Aminosäuren Proteine PDF

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MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Gerold Brüning Modul I – NwP Abt. Biochemie Seminar Biochemie 2023 Aminosäuren, Proteine 1. Säuren und Basen pH-Wert, pKs-Wert, Titratskurven, Neutralpunkt, Äquivalenzpunkt 2. Aminosäuren sind a-Aminocarbonsäuren, liegen bei pH / als Zwitterion vor, neun sind unpolar, unter den polaren sind zwei saure und drei basische, Titrationskurven, pKs-Werte, isolelektrischer Punkt, essentielle Aminosäuren Abbildungen stammen aus Löffler, Petrides: Lodish et al.: 3. Proteine Primärstruktur, Mesomerie der Peptidbindung, Biochemie und Molecular Cell Sekundärstruktur (a-Helix, b-Faltblatt), Tertiärstruktur entsteht Pathobiochemie biology durch Faltung einer Peptidkette, Quartärstruktur entsteht durch Aneinanderlagerung mehrerer Peptidketten 4. Proteinanalytik Gelpermeationschromatographie (Trennung nach Größe), Ionenaustauschchromatographie (Trennung durch Ladungen), Affinitätschromatographie (Trennung durch Bindung an einen spezifischen Liganden) Prof. Dr. rer. nat. Peter Bugert Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was sind (Brönsted-)Säuren, was sind Basen? Was ist Ks? was ist pKs? MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Säuren und Basen MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was ist der pH?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was ist der pH? Der pH ist eine Zahl, die die Konzentration der H3O+-Ionen (also Protonen) angibt. MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Säuren und Basen  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Säuren und Basen Wasser ist Säure und Base H 2O + H 2O H3O+ + OH- Neutralpunkt: [H3O+ ] = [OH-] = 10-7 mol/l pH + pOH = 14 Ionenprodukt des Wassers: [H3O+ ] x [OH-] = 10-14 mol2/l2 pH + pOH = 14 Wichtige Säure/Base-Paare und ihre pKs-Werte HSO4-/SO42- (Hydrogensulfat/Sulfat) 1,9 NH4+/NH3 (Ammonium/Ammoniak) 9,2 H2CO3/HCO3- (Kohlensäure/Hydrogencarbonat) 6,4 HCO3-/CO32- (Hydrogencarbonat/Carbonat) 10,3 CH3COOH/CH3COO- (Essigsäure/Acetat) 4,8 H2PO4-/HPO42- (Dihydrogenphosphat/Hydrogenphosphat) 7,2  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Der pH im Magen kann (maximal) bei 1 liegen. Wie hoch ist bei pH = 1 die Konzentration von [H3O+]? Wie hoch ist dann die Konzentration von [OH-]?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Säuren und Basen Wasser ist Säure und Base H 2O + H 2O H3O+ + OH- Neutralpunkt: [H3O+ ] = [OH-] = 10-7 mol/l pH + pOH = 14 Ionenprodukt des Wassers: [H3O+ ] x [OH-] = 10-14 mol2/l2 pH + pOH = 14 Wichtige Säure/Base-Paare und ihre pKs-Werte HSO4-/SO42- (Hydrogensulfat/Sulfat) 1,9 NH4+/NH3 (Ammonium/Ammoniak) 9,2 H2CO3/HCO3- (Kohlensäure/Hydrogencarbonat) 6,4 HCO3-/CO32- (Hydrogencarbonat/Carbonat) 10,3 CH3COOH/CH3COO- (Essigsäure/Acetat) 4,8 H2PO4-/HPO42- (Dihydrogenphosphat/Hydrogenphosphat) 7,2  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was ist bzw. wie ermittelt man eine Titrationskurve? d+ Die Carbonsäure bzw. das CO2 ist eine Lewis-Säure ein Elektronenpaarakzeptor elektrophil Die Hydroxygruppe bzw. das Wasser sind eine Lewis-Base Elektronenpaardonatoren nucleophil NaOH  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Titrationskurve einer starken Säure (Salzsäure) Neutralpunkt = Äquivalenzpunkt d+ Am Äquivalenzpunkt sind die Stoffmenge an vorhandener Säure und zugegebener Base identisch (äquivalent). Er entspricht Die Carbonsäure bzw. das CO2 ist dem eineWendepunkt Lewis-Säure bei maximaler pH- Änderung. ein Elektronenpaarakzeptor elektrophil Die Hydroxygruppe bzw. das Wasser sind eine Lewis-Base Elektronenpaardonatoren nucleophil NaOH  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Titrationskurve einer schwachen Säure (Essigsäure) Ein Puffer besteht (idealerweise) aus äquimolarer Konzentration von Säure und konjugierter Base, z. B. CH3COOH und Natriumacetat, also pH = 4,76. Verdünnung eines solchen Puffers, z. B. von 100 mmol/l auf 10 mmol/l, ändert den pH-Wert nicht, da nach wie vor CH3COOH und Natriumacetat äquimolar sind, aber die Pufferkapazität ist Äquivalenzpunkt entsprechend vermindert. Neutralpunkt d+ Pufferbereich, pKs = 4,76 Die Carbonsäure bzw. das CO2 ist eine Lewis-Säure ein Elektronenpaarakzeptor elektrophil Die Hydroxygruppe bzw. das Wasser sind eine Lewis-Base Elektronenpaardonatoren nucleophil MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was sind Aminosäuren? Struktur? Anzahl proteinogener AS? Konfiguration am a-C-Atom? pKs-Werte? essentielle AS?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim a-Aminocarbonsäuren Carboxylgruppe a Aminogruppe R a-Aminocarbonsäuren ▪ 21 proteinogene AS ▪ L-Konfiguration ▪ pKs der Carboxylgruppe bei 1,7 bis 2,4 ▪ pKs der Aminogruppe zwischen 9 und 10,5 ▪ 8 (9) essentielle Aminosäuren  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Essentielle Aminosäuren Nichtessentielle Aminosäuren Phenylalanin (Phe, F) Valin (Val, V) Alanin (Ala, A) Glutamin (Gln, Q) Isoleucin (Ile, I) Lysin (Lys, K) Arginin (Arg, R) Glycin (Gly, G) Tryptophan (Trp, W) Threonin (Thr, T) Asparagin (Asn, N) Prolin (Pro, P) Methionin (Met, M) Aspartat (Asp, D) Serin (Ser, S) Leucin (Leu, L) Cystein (Cys, C) Tyrosin (Tyr, Y) Histidin (His, H)) Glutamat (Glu, E) Proteinogene Aminosäuren, die nicht im menschlichen Organismus synthetisiert werden können, werden als essentielle Aminosäuren bezeichnet und müssen mit der Nahrung aufgenommen werden. Histidin ist für Erwachsene nicht essentiell (Ursache unklar). MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Glycin (a-Aminoacetat) ist die einzige achirale proteinogene AS Quelle: Lodish  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Proteinogene Aminosäuren (21) unpolare Seitenkette, unverzweigt (3): Gly, Ala, Met unpolare Seitenkette, verzweigt (6): Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Trp ungeladen, polar (7): Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Cys, Sec geladen, sauer (2): Asp, Glu geladen, basisch (3): Lys, Arg, His  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit apolaren Seitenketten (9) Alanin (Ala, A) Valin Isoleucin Leucin (Val, V) (Ile, I) (Leu, L) verzweigtkettige AS alle essentiell  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit apolaren Seitenketten (9) Prolin (Pro, P) Methionin Phenylalanin (Met, M) (Phe, F) Tryptophan (Trp, W) sekundäres Amin Thioether, Benzolring, Indolring, essentiell essentiell essentiell  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten (7) mit einer Hydroxygruppe Threonin Serin (Thr, T) (Ser, S) essentiell Tyrosin (Tyr, Y)  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten (7) mit einer Hydroxygruppe posttranslationale Modifikation: Glykosylierung (Bildung einer O-glykosidischen Bindung) findet im Golgi-Apparat und im Cytosol statt. Auch Threonin-Reste können glykosyliert werden, Tyrosin-Reste (fast) nie. Quelle: Löffler  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten (7) mit einem Amid Asparagin (Asn, N) Glutamin (Gln, Q)  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten (7) mit einem Amid posttranslationale Modifikation: Glykosylierung (Bildung einer N-glykosidischen Bindung, nur Asparagin) findet im ER statt.  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten (7) mit einem primären Thiol mit Selen SeH Cystein Selenocystein (Cys, C) (Sec, U)  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Reduktion-Oxidationsgleichgewicht von Cystein - 2H + 2H Thiol-(= Sulhydryl-)Gruppen sind leicht zu einem Disulfid oxidierbar. Dies kann spontan passieren und hängt von der Anwesenheit von Elektronenakzeptoren in der Umgebung ab. Im Cytosol herrscht ein reduktives Milieu, und Cystin wird enzymatisch mit Elektronen aus NADH reduziert. Frage: Warum ist das im Cytosol von entscheidender Bedeutung? Quelle von NADH ist im Cytosol hauptsächlich der Abbau von Glucose (Glykolyse).  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit sauren Seitenketten (2) Dicarbonsäure Dicarbonsäure pKsa = 1,99 pKsa = 2,16 pKsb = 3,90 pKsg = 4,32 Aspartat Glutamat (Asp, D) (Glu, E) Quelle: Löffler  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren mit basischen Seitenketten (3) mit einem zweiten mit einer mit einem Imidazolring primären Amin, Guanidinogruppe, Seitengruppe teilweise pKs = 10,5 pKs = 12,1 geladen pKs = 6, Pufferwirkung Lysin (Lys, K) Histidin Arginin (Arg, R) (His, H)  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim 2 9 3 Übersicht über die 21 5 4 proteinogenen 6 3 Aminosäuren 3 9 unpolare 6 7 polare, ungeladene 4 2 saure 5 3 basische 5 Die Klassifizierung von Glycin ist 5 umstritten, da es keine Seitenkette besitzt. Die Einteilung als unpolar macht 3 insofern Sinn, als ein Wassermolekül 9 mit der nicht polarisierten C-H-Bindung 6 keine Wechselwirkung (H-Brücke) eingehen kann. 11 6 Die Inklusion von Selenocystein ist 6 umstritten, da es nicht als Aminosäure an eine tRNA geknüpft wird, sondern 4 durch Austausch von O gegen Se in einer Serin-tRNA erst entsteht 5 Zahl der C-Atome (s. Modul IV).  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was ist der isoelektrische Punkt von Aminosäuren (AS)?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Aminosäuren können Protonen sowohl aufnehmen als auch abgeben (Ampholyte), sind Zwitterionen, bei pH 7 sowohl positiv als auch negativ geladen am isolelektrischen Punkt ist die Nettoladung =0 Titration von Glycin pKS1 + pK s2 _____________ Isoelektrischer Punkt = = 6,0 2 = 9,6 d+ Die Carbonsäure bzw. das CO2 ist eine Lewis-Säure ein Elektronenpaarakzeptor = 2,3 elektrophil Die Hydroxygruppe bzw. das Wasser sind eine Lewis-Base Elektronenpaardonatoren nucleophil MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Titrationskurve von Alanin IP: Isoelektrischer Punkt [A-] pH = pKs + lg [HA] verzweigtkettige AS  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Titration von Lysin pK S2 + pK s3 _____________ Isoelektrischer Punkt = = 9,74 2 = 10,5 = 9,0 Lysin ist im Blut bzw. in der Zelle positiv geladen Der isoelektrische Punkt von Lysin liegt bei pH = 9,74, dem arithmetischen Mittel = 2,2 der pKs-Werte der beiden Aminogruppen MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Quelle: Löffler b MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Titration von Histidin  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Titration von Histidin pK S2 + pKs3 _____________ Isoelektrischer Punkt = = 7,6 2 = 9,2 = 9,1 Histidin puffert bei = 6,0 physiologischem pH-Wert. Innerhalb von Proteinen steigt der pKs2 auf etwa 7. = 1,8  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Proteine: Aufbau und räumliche Struktur Durch die lineare Verknüpfung von proteinogenen Aminosäuren entstehen Peptide und Proteine. Die Aminosäuren werden hierbei durch Peptidbindungen verbunden. Unterschiedliche Wechselwirkungen zwischen den Aminosäuren eines Proteins führen zu seiner räumlichen Struktur. Es werden Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur unterschieden.  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Peptidbindung Kondensationsreaktion unter Eliminierung eines Wassermoleküls: Bildung eines Säureamids zwischen der a-Carboxylgruppe einer AS und der a-Aminogruppe einer weiteren AS O OH C R H NH O OH O OH H 2O Peptid-Bindung C C O C H2 N H H2N H H 2N H R R Amidbildung R O  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Mesomerie der Peptidbindung Die Peptidbindung hat den Charakter einer planaren Doppelbindung. Folge: Keine freie Drehbarkeit Der Abstand von C und N ist kürzer als in einer normalen C-N- Einfachbindung. O R1 H O H C C N R2 C H2N C N C C OH H R H O H Mesomerer Zustand O R1 H O H C C N R2 C trans-Konfiguration H2N C N H C C OH ist stabiler R H O H  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was ist die Primärstruktur eines Proteins?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Primärstruktur Die Hauptkette ist die lineare Sequenz der durch Peptidbindungen verknüpften Aminosäuren (= Primärstruktur), z. B. NH2 Ala-Ser-Pro-Val-Gly COOH Da bei der Synthese am Ribosom immer die nächste Aminosäure mit ihrer freien Aminogruppe die mit der Carboxylgruppe an die tRNA gebundene vorherige Aminosäure angreift, beginnen Proteine immer mit einer freien Aminogruppe und enden mit einer freien Carboxylgruppe. Die Sequenz der Atome der Hauptkette ist (ein Pentapeptid, a-C-Atom rot) N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C Man unterscheidet: Oligopeptide: Kette von bis zu 10 Aminosäuren (Di-, Tripeptide usw.) Polypeptide: Kette von mehr als 10 Aminosäuren Proteine: Kette von mehr als 100 Aminosäuren MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was sind Sekundärstrukturen der Proteine?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Sekundärstruktur Durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den NH- und Carbonyl-Gruppen der Aminosäureketten entstehende Struktur Sekundärstrukturen sind a-Helix (gelb) und b-Faltblatt (rot), (daneben b-Turn und W-Loop) Diese Strukturen können sich innerhalb einer Peptidkette abwechseln. Beispiel für das Vorkommen verschiedener Sekundärstrukturen in einem einzelnen Protein, das Enzym Triosephosphatisomerase:  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim a-Helix 3,6 Aminosäuren pro 360°-Windung Wasserstoffbrücken zwischen dem an N gebundenen H und dem O der Carbonylgruppe der 3. darauffolgenden AS O hellblau H dunkelblau N gelb C grau  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim b-Faltblatt parallel: H 2N COOH H2N COOH antiparallel: H 2N COOH HOOC NH2 MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Löffler/Petrides, 2003 MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was ist die Tertiärstruktur der Proteine?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Tertiärstruktur Die stabile räumliche Anordnung eines Proteins nennt man Tertiärstruktur. Sie wird durch Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten der Aminosäuren bedingt, konkret durch Hydrophobe Wechselwirkung van-der-Waals-Wechselwirkung Ionenbindungen Wasserstoffbrücken Disulfidbrücken Proteine können durch Drehung um Einfachbindungen unterschiedliche Konformationen einnehmen. Durch Bindung von weiteren Untereinheiten (Ausbildung einer Quartärstruktur, s.u.), durch Wechselwirkung mit kleinen Substanzen oder anderen Proteinen oder durch kovalente Modifikation, wie z. B. Phosphorylierung, kann (zumeist reversibel) eine bestimmte von wenigen möglichen Konformationen induziert bzw. energetisch begünstigt und damit stabilisiert werden. Durch solche Konformationsänderungen wird (typischerweise) die Funktion des Proteins aktiviert bzw. inaktiviert. MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Tertiärstruktur  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim van-der-Waals-Kräfte beruhen auf temporären Dipolen In einem an sich unpolaren Molekül entsteht an einem Atom durch zufällige kurzfristige Ungleichverteilung der Elektronen ein temporärer Dipol, der im Nachbaratom einen Dipol induziert, so dass es zu einer elektrostatischen Anziehung kommt.  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Anfinsen-Experiment (Reversible De- und Renaturierung eines Enzyms, RNAse A1961) Die Primärstruktur enthält alle Informationen für die Faltung eines Proteins MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Was sind Domänen? Was ist die Quartärstruktur der Proteine?  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Domänen, Quartärstruktur Durch die räumliche, kompakte Anordnung verschiedener Sekundärstrukturen entstehen innerhalb eines Proteins Bereiche mit eigener Tertiärstruktur. Diese Bereiche werden als Domänen bezeichnet. Domänen können für unterschiedliche Funktionen innerhalb eines Proteins verantwortlich sein. Quartärstruktur: Organisationsebene von Proteinen mit mehreren Polypeptidketten (Untereinheiten, UE) Proteine mit 2 UE bezeichnet man als dimere, Proteine mit 4 UE als tetramere Proteine usw. Funktion: ▪ Aufbau von komplexen Proteinen aus den gleichen einfachen Untereinheiten, z.B. von fibrillären aus einzelnen globulären Proteinen ▪ gegenseitige regulatorische Beeinflussung der Untereinheiten Hämoglobin (Beispiel: Hämoglobin) ▪ Regulation der Stabilität eines Proteins Quelle: Löffler  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Abhängig von der Stärke der Bindungen können Qartärstrukturen stabil oder z. B. durch äußere Einflüsse leicht reversibel sein. Viele Vorgänge im Körper basieren auf reversiblen Protein-Protein- Wechselwirkungen.  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Wie lassen sich Proteingemische im Labor trennen bzw. einzelne Proteine aufreinigen? MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Gel(permations)chromatographie MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Ionenaustauschchromatographie MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Affinitäts- chromatographie  MaReCuM Medizinische Fakultät Mannheim Summarium Aminosäuren (AS) sind denkbar wichtig und interessant. 2020 Sie müssen die Strukturformeln aller proteinogenen Aminosäuren kennen. Fragen Was sind AS, welche sind proteinogen? Welche AS ist achiral, welche Konfiguration haben alle übrigen proteinogen AS am a-C-Atom? Welche AS sind unpolar, welche polaren AS sind neutral, negativ bzw. positiv geladen? Welche AS sind essentiell? Welche AS können (in Proteinen) mit Kohlenhydraten verknüpft werden? Welche AS können (in Proteinen) Phosphorsäureester bilden? Was bedeutet Zwitterion, pKs-Wert, isoelektrischer Punkt der AS? Was ist die Primärstrukur der Proteine? Wie ist sie determiniert? Was ist die Peptidbindung? Welche Besonderheit besitzt sie? Um welche Bindungen sind Proteine in der Hauptkette drehbar und können dadurch unterschiedliche Konformationen einnehmen? Was bedeutet Sekundärstruktur der Proteine? Welche beide sind die wichtigsten? Durch welche Bindungen werden sie ausgebildet? Was bedeutet Tertiärstruktur der Proteine? Durch welche Bindungen wird sie ausgebildet? Welche besondere Bedeutung hat Cystein für die Tertiärstruktur? Was ist die Aussage des Experiments von Anfinsen? Was sind Domänen innerhalb von Proteinen? Was bedeutet Quartärstruktur der Proteine? Durch welche Bindungen wird sie hervorgerufen?