Quantification des paramètres pharmacodynamiques - PDF

CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR INTRODUCTION Dans l'organisme, le médicament (ligand exogène) interagit préférentiellement avec un récepteur en se fixant sur lui, et en formant donc une liaison ligand-récepteur. Une telle interaction génère ensuite u...

CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR INTRODUCTION Dans l'organisme, le médicament (ligand exogène) interagit préférentiellement avec un récepteur en se fixant sur lui, et en formant donc une liaison ligand-récepteur. Une telle interaction génère ensuite un effet pharmacologique (dont l’intensité est liée à la dose administrée). Ainsi, l’étude de l’interaction entre un ligand et son récepteur comporte deux aspects essentiels : - l’étude des caractéristiques de la liaison ligand - récepteur, - l’étude de la relation dose - effet (ou concentration - effet). 1. CARACTERISTIQUES DE LA LIAISON LIGAND-RECEPTEUR ; THEORIE DE L’OCCUPATION DES RECEPTEURS 1. Caractéristiques de la liaison ligand récepteur Un ligand, lorsqu’il se fixe sur un récepteur, peut l’activer ou au contraire le bloquer. Lorsqu’il se fixe en le stimulant, on parle d’agoniste, lorsqu’il le bloque, on parle d’antagoniste. La liaison du ligand avec le récepteur est une liaison : - spécifique : qui déclenche un effet biologique ou au contraire bloque cet effet, - saturable : car limitée par le nombre des récepteurs sur lesquels le ligand peut se fixer, - réversible : le ligand s'associe à son récepteur, puis s'en sépare après un certain temps. Sur le plan pratique, l’étude des caractéristiques de la liaison ligand récepteur consiste enfin à déterminer l’affinité du ligand pour son récepteur (capacité d’un ligand à se fixer sur le récepteur). Cette affinité est reflétée par l’inverse de la constante de dissociation à l’équilibre (affinité = 1 / Kd), déterminée dans le cadre de la théorie de l’occupation des récepteurs. Cette dernière considère que l’intensité de l’effet d’un ligand est proportionnelle au pourcentage de récepteurs occupés. 2.Détermination de l’affinité d’un ligand pour son récepteur dans le cadre de la théorie de l’occupation des récepteurs Soit l’équilibre de fixation d’un ligand (médicament) sur son récepteur : L + R Affinité LR Effet pharmacologique kkda 1  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND-RECEPTEUR ka : constante cinétique d’association en L. mol-1. mn-1 kd : constante cinétique de dissociation en min-1 [L] : concentration de ligand (médicament) libre en mol. L-1 [R] : concentration de récepteur libre en mol. L-1 [LR] : concentration de récepteur occupé (ou concentration de complexe - ligand-récepteur) en mol:. L-1. la vitesse d’association va = ka. [L]. [R] On définit alors : - la vitesse de vd = kd. [LR] dissociation : ka. [L]. [R] = kd. [LR] A l’équilibre les deux vitesses sont égales : On définit alors : [LR] ka - la constante d’association à l’équilibre : = (L. mol -1) Ka = [L]. [R] kd 1 kd [L]. - la constante de dissociation à l’équilibre : [R] (mol. L-1) Kd = = = Ka ka [LR] Lorsque 50% des récepteurs sont occupées [LR] = [R], d’où Kd = [L50%] Kd représente donc la concentration de ligand nécessaire à l’occupation de 50% des récepteurs En résumé, les conclusions à tirer dans le cadre de la théorie de l’occupation des récepteurs sont :  Kd caractérise la liaison ligand-récepteur ; elle représente la constante de dissociation à l’équilibre,  Elle dépend de la température et de la nature chimique des substances en interaction,  Elle caractérise l'affinité d’un médicament pour son récepteur. Plus Kd est faible, plus l'affinité (1 / Kd) est élevée et plus l’effet pharmacologique du médicament est important,  La mesure de l’affinité (à travers l’évaluation de Kd) revêt une importance cruciale en préclinique pour le choix des médicaments à développer, 2  Kd représente la concentration du médicament nécessaire à l’occupation de la moitié (50%) des récepteurs.  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR 2. QUANTIFICATION DE L'EFFET PHARMACODYNAMIQUE D’UN MEDICAMENT ; COURBE CONCENTRATION EFFET (OU DOSE EFFET) 1. Courbe dose effet Afin d'optimiser la démarche thérapeutique, la prescription du médicament doit s'effectuer avec une connaissance parfaite de la relation entre la dose de médicament administrée et l’effet pharmacologique engendré, cet effet étant, selon la théorie de l’occupation, proportionnel au pourcentage de récepteurs occupés ([LR] / [Rt]). Pour cela, une courbe dose effet est préalablement tracée, et qui traduit l’évolution du pourcentage de récepteurs occupés par le ligand (effet pharmacologique) en fonction de la dose (concentration) du médicament [LR] / [Rt] = f ([L]).  Expression mathématique liant l’effet pharmacologique d’un médicament à la dose administrée : - Dans le cadre de la théorie de l’occupation, étudier l’évolution du % de récepteurs occupés en fonction de la dose de médicament revient à étudier l’effet du médicament en fonction de sa dose administrée. - Par ailleurs, si on considère que [LR] + [R] = [Rt] = constante (nombre de récepteurs limite) : [LR]occupés % de récepteurs + 1[LR] 1 par le ligand (effet = [LR] = [Rt] pharmacologique) [R] + [LR] [R] → : [L]. [R] [R] Kd Or Kd = ----------- -------- = ------ [LR] [LR] [L] [LR] 1 [LR] [L] Donc = et = (A) [Rt] Kd [Rt] Kd + [L] + 1 [L] Dans l’expression (A) : 3  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND-RECEPTEUR - Kd est évaluée expérimentalement (dans le cadre de la technique du binding, par deux méthodes expérimentales : la méthode de saturation et la méthode de déplacement), - [L] est connue on peut donc, pour chaque valeur de [L], calculer le pourcentage de récepteurs occupés correspondant (intensité de l’effet pharmacologique du médicament). Si la dose de ligand est exprimée en concentration ([L]), la courbe dose effet est une hyperbole. Elle peut être transformée en courbe sigmoïde si la dose est exprimée en échelle logarithmique (log[L]) (courbe sigmoïde la plus fréquemment utilisée) (figure 1). Intensité de Intensité de l’effet (%) l’effet (%) t ([LR]/ ([LR]/[Rt]) [R ]) 100% Emax Emax des R occupé s 50% A B [L DE50 = Log DE50 = ] [L] Kd Kd Figure 1 : Intensité de l’effet d’un médicament ([LR] / [Rt ]) en fonction de la dose administrée ([L]) (Courbe hyperbolique (A) et courbe sigmoïde (B)) Remarques : - Intensité de l’effet d’un médicament ([LR] / [Rt]) = % de récepteurs occupés par le ligand. - Grâce à la relation (A), nous pouvons représenter l’intensité de l’effet d’un médicament ([LR] / [Rt ]) en fonction de sa dose (ou concentration) ([L]). - La courbe sigmoïde permet aux médecins de connaitre la dose qui doit être dépassée afin d’avoir une guérison et celle à ne pas dépasser afin d’éviter des effets indésirables sur l’organisme : elle montre, en effet, que jusqu’à une certaine dose, 4  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR aucun effet n’apparaît (AB). L’effet augmente ensuite avec la dose (BD), jusqu’à atteindre sa valeur maximale (plateau E). - Le plateau représente l'effet maximum (Emax) pouvant être obtenu. - La dose qui donne 50% de l’effet maximum s’appelle dose efficace 50 (DE50). DE50 représente aussi la valeur de Kd (constante de dissociation du complexe médicament – récepteur). De la courbe sigmoïde, nous pouvons déduire les paramètres suivants caractérisant un médicament :  Activité : pente de la partie médiane de la courbe sigmoïde assimilée à une droite.  Puissance (ou affinité envers le récepteur) : caractérisée par l’inverse de la valeur de la dose efficace 50 (affinité = 1 / DE50 = 1 / Kd) : un médicament est d’autant plus puissant (son affinité est d’autant plus grande envers le récepteur) que sa DE50 est faible et donc sa courbe déplacée vers la gauche.  Efficacité : caractérisée par la hauteur du plateau Emax (effet maximum induit par le médicament) : un médicament est d’autant plus efficace que son effet maximal (Emax) est élevé. II.2.2. Différents types de courbes dose effet ; comparaison entre activités, affinités et efficacités des agonistes : Selon la nature des principes actifs, on obtient différents types de courbes dose effet. La figure 2 représente les courbes de trois médicaments différents A, B et C : Figure 2 : Relation concentration - effets 5  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND-RECEPTEUR  Comparaison - Activitéentre : A =ABet(même B : pente), - Puissance (Affinités envers le récepteur) : A > B (DE50 de A plus faible ; courbe de A plus déplacée vers la gauche), - Efficacité : A = B (Emax identiques).  Comparaison entre A et C : - Activité : A > C (pente de A plus forte), - Puissance : A = C (DE50 identiques), - Efficacité : A > C (Emax de A plus fort).  Comparaison entre B et C : - Activité : B > C (pente de B plus forte), - Puissance : C > B (DE50 de C plus faible), - Efficacité : B > C (Emax de B plus fort). II.2.3. Effets multiples d’un même médicament : Assez souvent, la même molécule possède, à côté de son effet principal, des effets secondaires souvent indésirables. Par exemple, les antihistaminiques H1 de première génération (Polaramine ; Atarax ; Primalan ;…) peuvent être sédatifs 1 ou atropiniques 2 ; les antidépresseurs 3 tricycliques (Laroxyl ; Anafranil ; Amitriptyline ;…) sont souvent atropiniques. Lorsque le même médicament a deux ou plusieurs effets différents, ceux-ci peuvent être obtenus à des concentrations tissulaires proches ou différentes (figure 3) : 1 Sédatif : Qui entraîne un apaisement, une relaxation, une réduction de l'anxiété, une somnolence, un ralentissement de la respiration et une diminution des réflexes. 2 Effet Atropinique : Effet d’une substance qui provoque une irritabilité, une sécheresse de la bouche, une constipation, des nausées,… 3 Antidépresseurs : Médicaments psychotropes utilisés contre la dépression. 6  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND-RECEPTEUR Figure 3 : Effets multiples d’un même médicament - Si un médicament a un effet bénéfique E1 et un effet indésirable E2, tout effet bénéfique sera obligatoirement accompagné de l’effet indésirable, car l’un et l’autre sont obtenus à des concentrations presque identiques. C’est le cas de la plupart des anticancéreux (qui induisent une diminution de l’immunité, une fatigue, une perte de cheveux,…) et, faute de mieux, on accepte le compromis. - Si un médicament a, en plus de son effet bénéfique E1 un effet indésirable E3, l’effet bénéfique ne doit pas être accompagné de l’effet indésirable, car celui-ci n’apparaît qu’à doses très élevées. C’est par exemple le cas du paracétamol qui ne donne une atteinte hépatique grave qu’à des doses conduisant à des concentrations très supérieures à celles que l’on observe lorsqu’il est pris à posologie normale. II.2.5. Relation entre occupation des récepteurs et réponse pharmacologique ; relation d’Ariëns : En 1954, Everhardus Ariëns s’est inspiré de la relation (A) précédente, pour établir une nouvelle équation plus générale (équation (B)), dans laquelle il a introduit la notion d’activité intrinsèque ( 𝜶 ) du médicament. En effet, la relation (A) précédente s’était avérée incomplète car elle ne tient compte que de l’effet des médicaments agonistes et n’explique nullement la notion d’antagonisme. Réponse = 𝜶 (Réponse)max [L] Relation de E. Ariëns : (B) Kd + [L] 𝜶 : Paramètre d’activité Réponse : Intensité de l’effet du médicament 7  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR En tenant compte du paramètre d’activité intrinsèque (𝜶), 3 types de ligands sont alors définis (figure 4) :  Un agoniste entier (𝜶 = 1) peut induire une réponse maximale par une occupation d’un nombre limité de récepteurs, les récepteurs qui ne sont pas nécessaires et que l’on peut détruire sans perdre l’effet maximum sont appelés récepteurs de réserve.  Un agoniste partiel (0 < 𝜶 < 1) peut induire une réponse proportionnelle au nombre de récepteurs occupés mais, même en occupant tous les récepteurs, il ne peut atteindre l’effet maximum atteignable par un agoniste entier. Pour un effet comparable un agoniste partiel doit occuper plus de récepteurs qu’un agoniste entier.  Un antagoniste (𝜶 = 0) : substance qui bloque le récepteur, en se fixant soit au niveau du site d’action du ligand endogène (antagoniste compétitif), soit au niveau d’un site différent (antagoniste non compétitif). Intensité de 𝛂 = 1 : agoniste l’effet Emax entier (0 < 𝛂 < 1) : agoniste partiel Agoniste entier (𝜶 = 1) 𝜶= Agoniste partiel (0 0< : antagoniste 𝜶 < 1) Antagoniste (𝜶 Log D = 0) Log D Figure 4 : Antagoniste, agoniste entier et agoniste partiel II.3. APPROCHE EXPERIMENTALE : DETERMINATION DE L’AFFINITE D’UN LIGAND POUR UN RECEPTEUR SPECIFIQUE ; TECHNIQUE DU BINDING (LIAISON DU LIGAND AU RECEPTEUR) Sur le plan pratique, l’étude de l’interaction entre le ligand et son récepteur consiste à déterminer l’affinité (capacité de fixation) du ligand pour le récepteur, cette affinité étant déterminée à travers l’évaluation de la constante de dissociation Kd (affinité = 1 / Kd). 8  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR La constante Kd est elle-même déterminée, dans le cadre de la technique du binding, par deux méthodes expérimentales : la méthode de saturation et la méthode de déplacement, toutes deux basées sur le fait que la fixation du ligand à son récepteur suit la loi d’action de masse. 1. Méthode de saturation : La méthode de saturation est une méthode expérimentale qui permet de déterminer l’affinité du médicament pour son récepteur, à travers la quantification de 2 paramètres de liaison :  Kd : constante de dissociation à l'équilibre de la liaison médicament – récepteur (mais aussi concentration de ligand nécessaire à l'occupation de 50% des récepteurs),  [Rt] = Bmax : concentration totale en récepteurs. a) Courbe de saturation : Expérimentalement, la méthode de saturation consiste à préparer une série d’échantillons contenant une même préparation membranaire (même quantité de récepteurs à étudier, [Rt]), auxquels on additionne des concentrations croissantes d’un ligand radio-marqué ([L*] connus (3H et 14C sont les isotopes radioactifs les plus utilisés pour le radio-marquage des ligands). Après incubation (dans des conditions précises de temps, de pH et de température), on sépare par centrifugation ou par filtration, dans chaque échantillon, les radio-ligands libres L* de ceux qui se sont fixés sur les récepteurs L*R. On mesure alors, pour chaque concentration de ligand radio-marqué utilisée ([L*]), la concentration de récepteurs occupés correspondante ([L*R]) (à travers la mesure de la radioactivité de la membrane correspondante), et on établit la courbe [L*R] = f ([L*]) dite courbe de saturation. Considérons l’expression (A) préalablement établie, et remplaçons L par L* (car il s’agit ici [L*R] [L*] [Rt]. [L*] de ligand radio-marqué) = : [L*R] = Equation de Michaelis [Rt] Kd + [L*] Kd + [L*] ([L*R] / [Rt] : % de récepteurs occupés par le ligand radio-marqué, L*) [L*] : concentration de radio-ligands libres (non fixés au récepteur) [R] : concentration de récepteurs libres (non occupés par le ligand) Avec, à l’équilibre : [L*R] : concentration de radio-ligands liés de manière spécifique sur le récepteur [Rt] = Bmax = [R] + [L*R] : concentration totale de récepteurs 9  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR Graphiquement, On trace [L*R] = f (L*) (figure 5). La courbe est croissante, puis se stabilise lorsqu’on a saturé tous les sites du récepteur par le ligand radio-marqué. On atteint alors le Bmax = [Rt], c'est à dire 100% des récepteurs occupés par le ligand, d’où la valeur graphique de [Rt] (concentration totale en sites de liaison existant sur le récepteur). On détermine alors l'affinité du ligand pour le récepteur à travers la valeur graphique de Kd (Kd = [Rt] / 2 ou Bmax / 2). Remarques : - A saturation : [L*] >> Kd → [L*R] ≈ [Rt] = Bmax (plateau de la courbe) - A demi-saturation (50% de récepteurs occupées par le ligand) : [L*R] = [Rt] / 2 [L→*R]2. [Rt]. [L*] = [Rt]. Kd + [Rt]. [L*] → [L*] = Kd (Kd : concentration du médicament nécessaire à l’occupation de la moitié (50%) des récepteurs) Bmax = [Rt] [L R] Courbe * de saturation (détermination (100% des gra récepteurs occupés par le ligand) 50% Kd [L* ] [L*] de Kd) Figure 5 : Courbe de saturation (détermination graphique Cette représentation graphique est de nature hyperbolique, elle ne permet pas une détermination précise des valeurs de Kd et de Bmax, tandis que la représentation linéaire est plus précise, c'est ce qu'on appelle la représentation lineaire de Scatchard ou Kd et Bmax sont plus précis. b) Courbe de Scatchard (linéarisation de la courbe de saturation) : De l’équilibre de fixation du ligand marqué sur son récepteur on tire : [L*R] Ka = [L*]. [R] [L*R] Donc : = Ka. [R] = Ka. ([Rt] - [L*R]) [L ] * 1 0  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND-RECEPTEUR D’où [L*R] = Ka. [Rt] - Ka. [L*R] [L*] En remplaçant Ka par 1/ Kd on obtient : [L*R] [L*R] [Rt] = Equation de Scatchard [L ]* Kd Kd Le tracé de [L*R] / [L*] = f ([L*R]) permet d’obtenir une droite de pente négative (figure 6) : [L*R] / [L*] = B / F (Bound / Free) Bmax / Kd Pente = -1 / Kd Bmax [L*R] = B Figure 6 : Représentation selon Scatchard : B / F = f (B) Avec : - L'axe des x représente la liaison spécifique B (Bound) - L'axe des y représente la liaison spécifique divisée par la concentration en ligand libre (B/F) (F : Free)  La représentation est linéaire et donc plus facile à interpréter,  La pente correspond à (- 1 / Kd),  L’intersection avec l’axe des abscisses indique [Rt] = Bmax,  L’intersection avec l’axe des ordonnées indique Bmax / Kd. Remarque : Une courbe de Scatchard linéaire indique la liaison du ligand à un seul récepteur avec linéaire,dec'est respect qu'il la loi y a plusieurs d'action de masse,sites de liaisons. ce qui permet de calculer un seul Kd. Si la courbe n'est pas 1 1  CHAP. II : DONNEES THEORIQUES SUR LA LIAISON LIGAND- RECEPTEUR II.3.2. Méthode de déplacement : Les expériences de déplacement (ou de compétition) permettent de déterminer l’affinité d’un ligand non radioactif. Le principe de la méthode consiste en la mesure de la liaison spécifique à l'équilibre, d'une concentration donnée (en général égale au Kd ) en ligand radio-marqué en présence d'une concentration variable et croissante de ligand froid (par exemple : 10-12 à 10-5 M). Le ligand froid entre en compétition avec le ligand radioactif pour sa liaison au récepteur, c'est pourquoi on peut parler de compétition de la liaison à l'équilibre. Ce type d’expérience permet de déterminer le IC50 et la constante d’inhibition Ki (figure 7). Pour toute comparaison de molécules, il est préférable d’utiliser Ki qui permet de s’abstraire des conditions expérimentales, (IC50, Ki sont exprimées le plus souvent en nmol / l). IC50 = concentration de ligand non radioactif nécessaire pour déplacer 50% de la fixation totale du ligand radioactif. Plus le IC50 est faible plus l’affinité du ligand non radioactif est élevée.  IC50de radio-ligand ; KD : constante de dissociation du radio-ligand. faible, [L*] = concentration Plus Ki est Ki = plus l’affinité [L*] du ligand / KD non radioactif pour le récepteur est élevée. Liaison spécifique du radio-ligand (%) 50 IC50 - Log (Concentration de compétiteur froid) Figure 7 : Représentation de la liaison spécifique en fonction du log de la concentration en ligand compétiteur froid 1 2