -glutamil sisteinil glisin yapısındadır Tirotropin salıverici faktör, piroglutamil histidil prolinamid yapısındadır 73 Fizyolojik etkiye sahip pentapeptitler: Ağrı sezilmesinde etkili beyin peptitleridirler. Metiyonin enkefalin, (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) yapısındadır Lösin enkefalin, (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) yapısındadır 74 Fizyolojik etkiye sahip oktapeptitler: Dinorfinler: Hipotalamusta oluşturulurlar, morfin benzeri aktiviteleri vardır, iştahın düzenlenmesinde rol oynarlar. 75 Fizyolojik etkiye sahip nonapeptitler: Oksitosin ve vazopressin (antidiüretik hormon, ADH), hipotalamusta sentezlenirler, aksonlar boyunca hipofizin arka lobuna taşınır ve burada depolanırlar. Bradikinin, hormon benzeri etkileri olan bir peptitdir; inflamatuvar reaksiyonları inhibe eder. 76 Fizyolojik etkiye sahip dekapeptitler: Kallidin, lizil bradikinin yapısındadır; kinin aktivitesi gösterir; böbrekte oluşur ve böbrek fonksiyonlarını etkiler. Gramicidin S, sirküler yapıda ve 2 D-fenilalanin kalıntısı içeren bir peptitdir. 77