2024 KINETIKA ENZIM 1- IKD 2 (1) PDF

BIOKIMIA 1 KINETIKA ENZIM BIOKIMIA 2  SPEKTROFOTOMETER λ TERTENTU SUMBER FILTER/ SLIT KUVET FOTOSEL GALVANO- CAHAYA MONO- METER CHROMATOR...

BIOKIMIA 1 KINETIKA ENZIM BIOKIMIA 2  SPEKTROFOTOMETER λ TERTENTU SUMBER FILTER/ SLIT KUVET FOTOSEL GALVANO- CAHAYA MONO- METER CHROMATOR 3  SUMBER CAHAYA : PUN YA BAN YAK SPEKTRUM FILTER/MONOCHROMATOR UNTUK MENDAPATKAN BERKAS SINAR/ SPEKTRUM YANG DIINGINKAN SLIT: MENINGKATKAN KEMURNIAN KROMATIK (λ = PANJANG GELOMBANG) KUVET : BERISI LARUTAN YANG DIPERIK SA SINAR YANG DITERUSKAN DARI KUVET AKAN MENUJU KE FOTOSEL 4  FOTOSEL MENGUBAH ENERGI SINAR MENJADI ENERGI LISTRIK GALVANOMETER : MENGUBAH ENERGI LISTRIK MENJADI ENERGI MEKANIK MENGGERAKKAN JARUM TRANSMITTANCE : 0 -100% ABSORBANCE = OD (OPTICAL DENSITY = EXTINCTION = 2 - LOG T 5  Absorbance = 2 – log T Transmittance : Sesuai sinar yang diteruskan Absorbance sesuai sinar yang diserap Misalkan T = 100% maka Abs = 2 – log 100 = 0 T = 10%  Abs = 2 – log 10 = 1 ABSORBANCE TERGANTUNG SIFAT KADAR BAHAN/ LARUTAN YANG DIPERIK SA 6  Abs ~ KADAR (BERBANDING LURUS) BL = BLANK ST = STANDARD BL ST U U = UNKNOWN SEBAGAI TITIK 0 ALAT SPEKTROFOTOMETER: AQUADEST/ AQUABIDEST ATAU BLANK (BERISI REAGEN SAJA) ST: LARUTAN STANDARD YANG SUDAH DIKETAHUI KADARN YA U = LARUTAN BAHAN YANG AKAN DIPERIK SA KADARN YA 7 MENGUKUR KADAR/ AKTIVITAS ENZIM JUMLAH ENZIM: SEDIKIT (KADARN YA KECIL) ISOLASIN YA SULIT JADI YANG DIUKUR BIASAN YA ADALAH AKTIVITAS KATALITIK ENZIM TER SEBUT AKTIVITAS KATALITIK DAPAT DIUKUR DARI: JUMLAH PRODUK YANG TERBENTUK / WAKTU TERTENTU JUMLAH SUBSTRAT YANG TELAH DIUBAH/ WAKTU TERTENTU 8  CARA MENGUKUR AKTIVITAS ENZIM PENGUKURAN KADAR/ AKTIVITAS ENZIM MACAM-MACAM CARA: 1. DENGAN CARA MEMBANDINGKAN DENGAN AKTIVITAS ENZIM MURNI : [E] ~ [vo] ASAL [E] iep PADA IEP (ISOELECTRIC POINT) SUATU AMFOLIT TIDAK BERGERAK DALAM MEDAN LISTRIK MUATAN TOTAL = 0 BRONDSTET : ASAM : DONOR H+ BASA : AK SEPTOR H+ 21  Kurva hubungan P(produk) dengan t (waktu) pada reaksi enzimatik pH optimum suatu enzim adalah pH yang memberikan aktivitas pH I enzim paling tinggi pH I pH II Pada pH optimum harga P P/t selalu lebih besar pH III dibanding pada pH pH IV lainnya o o t 22  pH OPTIMUM UMUMN YA 100 BERKISAR ANTARA pH 5 – 9 (BERBENTUK GENTA) Akrivitas E (%) PERKECUALIAN: MISALN YA PEPSIN pH OPTIMUMN YA 1-2 pH < pH opt pH> 23  Hubungan antara aktivitas enzim dengan pH berbentuk genta karena: Denaturasi protein pada pH terlalu tinggi atau terlalu rendah Pengaruh pH pada muatan enzim ataupun substrat, misalnya E- dan SH+  ESH Bila pH > maka SH+  S + H+ S tak dapat berikatan dengan E- Bila pH < maka E- bereaksi dengan H+  EH EH tak dapat berikatan dengan SH+ pH mempengaruhi konformasi / struktur enzim 24  PENGARUH SUHU PADA AKTIVITAS ENZIM Suhu Energi kinetik reaksi lebih cepat vo Enzim adalah protein makin mudah denaturasi 50o C 60o C P 40o C 80o C o o t1 t t2 25  “SUHU OPTIMUM” TERGANTUNG WAKTU PERCOBAAN ENZIM DALAM CONTOH : PADA t1  60oC PADA t2 50oC ENZIM PADA UMUMN YA: STABIL PADA SUHU DINGIN TIDAK TAHAN PANAS (PADA SUHU 70oC DENGAN CEPAT AKAN INAKTIF) The most common temperature at which enzyme assays are performed are 25oC, 30oC and 37oC. 26  PENGARUH KADAR ENZIM vo berbanding lurus dengan kadar E Syarat : [E] KM maka vo ≈ vomax APABILA [So] HARGA KM LEBIH MUDAH DICARI APABILA GRAFIK BERBENTUK LINEAR  OLEH LINEWEAVER-BURK RUMUS DI ATAS DAPAT DIMODIFIKASI SEHINGGA DIDAPAT GRAFIK BERBENTUK LINEAR 35 vo vs [So] Bentuk : hiperbola Membuat grafik : sulit Difficult to determine KM (have to determine vomax first) vomax vo ½ vomax KM [So] 36 LINEWEAVER-BURK RECIPROCAL PLOT 1/vo vs 1/[So] Lineweaver-Burk rearrange the Michaelis-Menten equation to get a linear graph. The data should be plotted as 1/vo vs 1/[So] 37 GRAFIK LINEWEAVER-BURK BERBENTUK LINEAR MM vomax [So] KM + [So] vo = 1/vo = KM +[So] vomax [So] KM 1/ vo 1/vo = X 1/[So] + 1/vomax vomax 1/vomax o LINEWEAVER BURK -1/KM o 1/[So] y= ax + b 38 ACTIVATOR S AND INHIBITOR S A = activator I = inhibitor S = substrate E = enzyme 39 PENGARUH AKTIVATOR YANG DISEBUT AKTIVATOR ADALAH A = AKTIVATOR I = INHIBITOR UNSUR ATAU SEN YAWA YANG DAPAT S = SUBSTRAT MEMPERCEPAT KECEPATAN REAK SI E = ENZIM KATALISIS OLEH ENZIM, ANTARA LAIN KOFAKTOR LOGAM, KOENZIM. S AKTIVATOR TIDAK SELALU BERUPA KOFAKTOR SUATU SEN YAWA YANG BERTINDAK SEBAGAI MODULATOR ATAU EFEKTOR YANG MEMPERCEPAT REAK SI (EFEKTOR POSITIF) JUGA E I TERGOLONG AKTIVATOR A 40 ACTIVATOR S  An activator is a substance that increases the rate of a catalysed reaction  Cofactors (metal cofactors, coenzymes) are examples.  An activator of an enzyme-catalysed reaction may be called an enzyme activator if it acts by binding to the enzyme  An activator does not have to be a cofactor 41 INHIBITOR S An inhibitor is a substance that diminishes the rate of a chemical reaction and the process is called inhibition. In enzyme-catalysed reactions an inhibitor frequently acts by binding to the enzyme, in which case it may be called an enzyme inhibitor 42  Sometimes added substances increase or decrease the rate of an enzyme-catalysed reaction without interacting with the enzyme itself; they may interact with substrates or with modifiers or effectors that are already present in the system. Such substances may be referred to as activators or inhibitors, but should not be referred to as enzyme activators, enzyme inhibitors, modifiers or effectors. 43 EFFECTOR, MODULATOR OR MODIFIER In allosteric enzymes S A I Allosteric effector Positive effector  allosteric activator Negative effector  allosteric inhibitor 44  PENGARUH INHIBITOR Suatu inhibitor enzim akan menghambat kecepatan reaksi enzimatik Berdasar ikatannya dengan enzim dibedakan: 1. Inhibitor reversibel Ikatan enzim dengan inhibitor bersifat reversibel : E + I EI 2. Inhibitor irreversibel E+I EI Inhibitor reversibel ada yang bersifat kompetitif ada yang nonkompetitif Inhibitor irreversibel  nonkompetitif 45  Berdasar kinetikanya Kompetitif atau nonkompetitif dilihat dari grafik vo vs [So] Inhibitor reversibel  Inhibitor kompetitif  Inhibitor nonkompetitif  Inhibitor irreversibel:  Inhibitor nonkompetitif  Mengikat enzim secara irreversibel, biasanya melalui ikatan kovalen 46 Reversible inhibitors Competitive inhibitor I competes with the S for binding to the free enzyme Increasing [S] will overcome the action of the inhibitor Non competitive inhibitor Binds to a site other than the substrate-binding site on enzyme, and the ES complex 47  MEMPELAJARI PENGARUH INHIBITOR SERI I TANPA INHIBITOR [So]1 < [So]2 < [So]3 < [So]4 < [So]5 < [So]6 < [So]7 < [So]8 SERI II DENGAN INHIBITOR 48 [So]1 < [So]2 < [So]3 < [So]4 < [So]5 < [So]6 < [So]7 < [So]8  MEMBANDINGKAN vO vs [So] TANPA DAN DENGAN INHIBITOR ENZIM ISI SERI I = SERI KE II KECUALI BAHWA PADA SERI II JUGA BERISI INHIBITOR DALAM KADAR YANG SAMA PADA TIAP-TIAP TABUNGN YA (TABUNG 1 S/D 8) KEMUDIAN BUAT GRAFIK HUBUNGAN vo vs [So] UNTUK SERI I DAN UNTUK SERI KE II BANDINGKAN GRAFIK YANG DIDAPAT 49  Inhibitor jenis apakah ini? vomax’ = vomax -I +I ½ vomax vo o o [So]6 [So]8 KM KM’ [So] 50  INHIBITOR KOMPETITIF TANPA INHIBITOR: [So]6 SUDAH MEMBERIKAN vomax DENGAN INHIBITOR KOMPETITIF HARGA vomax DAPAT DICAPAI PADA HARGA [So] > [So]6 YAITU PADA [So]8 JADI PENGARUH INHIBITOR KOMPETITIF: KM’ > KM Vomax ’ = vomax 51 GRAFIK LINEWEAVER-BURK PENGARUH INHIBITOR KOMPETITIF +I -I 1/vO I = Inhibitor 1/vomax -1/KM O 1/[So] -1/KM ’ 52 Competitive inhibitor  I competes with the S for binding to the free enzyme  E+S ES E+P +I EI  the inhibitor and the substrate are mutuallyII exclussive  Km’ > Km  vomax ’ = vomax 53  STRUKTUR INHIBITOR KOMPETITIF INHIBITOR KOMPETITIF YANG KLASIK  STRUKTUR I MIRIP S I ANALOG S.  I BEREBUT DANGAN S UNTUK MENEMPATI CELAH AKTIF ENZIM S II E 54  Examples: - Sulfanilamide and PABA (substrate of folic acid synthesis in bacteria) - Malonate and succinate (substrate of succinate dehydrogenase) 55  YANG TIDAK KLASIK MENGHALANGI/ MENGAKIBATKAN SUBSTRAT TAK DAPAT MASUK CELAH AKTIF S I INHIBITOR HALANGAN STERIK E 56 NONCOMPETITIVE INHIBITOR vomax vomax ’ -I +I vomax ’ < vomax ½ vomax ½ vomax ’ Km ’ = Km vo o o Km [So] Ⅱ 57 K ’ Noncompetitive inhibitor (Reversible): S E + I EI + S +S E P + E ES + I ESI I 58 Lineweaver Burk plot +I -I 1/vo 1/vomax ’ I = Non Competitive Inhibitor 1/vomax -1/KM o 1/[So] 59  Irreversible inhibitor  Binds to the enzyme irreversibly, usually by a covalent bond E+I EI  Noncompetitive inhibitor vomax ’ < vomax and Km ’ = Km  Examples: Hg++  attack –SH group of cysteine  Diisopropylfluorophosphate (DFP) react with –OH group of a specific serine in the active site of acetylcholine esterase 60  L RO NT le ive CO ib rs etit v e +re comp tor ibi non ibitor inh vomax inh leib ers ev irr + [E]i [E ]total [E]i  represents the enzyme titrated by the irreversible inhibitor 61  ENZIM DENGAN KINETIKA M-M [So]1 < [So]2 < [So]3 < [So]4 < [So]5 < [So]6 < [So]7 < [So]8 vomax ENZIM MONOMERIK SEDERHANA vo ½ vomax O KM [So] O [So]6 [So]7 62  ENZIM DENGAN KINETIKA M-M [So]1 < [So]2 < [So]3 < [So]4 < [So]5 < [So]6 < [So]7 < [So]8 ENZIM OLIGOMERIK vomax NO COOPERATIVITY vo ½ vomax O KM [So] O [So]6 [So]7 63  ENZIM OLIGOMERIK DGN KINETIKA M-M CONTOH : LAKTAT DEHIDROGENASE (LDH) MASUKN YA SUATU MOLEKUL SUBSTRAT PADA SUATU SUBUNIT TIDAK MEMPENGARUHI MASUKN YA MOLEKUL SUBSTRAT PADA SUBUNIT BERIKUTN YA PADA MOLEKUL YANG SAMA 64  KINETIKA HOMOTROPIK ENZIM OLIGOMERIK CELAH AKTIF TERSEMBUNYI APABILA MASUKN YA SUATU MOLEKUL SUBSTRAT PADA SUATU SUBUNIT MEMPENGARUHI MASUKN YA MOLEKUL SUBSTRAT PADA SUBUNIT BERIKUTN YA PADA MOLEKUL YANG SAMA  DIKATAKAN MEMPUN YAI KINETIKA HOMOTROPIK 65  APABILA PENGARUHN YA MEMPERMUDAH  DIKATAKAN ADA KOOPERATIVITAS POSITIF. ENZIM SEMACAM INI SERING DISEBUT SEBAGAI ENZIM ALLOSTERIK APABILA MEMPER SULIT  KOOPERATIVITAS NEGATIF 66  ENZIM ALLOSTERIK vomax BENTUK SIGMOID [So]0.5 BERADA DI vo DAERAH YANG CURAM COCOK UNTUK ENZIM ½ vomax REGULATOR o o [So] [So]0.5 67  ENZIM REGULATOR SERINGKALI MERUPAKAN ENZIM ALLOSTERIK A B C D E P E1 E2 E3 E4 E1 MERUPAKAN ENZIM REGULATOR ENZIM DENGAN KINETIKA HOMOTROPIK KOOP POSITIF s 68 KOOPERATIVITAS NEGATIF vo MIRIP, TETAPI BUKAN HIPERBOLA o o [So] 69  Grafik hubungan [So] dengan vo B: KOOP POS : SIGMOID A: TANPA KOOP: HIPERBOLA C: KOOP NEG : MIRIP HIPERBOLA vo o o [So] KM 70 Grafik hubungan 1/[So] dengan 1/vo KONKAV KE ATAS LURUS KONKAV KE BAWAH 1/vo 1/[So] 71 KINETIKA HETEROTROPIK ENZIM ALLOSTERIK DAPAT DIPENGARUHI OLEH AKTIVATOR ATAUPUN INHIBITOR ALLOSTERIK PENGARUH A ATAU I TERHADAP PENGIKATAN S (SUBSTRAT) PADA ENZIM ALLOSTERIK  KINETIKA HETEROTROPIK ENZIM ALLOSTERIK : KURVA BERBENTUK SIGMOID A  MENGGESER KE KIRI I  MENGGESER KE KANAN  MENJADI LEBIH SIGMOID 72  S A I EFFECTOR SITE: TEMPAT A TEMPAT I 73  voma x KONTROL : ENZIM ALLOSTERIK +AT (ASPARTAT P KONTRO TRANSKARBAMOILASE) - L TANPA MODULATOR vo +CT P ATP : ½ vomax AKTIVATOR ALLOSTERIK CTP: INHIBITOR ALLOSTERIK PRODUK : N- KARBAMOIL –L-ASPARTAT o [So]0. [So] 74  ENZIM REGULATOR SERINGKALI MERUPAKAN ENZIM ALLOSTERIK (GBR : E1) A B C D E E1 E2 E3 E4 P + _ Q _ P MENGHAMBAT E1  MEKANISME R END-PRODUCT INHIBITION + AKTIVATOR _ INHIBITOR 75 End-product inhibition. Also called as Feedback inhibition The final product inhibits the first enzyme and switch off the whole pathway to prevent accumulation of intermediates The structure of the end-product of the metabolic pathway is usually very different from the initial substrate Behave as allosteric inhibitor SELAMAT BELAJAR 76 77