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Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 1 UNIDAD 05 CONTROL GENÉTICO POSTRANSCRIPCIONAL. Martes 16 de abril Lecturas obligatorias previas al trabajo práctico. Alberts B y col. Biología Molecular de la célula. 6ª edición. Alberts B y col. Ed Omega (2016). Cap. 6. Cómo leen las célula...

Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 1 UNIDAD 05 CONTROL GENÉTICO POSTRANSCRIPCIONAL. Martes 16 de abril Lecturas obligatorias previas al trabajo práctico. Alberts B y col. Biología Molecular de la célula. 6ª edición. Alberts B y col. Ed Omega (2016). Cap. 6. Cómo leen las células el genoma: del DNA a la proteína; Cap. 7. Control de la expresión génica. Lodish H. y col. Biología Celular y Molecular, 7ª Edición. Editorial Médica Panamericana (2016). Cap. 10. Control génico post-transcripcional. Biología Celular Biomédica. Alfonso Calvo. Elsevier (2015). Capítulo 9. Síntesis y modificación de las proteínas. Objetivos 1. Explicar el procesamiento de los transcriptos primarios de los genes codificantes de proteínas 2. Describir las modificaciones postranscripcionales de los transcriptos primarios: formación del capuchón, colas de poliA, modificaciones de la secuencia determinadas por las distintas formas de recorte y empalme (“splicing”). 3. Describir los gránulos de ARN: cuerpos P, gránulos de estrés y sus funciones en el almacenamiento y degradación de los ARNs. 4. Analizar fenómenos celulares complejos regulados por ARNs pequeños (siRNAs y miRNAs). Contenidos Transcripción de las secuencias codificantes de proteínas: ARN polimerasa II y síntesis de los ARN mensajeros. Factores generales (o basales) de transcripción. Relación con las ARN polimerasas. Asociación entre proteínas reguladoras y secuencias que controlan la transcripción. Secuencias reguladoras en cis: proximales y distales. Mediator. Sitios de iniciación y de terminación. Procesamiento del ARNm. Maduración: capuchón 5’, poliadenilación 3’, recorte y empalme (“splicing”). Exones e intrones. Empalme de los exones. ARNs nucleares pequeños y su papel en el empalme. Empalme alternativo. Participación de pequeños ARNs nucleares y proteínas específicas. Complejos ARN-proteínas: transcripcionales: empalmosomas (o espliceosomas). Gránulos citoplasmáticos de ARN. Gránulos de estrés. Cuerpos P. Mecanismos de formación. Moléculas que contienen. Moléculas implicadas en el almacenamiento y/o degradación de ARNms. ARNs de interferencia. ARNs pequeños de interferencia o silenciamiento: siARNs y miARNs. Funciones de Dicer (ARNasa tipo III), complejo multiproteico RISC (RNA induced silencing complex), proteína Argonauta 2 (Ago2). Teórico. Factores de transcripción Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 2 Laboratorio Taller 1. Maduración de los ARNm Como se describió previamente para los transcriptos pre-ribosomales, los transcriptos primarios de los genes codificantes de proteínas también requieren varios pasos de procesamiento para transformarse en ARN mensajeros (ARNms) funcionales. La transcripción y el procesamiento del ARN están acoplados. La ARN polimerasa II recluta factores de procesamiento como el complejo de unión al capuchón 5’, los factores de recorte y pre-empalmosoma y el complejo de poliadenilación. En gran medida, el procesamiento del ARN ocurre en forma cotranscripcional.1 Los precursores del ARNm (pre-ARNms) también son conocidos como ARNs nucleares heterogéneos, una denominación histórica que describe su tamaño variable y su localización nuclear.2 El procesamiento del pre-ARNm incluye la formación del capuchón en el extremo 5´, la poliadenilación en la cola 3´ del transcripto y la remoción de los intrones por corte y empalme (splicing). Estas modificaciones ocurren de modo co-transcripcional. En el gráfico siguiente, que corresponde al ARNm de una proteína relativamente corta (beta-globina), el recorte y empalme comienza después de la poliadenilación. Para unidades de transcripción más largas, el recorte y empalme comienzan cuando la transcripción aún no se ha completado. 1 Luco RF, Allo M, Schor IE, Kornblihtt AR, Misteli T. Epigenetics in alternative pre-mRNA splicing. Cell. 2011;144(1):16-26. 2 Chaudhury A, Chander P, Howe PH. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) in cellular processes: Focus on hnRNP E1's multifunctional regulatory roles. RNA. 2010;16(8):1449-1462. doi:10.1261/rna.2254110 Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 3 3 En los eucariotas, los ARN siempre están unidos a proteínas. El pre-ARNm se une a proteínas del grupo de proteínas-que-se-unen-a-ARN, conocidas como proteínas hnRNP, que intervienen en el recorte y empalme, y en la exportación de los ARNs hacia el citoplasma. Formación del capuchón El capuchón metilado es una estructura que la RNAPII agrega al extremo 5’ de los ARNs transcriptos. Se trata de una guanosina metilada ubicada con la polaridad opuesta a la del ARN. Mientras todas las bases del ARN están unidas en forma 5’ a 3’, dicha guanosina se une 5’ a 5’. La unión de la 7-metil-guanosina (7mG) ocluye a los grupos fosfato libres que se encuentran en el extremo 5’ del transcripto primario. De ahí la denominación capuchón o caperuza. La estructura del capuchón es GpppX (donde X es el primer nucleótido transcripto). El transcripto primario tiene originalmente tres grupos fosfatos unidos al extremo 5’. Una enzima específica (capping enzyme), une una molécula de GTP al extremo 5’ del transcripto primario, utilizando un fosfato del GTP y 2 fosfatos del ARNm. A continuación, la enzima ARN guanino-7 metiltransferasa metila la guanosina en la posición 7, y a menudo, también una o dos de las siguientes bases. El capuchón, formado por 7-metilguanilato, queda unido en forma 5’ a 5’ con la primera base del ARN transcripto. 4 3 4 Lodish y col. Figura 9.2 Gilbert SF. http://The 5’ and 3’ ends. 9e.DevBio.com Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 4 El capuchón protege a los transcriptos de la degradación por exo-ribonucleasas, e interactúa con una serie de proteínas mediadoras de diversas funciones del capuchón. Entre ellas se cuentan el complejo-que-seune-al-capuchón (CBC) y el factor de iniciación de la traducción eIF4F. El CBC, formado por dos polipéptidos, es necesario para mantener un recorte y empalme eficientes. Además, facilita la poliadenilación del extremo 3’. CBC acompaña al transcripto a través del poro nuclear. 5 El factor de transcripción E2F1, una molécula esencial para la progresión del ciclo celular, promueve la expresión de diversos genes mediante su papel regulador de la formación del capuchón. 6 Poliadenilación El extremo 3’ de casi todos los ARNms eucarióticos, a excepción de los transcriptos de histonas dependientes de la duplicación del ADN, es modificado por una reacción en dos pasos que incluye: el clivaje endonucleolítico del pre-ARNm y la ulterior síntesis de una cola poliadenílica. Las enzimas y otras proteínas involucradas reconocen el sitio de poliadenilación canónico AAUAAA. La cola de poli(A) en el extremo 3’ resulta del agregado de una serie de bases de adenosina. La cola sirve como lugar de anclaje para una clase de factores reguladores conocidos como poly(A) binding proteins (PABP). En las células humanas se han identificado 5 PABPs diferentes (una nuclear y cuatro citoplasmáticas). Estas proteínas parecen actuar como andamios que permiten la unión con otros factores que intervienen en la regulación de la expresión génica. La cola de poli(A) se sintetiza con una longitud predeterminada (~250 bp en las células de mamífero), que luego puede ser acortada en el citoplasma. La mayor parte de los genes humanos poseen más de un sitio donde el extremo 3’ puede ser clivado y poliadenilado, permitiendo la expresión de distintas isoformas. 7 Sitios alternativos de poliadenilación que producen 2 ARNms con diferentes regiones 3’ no transcriptas (3’UTRs). La 3’UTR, río arriba del sitio de poliadenilación próxima se conoce como UTR constitutiva (cUTR), la mas distal es la UTR alternativa (aUTR). La presencia de una UTR mas larga permite nuevos mecanismos de regulación dependientes de RBPs, miRNAs y lncRNAs. CDS, secuencia codificante.8 5 6 Gonatopoulos-Pournatzis T, Cowling VH. Cap-binding complex (CBC). Biochem J. 2014;457(2):231-42. Aregger M, Cowling VH. E2F1-dependent methyl cap formation requires RNA RNAPII phosphorylation. Cell Cycle. 2012;11:2146-8. 7 Di Giammartino DC, Nishida K, Manley JL. Mechanisms and consequences of alternative polyadenylation. Mol Cell. 2011 Sep 16;43(6):853-66. doi: 10.1016/j.molcel.2011.08.017. PMID: 21925375; PMCID: PMC3194005. 8 Tian B, Manley JL. Alternative polyadenylation of mRNA precursors. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 Jan;18(1):18-30. doi: 10.1038/nrm.2016.116. Epub 2016 Sep 28. PMID: 27677860; PMCID: PMC5483950. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 5 Localización diferencial de las isoformas 3′ UTR-APA cortas y largas del ARNm del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) en las neuronas. La isoforma larga se localiza preferentemente en las dendritas, permitiendo la síntesis de BDNF en esta localización (Ref. anterior). Intrones y exones. Maduración por corte y empalme (Splicing) Existen diferencias en la secuencia de pre-ARNs y los ARNs maduros que codifican proteínas que pueden ser explicadas por la remoción de los intrones. Los intrones (intervening sequences) son elementos genéticos (secuencias de nucleótidos) que interrumpen a los genes codificantes de proteínas. Los segmentos del pre-ARN que forman parte del ARNm maduro se denominan exones. El tamaño medio de los exones es de 150 pb, mientras que el tamaño de los intrones es muy variable. Hay genes con muchos intrones y otros con muy pocos. Los genes de las histonas no poseen intrones. Existen distintos mecanismos de corte y empalme que corresponde a distintos tipos de intrones. Aquí solamente nos ocuparemos de los intrones de tipo III, que son los mas abundantes en los eucariontes metazoarios del reino animal, y que son recortados y unidos por los empalmosomas. Los empalmosomas (spliceosomes) son complejos ribonucleoproteicos formado por 5 ARNs pequeños (snRNAs, U1, U2, U4, U5 y U6) y más de 300 proteínas. Las ribonucleoproteínas del empalmosoma se denominan pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP o “snurps”). Los empalmosomas reconocen a las tres secuencias que definen a los intrones: el sitio 5’ de corte (5’SS), la secuencia de ramificación interna (BP) y el sitio de corte 3’(3’SS). Estas secuencias se encuentran altamente conservadas siendo 5′-ss una combinación de nucleótidos GU, el 3′-ss una secuencia de nucleótidos AG muy conservada y la BP ubicada entre 18 y 40 nucleótidos aguas arriba del 3′-ss. Aunque los snRNAs cumplen su función en el núcleo, son inicialmente exportados al citoplasma. Allí maduran antes de volver al núcleo, donde se agregan a los cuerpos de Cajal.9 Los snRNAs y sus proteínas asociadas se encuentran en el nucleoplasma, los cuerpos de Cajal, los cuerpos Gemini o gems, y las partículas nucleares (speckles o empalmosomas), pero nunca se encuentran en el nucléolo.10 Ver: https://bio.libretexts.org/Learning_Objects/Worksheets/Biology_Tutorials/mRNA_Splicing 9 Matera AG, Wang Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:108-21. http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch17/splicing.html 10 Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 6 Esquema que muestra como el empalmosoma cataliza el splicing. 11 Regulación del recorte y empalme El recorte y empalme alternativos de los pre-ARNms contribuye a la diversidad del proteoma e interviene en el control de los niveles de expresión génica. El splicing está altamente regulado de manera específica para cada tipo celular. La regulación depende de los motivos en la secuencia del ARN que constituyen los sitios de splicing. Pero además dependen de elementos en cis, intrónicos y exónicos, que reclutan proteínas-que-se-unen-a-ARN, que activan o reprimen el uso de sitios de splicing adyacentes. Estos elementos regulatorios incluyen potenciadores de empalme exónico (ESE, del inglés exonic splicing enhancer), silenciadores de empalme exónicos (ESS, del inglés exonic splicing silencer), potenciadores de empalme intrónicos (ISE, del inglés intronic splicing enhancer) y silenciadores de empalme intrónicos (ISS, del inglés intronic splicing silencer). Exones, cajas abiertas. Intrones, línea zig-zag. Sitios de splicing, ss. Se muestran los motivos de consenso de los ss. También se indica la adenosina del punto de ramificación. Las líneas de puntos indican dos 11 Matera AG, Wang Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:108-21 Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 7 formas alternativas de splicing, con la inclusión o exclusión del exón del medio. El recorte y empalme es regulados por elementos cis (ESE, ESS, ISS, and ISE) y factores que actúan en trans (proteínas SR, hnRNP y otros).12 Las secuencias regulatorias ESE, ESS, ISS, e ISE interactúan con ribonucleoproteínas (RNPs), particularmente con las pertenecientes a la familia de RNPs ricas en serina/arginina (SR) y la familia de RNPs nucleares heterogéneas (hnRNP). En general estas dos familias actúan de manera opuesta y competitiva durante la elección de los exones a incorporarse en el ARNm maduro ya que los ESE e ISE reclutan principalmente proteínas SR que actúan como activadores de empalme, mientras que los ESS y los ISS generalmente son reconocidos por las proteínas hnRNP que funcionan como represores de empalme. La distribución de los factores de splicing alternativos es específica de cada tejido.13 Empalme alternativo El empalme alternativo produce varios ARNms maduros con estructura y funciones diferentes a partir de un mismo pre-ARNm, mediante la combinación de distintos exones. Datos recientes indican que, en promedio, cada transcripto de un gen codificante de proteínas contiene 11 exones y produce 5,4 ARNms.14 Esto explica porque, a partir de un genoma de solo 20-25.000 genes, cada célula humana sintetiza en un momento dado más de 100.000 proteínas diferentes. Se describen 7 modos de empalme alternativo, estimándose que el pre-ARNm del 95% de los genes codificantes sufre alguna forma de empalme. El esquema representa 7 modos de empalme alternativo: eliminación de un exón, retención de un exón, sitio alternativo de splicing 5’, exones mutuamente excluyentes, sitio de splicing alternativo 3′, promotores alternativos y poliadenilación alternativa. Los sitios de corte y empalme alternativos se muestran unidos con líneas punteadas. Las cajas representan exones y las líneas intrones. El empalme alternativo no solo puede determinar cambios en el marco de lectura. También puede modicar la expresión de la proteína por modificación por cambios en la estabilidad o regulación de la traducción en ARNms con un mismo marco de lectura, pero con diferentes regiones 5’ o 3’ no traducibles. 12 Wang Z, Burge CB. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 2008 May;14(5):802-13. doi: 10.1261/rna.876308. 13 Liu Q, Fang L, Wu C. Alternative Splicing and Isoforms: From Mechanisms to Diseases. Genes (Basel). 2022 Feb 24;13(3):401. doi: 10.3390/genes13030401. PMID: 35327956; PMCID: PMC8951537. 14 Liu Q, Fang L, Wu C. Alternative Splicing and Isoforms: From Mechanisms to Diseases. Genes (Basel). 2022 Feb 24;13(3):401. doi: 10.3390/genes13030401. PMID: 35327956; PMCID: PMC8951537. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 8 La mayor parte de los genes produce por lo menos dos variantes. El gen humano de la titina, una proteína del músculo estriado, es un notable ejemplo de recorte y empalme alternativos, ya que contiene 364 exones codificantes y puede sufrir 4039 eventos diferentes de recorte y empalme. El gen de la fibronectina (≈75 kb) contiene múltiples exones. Los exones EIIIB y EIIIA codifican dominios de unión para proteínas específicas de la superficie de los fibroblastos. El ARNm de fibronectina producida en los fibroblastos contiene dichos exones, mientras que el ARNm producido en los hepatocitos elimina esos exones durante el procesamiento del ARN (Los intrones están representados como líneas negras iguales, pero son de tamaño diverso).15 Función de los intrones Los intrones fueron considerados como parte del ADN inútil, pero actualmente se conocen diversas funciones: regulan el recorte y empalme modulan la expresión de las secuencias codificantes dirigen el posicionamiento de los nucleosomas contienen secuencias génicas de ARNs no codificantes (miRNAs y otros se encuentran preferentemente en secuencias intrónicas) Los empalmosomas en enfermedades humanas ESE, ESS, ISS, and ISE Las alteraciones del empalme pueden resultar en proteínas estructural y funcionalmente anómalas. Al parecer, los cambios en la cantidad total de transcriptos, o en la proporción de distintos transcriptos, sería más patogénica que la alteración de la estructura proteica. El recorte y empalme se puede alterar de tres formas diferentes: Mutaciones de secuencias no codificantes de un gen que determinan defectos del recorte y empalme. El 13.5-15 % de los alelos asociados a enfermedades hereditarias monogénicas poseen mutaciones de este tipo. Por ejemplo, en los defectos del gen ATM que determinan ataxia telangiectasia, las mutaciones del gen BRCA1 asociadas a cáncer de mama, las mutaciones del COL5A1 asociadas síndrome de Ehler-Danlos, la fibrosis quística. Mutaciones que generan ARNs tóxicos. Estas mutaciones pueden aumentar la estabilidad de las interacciones entre una especie de ARN y una proteína que se une a la misma (RNA-binding protein, RBP). Esta interacción sostenida permite la expansión del ARNm por medio de secuencias cortas repetidas. Después de cierto límite, estas expansiones se vuelven patológicas, ya que además de alterar la función 15 Lodish 5ed, fig 4.15. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 9 de la proteína codificada, secuestran a la RBP disminuyendo su disponibilidad para el recorte y empalme de otros pre-mRNAs. Esta anomalía es frecuente en enfermedades degenerativas neurológicas y musculares, como la distrofia miotónica, la ataxia espinocerebelosa y la enfermedad de Huntington.16,17 Mutaciones que afectan a factores proteicos necesarios para el empalmosoma. La leucemia linfocítica crónica, y la mielodisplasia se asocian con defectos del snRNP U2, o de ciertos factores proteicos. En la cardiomiopatía dilatada, está mutada una de las RBPs. En consecuencia, se altera la función de los sarcómeros determinando una falla en la elasticidad de la pared cardíaca. La atrofia muscular espinal (SMA), es una enfermedad de carácter recesivo, que determina atrofia progresiva de las motoneuronas y de los músculos inervados por las mismas. La enfermedad se asocia con deleción de SMN1 o de SMN2, dos proteínas del empalmosoma. Sin embargo, no se conoce aún porque las lesiones afectan selectivamente a las motoneuronas.18 De los 12 genes asociados con la retinitis pigmentosa autosómica dominante, 4 corresponden a proteínas involucradas en el recorte y empalme. 19 Preguntas Responde las siguientes preguntas comparando los procesos de transcripción y maduración de los ARNm y ARNr A) ¿Qué ARN polimerasa sintetiza cada tipo de ARN? B) ¿En qué dominio del núcleo ocurre su transcripción? C) ¿Qué similitudes y diferencias presentan la maduración de ambos ARNs y la maquinaria involucrada? D) ¿En qué dominios subnucleares ocurre dicha maduración? Taller 2. Disponibilidad de los ARNms: gránulos de estrés, cuerpos B El control de la cantidad y localización de los ARNms es esencial para la homeostasis celular y para regular las respuestas celulares antes los cambios del medio extracelular. Aquí intervienen dos procesos principales: el control de su transcripción (ver TPs 02, 03 y 04) y las modificaciones postranscripcionales descriptas en el taller 1. Estos últimos dependen de interacciones con distintas proteínas-que-se-unen-a-ARN (RNA-binding proteins, RBPs), que muchas veces ocurren a nivel de las UTRs (regiones no traducidas). La unión de los ARNms con diversas RBPs origina los complejos ribonucleoproteicos mensajeros (mRNPs). Esta asociación es dinámica y se modifica según las condiciones ambientales. La secuencia del marco abierto de lectura de cada ARNm determina la secuencia del polipéptido codificado, pero prácticamente todos los restantes 16 Fredericks AM, Cygan KJ, Brown BA, Fairbrother WG. RNA-Binding Proteins: Splicing Factors and Disease. Biomolecules. 2015 May 13;5(2):893-909. 17 Tawani A, Kumar A. Structural Insights Reveal the Dynamics of the Repeating r(CAG) Transcript Found in Huntington's Disease (HD) and Spinocerebellar Ataxias (SCAs). PLoS One. 2015 Jul 6;10(7):e0131788. doi: 10.1371/journal.pone.0131788. 18 Ottesen EW, Singh RN. Synergistic Effect of an Antisense Oligonucleotide and Small Molecule on Splicing Correction of the Spinal Muscular Atrophy Gene. Neurosci Insights. 2024 Feb 19;19:26331055241233596. doi: 10.1177/26331055241233596. 19 Mordes D, Luo X, Kar A, Kuo D, Xu L, Fushimi K, Yu G, Sternberg P Jr, Wu JY. Pre-mRNA splicing and retinitis pigmentosa. Mol Vis. 2006 Oct 26;12:1259-71. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 10 aspectos del metabolismo de los ARNms están determinados por el conjunto de proteínas unidas a cada uno. Una vez completada la maduración del pre-ARNm, los siguientes fenómenos postranscripcionales regulan la actividad de los ARNms: La exportación desde el núcleo al citoplasma, Cambios en la cola poliA. La deadenilación remueve las proteínas PAB, necesarias para la estabilidad del ARNm y es necesaria para su degradación por exonucleasas 3’-5’. El agregado o eliminación del capuchón, que habitualmente es protegido por la unión con el eIF4 (ver próximo TP). La pérdida del capuchón (decapping) es necesaria para la degradación del ARNm por exonucleasas 5′-3′. La degradación o bloqueo de la traducción por acción de los miARNs. El almacenamiento en gránulos de distinto tipo. Exportación al espacio extracelular. En el siguiente esquema se muestran las múltiples capas de regulación que afectan la vida del ARNm en una célula eucarionte. La dinámica de este proceso depende del fenotipo celular y de su estado funcional. 20 20 Adeli K. Translational control mechanisms in metabolic regulation: critical role of RNA binding proteins, microRNAs, and cytoplasmic RNA granules. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2011;301:E1051-64. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 11 Gránulos de ARNm Los gránulos de ARNm son estructuras dinámicas citoplasmáticas, autoensambladas, que incluyen ARNms que no están siendo traducidos en ese momento, unidos a diversas proteínas (incluyendo las RBPs) que regulan su traducción, recambio, etc. Casi todos los tipos de gránulos exhiben interacciones dinámicas entre sí, tales como acoplamiento, fusión, o aparente maduración de un tipo de gránulo a otro. También poseen la capacidad de devolver los ARNms al sistema de traducción. Los gránulos de mRNPs se clasifican según su contexto celular y específicamente, por la presencia de marcadores de proteínas particulares. Los mejor conocidos son los gránulos de estrés (SG, del inglés stress granules), que como su nombre lo indica, habitualmente se forman durante el estrés celular. Estos gránulos poseen, además de los ARNms, diversos componentes necesarios para iniciar la traducción. 21 Los cuerpos de procesamiento (PB, del inglés processing bodies), que aparecen en todos los tipos celulares, se caracterizan por contener proteínas necesarias para la degradación del ARNm. En conjunto, los gránulos de estrés y los cuerpos P pueden ser considerados como puntos de triage donde se resuelve si los ARNms quedan almacenados, degradados, o devueltos al circuito traduccional. Interesantemente, los PB y los SG a pesar de cumplir funciones distintas poseen ciertas proteínas en común y frente a ciertas condiciones de estrés interaccionan espacialmente. Formación Los gránulos de ARN se forman por “condensación biomolecular”, como se explicó previamente para el nucléolo. La denominación implica que las moléculas condensadas se encuentran a mayor concentración que en el citoplasma o nucleoplasma circundantes. Este significado es reciente (2017) y las evidencias sugieren que los condensados mejor caracterizados (gránulos P, nucleólos y gránulos de estrés, cuerpos de Cajal, empalmosomas) se forman por separación de fases líquida-líquida. Aunque podrían existir otros mecanismos. La separación de fases líquida-líquida intracelular parece requerir interacciones multivalentes y dinámicas, que pueden ser ejecutadas por diversos tipos moleculares ( proteínas con multidominios; regiones intrínsecamente desordenadas (IDRs) de proteínas, ácidos nucleicos o cromatina). 22 La separación de fases está impulsada por altas concentraciones locales de ARN y proteínas, y por interacciones que favorecen la condensación de ARN y proteínas y la separación del medio celular, en forma análoga a la separación energéticamente favorable de aceite y agua. Entre ellas se encuentran las proteínas del empalmosoma, y diversas geminas (abundantes en los cuerpos de Cajal, también denominados gemas).23 21 Buchan JR, Parker R. Eukaryotic stress granules: the ins and outs of translation. Mol Cell. 2009 Dec 25;36(6):93241. doi: 10.1016/j.molcel.2009.11.020. 22 Currie SL, Rosen MK. Using quantitative reconstitution to investigate multicomponent condensates. RNA. 2022 Jan;28(1):27-35. doi: 10.1261/rna.079008.121. Epub 2021 Nov 12. PMID: 34772789; PMCID: PMC8675290. 23 Tauber D, Tauber G, Parker R. Mechanisms and Regulation of RNA Condensation in RNP Granule Formation. Trends Biochem Sci. 2020 Sep;45(9):764-778. doi: 10.1016/j.tibs.2020.05.002. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 12 24 ARTÍCULO PERIODÍSTICO. Imagine packing all the people in the world into the Great Salt Lake in Utah — all of us jammed shoulder to shoulder, yet also charging past one another at insanely high speeds. That gives you some idea of how densely crowded the 5 billion proteins in a typical cell are, said Anthony Hyman, a British cell biologist and a director of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics in Dresden. Somehow in that bustling cytoplasm, enzymes need to find their substrates, and signaling molecules need to find their receptors, so the cell can carry out the work of growing, dividing and surviving. If cells were sloshing bags of evenly mixed cytoplasm, that would be difficult to achieve. But they are not. Membrane-bounded organelles help to organize some of the contents, usefully compartmentalizing sets of materials and providing surfaces that enable important processes, such as the production of ATP, the biochemical fuel of cells. But, as scientists are still only beginning to appreciate, they are only one source of order. Many vital processes in cells are regulated by clouds of proteins and other molecules that coalesce into droplets as needed, then disperse. New work explains how cells turn chaos into control. Recent experiments reveal that some proteins spontaneously gather into transient assemblies called condensates, in response to molecular forces that precisely balance transitions between the formation and dissolution of droplets inside the cell. Condensates, sometimes referred to as membraneless organelles, can sequester specific proteins from the rest of the cytoplasm, preventing unwanted biochemical reactions and greatly increasing the efficiency of useful ones. These discoveries are changing our fundamental understanding of how cells work. For instance, condensates may explain the speed of many cellular processes. “The key thing about a condensate — it’s not like a factory; it’s more like a flash mob. You turn on the radio, and everyone comes together, and then you turn it off and everyone disappears…”25 24 Tauber D, Tauber G, Parker R. Mechanisms and Regulation of RNA Condensation in RNP Granule Formation. Trends Biochem Sci. 2020 Sep;45(9):764-778. doi: 10.1016/j.tibs.2020.05.002. 25 https://www.quantamagazine.org/molecular-condensates-in-cells-may-hold-keys-to-lifes-regulation-20210107/ Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 13 Gránulos de estrés La exposición al estrés puede disparar una respuesta que incluye el bloqueo de la traducción, que a su vez resulta en la formación de los gránulos de estrés. Estos incluyen diversas RBPs, ARNms y factores de iniciación de la traducción, como eIF4E, eIF4G, eIF4A, eIF4B, poly-A binding protein (Pabp), eIF3, eIF2, y complejos de preiniciación o subunidades ribosomales 40S. Es decir que su composición sugiere que estos gránulos son agregados de ribonucleoproteínas atascadas en el proceso de traducción. De hecho, estos gránulos aparecen cuando se inhibe la traducción. 26 Cuando el estrés desaparece, estos gránulos se desarman y la traducción se reinicia. Cuerpos P Los cuerpos P también son complejos biomoleculares cuya formación depende de la disponibilidad de ARNms no traducidos. A diferencia de los gránulos de estrés, los cuerpos P contienen moléculas involucradas en la degradación de los ARNms y la represión de la traducción. En la degradación intervienen enzimas que deadenilan al ARNm y otras que eliminan el capuchón (DCP1/DCP2, donde DCP1 tiene la actividad enzimática, y DCP2 es un activador). Por otra parte, también contienen el complejo de silenciamiento inducido por el ARN (RISC). Generalmente, las moléculas que activan la traducción inhiben a las moléculas que degradan el ARNm; por ejemplo, la proteína eIF4E, que estimula la iniciación de la traducción, inhibe a Dcp1/Dcp2. Por el contrario, los factores que reprimen la traducción, como ciertos miARNs, aceleran la deadenilación y la pérdida del capuchón. 27 Los gránulos de estrés pueden interactuar físicamente con los cuerpos P, permitiendo el tráfico de ARNms almacenados entre ambos compartimientos. 28 26 Decker CJ, Parker R. P-bodies and stress granules: possible roles in the control of translation and mRNA degradation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012 Sep 1;4(9):a012286. doi: 10.1101/cshperspect.a012286. 27 Decker CJ, Parker R. P-bodies and stress granules: possible roles in the control of translation and mRNA degradation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012 Sep 1;4(9):a012286. doi: 10.1101/cshperspect.a012286. 28 Li YR, King OD, Shorter J, Gitler AD. Stress granules as crucibles of ALS pathogenesis. J Cell Biol. 2013 Apr 29;201(3):361-72. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 14 Otros gránulos de ARNm Los gránulos de transporte se definen como focos citoplasmáticos de mRNPs que transitan a lo largo de los microtúbulos en las prolongaciones celulares, especialmente en los axones y dendritas de las neuronas. Estos gránulos también pueden contener ribosomas. La síntesis de proteína suele ocurrir en los mismos sitios donde se utilizará esa proteína. Esquema simplificado de una neurona que muestra la localización de los gránulos de transporte en las dendritas y en el axón. Se señalan las interacciones con los cuerpos P y su transporte a lo largo de los microtúbulos. En el esquema de una célula somática estresada, se indica la localización típica de los gránulos de estrés (con frecuencia perinuclear) y de los cuerpos P (muchas veces asociados a los gránulos de estrés). También aquí importan las interacciones de los gránulos mRNPs con los microtúbulos.29 Durante el proceso de mielinización, los oligodendrocitos extienden prolongaciones que envuelven a los axones y es precisamente en las zonas de contacto glio-axónica donde se sintetiza la mayor cantidad de la proteína de la mielina. El ARNm de una de estas proteínas, la proteína básica de la mielina (MBP), es transportado como complejos ribonucleicos en estos gránulos de transporte. El ARNm de la MBP es reconocido por una proteína que se une a un dominio de su región no traducida 3’ (3’UTR) incorporándolo al gránulo. Durante el transporte hacia la periferia, el ARNm de la proteína básica de la mielina se mantiene silenciado. 30 Las neuronas poseen diversos tipos de gránulos. La acumulación de gránulos de ARN (semejantes a los cuerpos P y gránulos de estrés) se asocia con algunas enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia frontotemporal (FTD). También las inclusiones proteicas típicas de la enfermedad de Alzheimer parecen co-localizar con componentes de los gránulos de ARN. 31 Gránulos germinales. Estos gránulos incluyen componentes de los gránulos de estrés y de los cuerpos P, pero poseen otros componentes que intervienen en la maduración de las gametas. Actuarían como 29 Buchan JR. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 2014:;11(8) 30 White R, Gonsior C, Bauer NM, Krämer-Albers EM, Luhmann HJ, Trotter J. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) F is a novel component of oligodendroglial RNA transport granules contributing to regulation of myelin basic protein (MBP) synthesis. J Biol Chem. 2012 Jan 13;287(3):1742-54. 31 Fan AC, Leung AK. RNA Granules and Diseases: A Case Study of Stress Granules in ALS and FTLD. Adv Exp Med Biol. 2016;907:263-96. Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 15 plataformas para el control postranscripcional de la expresión genética, una función de gran importancia para la diferenciación de las células germinales. Discusión General: Resumen del procesamiento de los ARNms Diagrama de los procesos de maduración que sufren los transcriptos según sean sintetizados por la ARN Pol 1, 2 o 3 (Lodish, Cap 10). Unidad 05 Medicina Celular y Molecular – 2024 – Módulo 1 16 Tarea de investigación Pitt GS, Long Y. Mutations of Splicing Regulator RBM20 in Atrial Fibrillation. JACC Basic Transl Sci. 2024 Feb 26;9(2):181-184. doi: 10.1016/j.jacbts.2023.11.004. Lee el trabajo, investiga y responde el siguiente cuestionario: 1. Definición de arritmia cardíaca y fibrilación auricular (FA). 2. ¿Qué se entiende por aumento de la prevalencia? 3. En la fibrilación auricular ¿cuáles son los factores de riesgo modificables? 4. Los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS= Genome-Wide Association Studies), ¿tienen algún impacto en el análisis de la fibrilación auricular? 5. ¿Cuál es la función de la titina en el cardiomiocito? ¿Qué características moleculares posee esta proteína? 6. ¿Cuál es la actividad molecular de la proteína 20 con motivos de unión al ARN (RBM20), sobre los mARNs? ¿Qué reconoce para actuar en ellos y dónde se expresa? 7. ¿Cuáles son los mARNs cuyo empalme alternativo en los cardiomiocitos es regulado por la proteína RBM20? 8. ¿Qué detectaron Vad y colaboradores en el análisis de las mutaciones de RBM20 en pacientes con fibrilación auricular de inicio temprano? 9. Describe los dominios RS y RRM de la proteína RBM20 ¿cuál es la consecuencia de mutaciones en estos dominios? 10. ¿Qué detectó el grupo de Vad y col en los estudios in vivo en un modelo murino? Ver también: