Lezione 10 - Microbiologia - 21/04/2021 PDF

Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 GENETICA MICROBICA Se consideriamo il materiale genetico dei microrganismi, possiamo identificare 2 pool genici differenti:...

Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 GENETICA MICROBICA Se consideriamo il materiale genetico dei microrganismi, possiamo identificare 2 pool genici differenti: Pool genico CORE: rappresentato dal cromosoma. Codifica per processi fisiologici essenziali per la sopravvivenza della cellula (ad esempio la sintesi dei ribosomi, la sintesi del rivestimento cellulare come la parete, le vie metaboliche chiave, la replicazione del DNA e il turnover dei nucleotidi); Pool genico FLESSIBILE: costituito da elementi genetici mobili. Codifica per processi fisiologici che non sono essenziali per la sopravvivenza della cellula ma che conferiscono caratteristiche fenotipiche che ne migliorano la sopravvivenza in particolari ambienti e nicchie (ad esempio nel corpo umano, per Processi fisiologici essenziali Processi fisiologici richiesti per quanto riguarda i patogeni). Gli elementi richiesti per la sopravvivenza la sopravvivenza in ambienti genetici mobili coinvolti sono diversi: isole specifici (NICCHIE) genomiche (come le isole di patogenicità, sequenze genetiche che contengono geni che codificano per fattori di virulenza come ad esempio tossine), DNA dei fagi (i virus dei batteri, che possono integrare il loro genoma nel cromosoma batterico), e altri elementi genetici mobili come i plasmidi, gli integroni e i trasposoni. Le caratteristiche conferite grazie al pool flessibile sono quindi la patogenicità, la resistenza agli antibiotici (i geni che conferiscono la resistenza agli antibiotici possono essere per esempio presenti all’interno dei plasmidi), la capacità di degradare diverse sostanze (anche tossiche) presenti in natura, ed altre. L’EVOLUZIONE DEL BATTERIO Se consideriamo tutti i microrganismi ad oggi viventi, questi derivano da un comune batterio ancestrale, un progenitore. Pertanto, microrganismi dotati di diversi stili di vita (come la capacità di vivere all’interno di cellule, per i batteri intra-cellulari, oppure batteri extra-cellulari, patogeni, facoltativi) sono dovuti a 3 principali eventi che ne hanno permesso la loro evoluzione: La riduzione del genoma attraverso eventi di delezione: partendo da un comune batterio ancestrale, si sono perse alcune caratteristiche genetiche; L’acquisizione genica attraverso il trasferimento genico orizzontale; L’acquisizione genica attraverso mutazioni puntiformi o riarrangiamenti. 1 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Ad esempio, se consideriamo ceppi enterici patogeni per l’uomo, vediamo come questi siano derivati da un comune batterio ancestrale progenitore. Troviamo ceppi di Escherichia Coli, un batterio commensale nell’intestino dell’uomo, ma vi sono anche alcuni ceppi patogeni come gli enteri invasivi (EIEC), gli uropatogeni (UPEC) (responsabili di infezioni urinarie come cistiti pielonefriti); ne derivano anche altri generi di batteri enterici come Shigella, Salmonella enterica ecc. Questi diversi organismi si sono evoluti o per l’acquisizione di elementi genetici mobili o per la perdita di geni considerati non essenziali, acquisendo così diversi stili di vita: patogeni facoltativi intracellulari, patogeni extracellulari, patogeni intracellulari obbligati o patogeni intracellulari facoltativi. Ad esempio lo stesso Shigella, un batterio enterico responsabile di dissenteria, è derivato da un comune batterio ancestrale di Escherichia Coli, in seguito ad eventi di acquisizione di isole di patogenicità, di plasmidi di virulenza e in seguito a delezione di altri elementi genetici. IL TRASFERIMENTO GENICO ORIZZONTALE Per trasferimento genico orizzontale si intende lo scambio di materiale genetico fra i microrganismi di una popolazione. Non è un evento necessario per completare il ciclo vitale nei procarioti, mentre è indispensabile negli eucarioti. È considerato un evento occasionale, tale per cui una porzione di genoma di una cellula donatrice viene trasferita ad una cellula ricevente. Identifichiamo 3 principali meccanismi: La trasformazione: il processo per cui molecole di DNA libere provenienti da una cellula donatrice, vengono trasferite, incorporate ed integrate in una cellula ricevente. È l’unico dei 3 processi codificato dai geni del cromosoma batterico. La trasduzione: il processo in cui il DNA viene trasferito da un microrganismo all’altro grazie alla mediazione di un virus, in particolare da batteriofagi: i virus dei batteri. Questo processo è codificato da geni presenti nel genoma virale. La coniugazione: il processo di trasferimento di DNA che avviene mediante il contatto cellula donatrice-cellula ricevente. Distinguiamo inoltre il trasferimento plasmidico, ovvero quando da una cellula donatrice si trasferisce un plasmide (piccola molecola di DNA extracromosomiale) ad una cellula ricevente; Si parla invece di trasferimento cromosomico quando è una porzione di cromosoma della cellula donatrice ad essere trasferita ad una cellula ricevente. Questo avviene quando nella cellula donatrice, il plasmide è integrato nel cromosoma batterico. In entrambi i casi, la coniugazione è un processo codificato da geni contenuti nei plasmidi. 2 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 LA TRASFORMAZIONE È il processo per il quale molecole di DNA libere, provenienti da una cellula donatrice, vengono incorporate e integrate nel genoma di una cellula ricevente, detta trasformante. La scoperta: È stata scoperta da Griffith nel 1928, studiando lo Streptococcus pneumoniae, un patogeno diplococco gram-positivo responsabile di diverse patologie (tra cui polmoniti) e uno dei tre principali agenti batterici responsabili di meningiti (ad oggi è infatti obbligatorio il vaccino per i nuovi nati). Streptococcus pneumoniae si può presentare in 2 forme: una forma capsulata, patogena per il topo e per l’uomo, ed una forma non capsulata, non patogena. La virulenza dipende perciò dalla presenza di una capsula polisaccaridica. ioavemogià usa INS at 3 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Le colonie prodotte dalle due forme appaiono differenti: le forme capsulate originano colonie lisce (indicate con S), mentre le colonie rugose (indicate con R) sono tipiche delle forme senza capsula (avirulenti per l’uomo e per il topo). Cosa osservò Griffith? (a) Si osservò che se il topo viene inoculato con ceppi capsulati vivi, il topo muore. (b) Se invece viene inoculato con ceppi senza capsula (R) vivi (non virulenti), il topo sopravvive. (c) Se i ceppi S vengono uccisi al calore e inoculati nell’animale, questo sopravvive. O (d) Invece l’iniezione di ceppi S uccisi al calore e ceppi R vivi, causano la morte dell’animale. (e) E dall’animale si isolano cellule capsulate vive. Quindi Griffith intuì che i batteri uccisi al calore, i ceppi S, contenevano una sostanza che chiamò principio trasformante, capace di trasformare i batteri di tipo R in virulenti di tipo S. Nelle cellule capsulate uccise c’era quindi qualcosa in grado di modificare i ceppi R acapsulati in ceppi S virulenti. Successivamente, nel 1944, altri scienziati, in vitro, dimostrarono che il principio trasformante era il DNA, in particolare quello della cellula donatrice che si era integrato nella cellula ricevente R e, conferendole la capacità di sintetizzare la capsula polisaccaridica, le dava resistenza. In natura la trasformazione è stata descritta sia in batteri gram-positivi (come Streptococcus pneumoniae o Bacillus subtilis) sia in gram-negativi (come Haemophilus influenzae o Neisseria gonorrhoeae). LA COMPETENZA I batteri non sono sempre trasformabili, ossia capaci di assumere DNA libero, ma devono trovarsi in un particolare periodo del loro ciclo vitale, detto competenza, che è lo stato fisiologico per cui i microrganismi sono capaci di assumere DNA dall’ambiente. Inoltre non tutti i batteri sono naturalmente competenti. Ad esempio Escherichia Coli (ed altri batteri), non presenta una trasformazione naturale ma viene reso competente in maniera artificiale in laboratorio, utilizzando alte concentrazioni di ioni metallici come il Calcio, a temperature opportune. Viene quindi reso competente in presenza di sali di Calcio, cationi divalenti. È una pratica molto eseguita in laboratorio: 4 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 - Cellule di Escherichia Coli vengono raccolte in fase esponenziale, trattate a freddo con soluzioni di cloruro di Calcio e così il batterio diventa permeabile al DNA esogeno. - Successivamente, l’ingresso del DNA esogeno nel batterio, può essere reso possibile attraverso processi di elettroporazione o shock termico a 42°C. Immaginiamo ad esempio che, attraverso lo shock termico, si voglia inserire nel batterio un DNA che conferisce resistenza alla penicillina. - Si selezioneranno i mutanti resistenti, piastrando i batteri in terreni contenenti penicillina. Elettroporazione Shock termico trasformazione LA REGOLAZIONE DELLA COMPETENZA La competenza è considerata come uno stato fisiologico in cui i batteri possono essere trasformati ed è una capacità geneticamente programmata, in cui sono coinvolti numerosi geni codificanti sia componenti regolatorie che strutturali. In particolare, è stata studiata la regolazione della competenza in un batterio gram-positivo: Bacillus subtilis. In Bacillus subtilis la regolazione della competenza avviene attraverso un sistema regolatore a due componenti. Si è visto che Bacillus subtilis, in condizioni di alta densità cellulare, rilascia nell’ambiente dei piccoli peptidi, chiamati feromoni di competenza (in questo caso ComX e CSF). Le cellule riceventi diventano competenti solo in presenza di alte concentrazioni di questi peptidi, il che assicura il fatto che la cellula sia in grado di catturare DNA quando vicine ci sono altre cellule di Bacillus subtilis che rilasciano il DNA. Perciò alte concentrazioni di feromoni di competenza inducono lo stato fisiologico di competenza nelle altre cellule, con cui entrano in contatto. 5 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Il primo feromone, ComX, è codificato dal gene ComX, che codifica per un lungo polipeptide tagliato da una proteasi, codificata da ComQ. Il prodotto di taglio è il feromone ComX, il quale rappresenta il segnale per la fosforilazione di una proteina sensore di membrana: ComP. ComP rappresenta una chinasi sensore che si auto-fosforila. O Il fosforile di ComP (ComP~P) viene trasferito a ComA, che rappresenta la proteina regolatrice di risposta. ComA fosforilata (ComA~P) rappresenta un attivatore trascrizionale per alcuni geni, tra cui l’operone srfA, richiesto per la competenza. srfA induce l’espressione della proteina ComK, un fattore trascrizionale che regola la trascrizione di geni strutturali coinvolti nella cattura del DNA (come ComG, ComE, ecc). Il secondo feromone di competenza, chiamato CSF (“fattore che stimola la competenza”) (prodotto da Bacillus Subtilis, dal gene PhrC), viene trasportato nella cellula attraverso una permeasi Spo0K. CSF avrà azione su ComA fosforilato (ComA~P). Spo0K è un gene richiesto sia per lo sviluppo della competenza che per la sporulazione durante la fase stazionaria di Bacillus subtilis. Si è visto che in Bacillus subtilis, circa il 20% dei batteri diventano così competenti e restano tali per varie ore. In Streptococcus pneumoniae, il 100% dei batteri diventano competenti ma restano tali solo per pochi minuti. Per quanto riguarda la frequenza di trasformazione, questa è intorno allo 0.1-1%. MECCANISMI DI TRASFORMAZIONE Si distingue tra trasformazione in batteri gram-positivi e gram-negativi: Trasformazione in batteri gram-positivi: Cellule donatrici rilasciano per lisi il DNA a doppio filamento. Una molecola di DNA si lega a recettori specifici, chiamati DNA binding proteins (“proteine che legano il DNA”). Il DNA legato viene rotto in piccoli pezzi da un’endonucleasi, mentre autolisine rompono la parete del batterio e un’esonucleasi degrada uno dei due filamenti di DNA complementari. Così un solo strand di DNA penetra nel citoplasma della cellula. Una volta nel citoplasma, il filamento di DNA si associa a una proteina specifica della competenza, chiamata SSB, che lo protegge dall’’attacco delle nucleasi, fino a quando raggiunge il cromosoma della cellula. Poi le proteine SSB vengono sostituite da RecA, che ha un ruolo importante nella ricombinazione omologa. A questo punto, è possibile che avvenga l’integrazione del filamento di DNA per ricombinazione, tramite appaiamento di regioni omologhe (il processo avviene se sono presenti regioni di omologia con i geni della cellula). Si forma quindi un eteroduplice: un filamento formato da un filamento parentale e da uno nuovo. Si ha quindi la sostituzione di un tratto di DNA, e lo strand sostituito viene degradato. 6 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Tornando all’esperimento di Griffith, il ceppo R rugoso ha assunto copie di geni, provenienti dalla cellula donatrice, tali da permettere la formazione della capsula. Nel citoplasma entra quindi un solo filamento di DNA lineare, nei gram-positivi qualsiasi porzione di DNA può essere introdotta. Trasformazione in batteri gram-negativi: Non esistono fattori di competenza, le cellule gram-negative sono naturalmente competenti quando crescono su terreno arricchito. In questo caso, il DNA a doppia elica si lega a recettori specifici che si trovano su vescicole, chiamate trasformasomi. Questi sono protrusioni della membrana esterna. Si cattura DNA a doppia elica di dimensioni tra i 30 e i 50 kb. Nelle vescicole entra il DNA a doppia elica, ma solo uno strand entra nella cellula, dove può avvenire l’integrazione nel DNA cellulare. La ricombinazione è un processo molto veloce (si stima intorno ai 5 minuti). Si ha quindi la produzione di ricombinanti. A differenza dei gram-positivi, il DNA che si lega ai gram-negativi è specifico: non può entrare qualsiasi porzione di DNA (come nei gram- positivi). Si è infatti visto in Neisseria gonorrhoeae e in Haemophilus influenzae, due batteri gram-negativi, che questi catturano solo DNA della propria specie perché sono richieste specifiche sequenze di attacco di circa 11 basi, ripetute molte volte nel cromosoma. LA CATTURA DEL DNA In questa immagine si vedono nel dettaglio le proteine coinvolte nell’uptake o cattura del DNA: Gram positivi: vi è un gene che codifica per la proteina ComEA, che lega direttamente il DNA a doppia elica ed è collocata sul peptidoglicano. ComG, anch’essa sul peptidoglicano, forma una struttura a canale, contenente un poro per permettere al DNA di muoversi attraverso il peptidoglicano e penetrare. Tra il peptidoglicano e la membrana citoplasmatica, vi è l’esonucleasi, la quale è in grado di degradare un filamento di DNA. Il singolo filamento di DNA restante penetra nella membrana citoplasmatica per mezzo di un’altra proteina canale, ComEC. 7 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Gram negativi: il processo è simile ma vi è un’ulteriore membrana di rivestimento, la membrana esterna della parete cellulare. Lì si trova una proteina canale, PilQ. A livello del peptidoglicano, vi è un’altra proteina canale, PilE (analoga a ComG) (le proteine si chiamano Pil perché anche coinvolte nella formazione dei pili). L’esonucleasi degrada uno dei due filamenti, il restante penetra verso la membrana citoplasmatica attraverso la proteina canale ComA (analoga a ComEC). COME SI MANIFESTANO I TRASFERIMENTI GENETICI Comprendiamo che è avvenuto un trasferimento genetico tra due batteri attraverso il cambiamento fenotipico. Immaginiamo di avere una cellula donatrice, un ceppo selvatico, in questo caso triptofano positiva (Trp+). Il ceppo è considerato un prototrofo, ossia è capace di sintetizzare tutti Cellule riceventi gli enzimi necessari per una determinata via Trp+ metabolica. Incrociamo il DNA proveniente dalla cellula donatrice prototrofa, con una cellula ricevente triptofano negativa (Trp-) auxotrofa, mutante nutrizionale. Ossia ha perso la capacità di sintetizzare l’enzima per una determinata via metabolica. Come si vede, le cellule Trp- non sono in grado di crescere su terreno con agar privo di triptofano. Per permetterne la crescita occorre quindi addizionare al terreno l’amminoacido, perché non lo sintetizza. Invece, le cellule Trp+ sono in grado di crescere sul terreno minimo. Dopo aver incrociato DNA da cellule Trp+ con cellule Trp-, se avviene il trasferimento genetico con ricombinazione, si ha la variazione della composizione genetica del ricevente e la comparsa di tipi ricombinanti. Compare quindi la reversione del fenotipo: da auxotrofo a prototrofo per un determinato amminoacido. In particolare, la capacità di crescere su terreno minimo evidenzia la capacità di sintesi di enzimi e manifesta la trasformazione avvenuta. Le cellule riceventi sono ora Trp+ (triptofano positive) perché capaci di crescere su terreno con agar privo di triptofano. 8 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 L’ESPERIMENTO Questo è l’esperimento con cui si è dimostrato che solo il DNA a doppio filamento può legarsi a specifici recettori sulla cellula, e trasformare le cellule riceventi. Come viene eseguito? Consiste nel miscelare DNA proveniente da una cellula donatrice Arginina+ con una cellula ricevente Arginina-; Successivamente, la miscela viene trattata con DNAsi che degrada il DNA esogeno a vari tempi (ad ogni tempo, 1,2,3, ecc, si aggiunge la DNasi); Poi si estrae il DNA dalla cellula e si miscela con cellule riceventi Arginina- (Arginina negative); Infine si selezionano i trasformanti Arginina+ sul terreno minimo (quindi senza addizionare Arginina come supplemento di crescita). I trasformanti che appaiono saranno quindi dovuti alla presenza del DNA della cellula donatrice, integrato nella cellula ricevente. Al tempo 1, la DNAsi viene addizionata quando il DNA Arginina+ è ancora extracellulare, quindi viene totalmente degradato. Infatti non si osservano trasformanti con i processi successivi. Al tempo 2 invece, la DNAsi viene addizionata quando il DNA Arginina+ è già penetrato nella cellula, perciò quest’ultimo non viene degradato dalla DNAsi. Il DNA, come si osserva, viene estratto quando non si è ancora integrato: dall’estrazione del DNA abbiamo DNA Arginina+ a singolo filamento. E se questo viene unito con una cellula ricevente Arginina-, non si osservano trasformanti. Al tempo 3, di nuovo la DNAsi viene aggiunta quando il DNA Arginina+ e già penetrato nella cellula e si è integrato. Dall’estrazione del DNA, osservo che il DNA Arginina+ si è integrato ed è a doppio filamento. Si vede come il frammento di DNA a doppio filamento è capace di trasformare la cellula ricevente perché lega i recettori specifici, e così può avvenire la trasformazione e si ottengono trasformanti Arginina+. IL RUOLO DELLA TRASFORMAZIONE IN NATURA Per quale motivo in natura dei batteri devono catturare molecole di DNA esogeno? Si sono fatte diverse ipotesi: 9 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 NUTRIZIONE? La prima ipotesi è che questo processo avvenga per nutrizione: il DNA viene dunque impiegato come fonte di Carbonio e Azoto. Tuttavia la degradazione del DNA è un evento difficoltoso e questo non spiegherebbe come alcuni batteri, per esempio i Gram negativi, siano in grado di catturare solo DNA della propria specie; RIPARO DEL DNA? Un altro possibile ruolo della trasformazione è il riparo dei danni del DNA. Immaginiamo ad esempio di esporre una cellula a raggi UV, i quali uccidono i microrganismi e danneggiano il DNA inducendone la formazione di dimeri di Timina. Alcuni batteri per questa ragione muoiono, rilasciando nell’ambiente porzioni di DNA danneggiato e porzioni di DNA non danneggiato. È possibile che quest’ultime vengano catturate da una cellula ricevente e saranno poi in grado di riparare per ricombinazione le sequenze danneggiate della stessa cellula ricevente, e così far sopravvivere i batteri. Questo spiegherebbe la ragione per la quale alcuni batteri catturano DNA della propria specie, che in generale è il solo che può partecipare al riparo. RICOMBINAZIONE? Una terza ipotesi è che la trasformazione naturale avvenga per ricombinazione, per aumentare la biodiversità della specie batterica. Un processo finalizzato quindi all’assemblaggio di nuove combinazioni di geni. Questo ruolo spiegherebbe un evento in natura, mediato dalla trasformazione, che è la variabilità antigenica dei pili di Neisseria gonorrhoeae: la trasformazione nel batterio può favorire la variabilità antigenica per evadere la risposta immunitaria dell’ospite. Nei pili, che sono delle appendici di attacco che permettono alla cellula batterica di attaccarsi alle cellule epiteliali, la subunità maggiore, detta pilina, è codificata dal gene PilE. Tuttavia nel genoma di Neisseria gonorrhoeae sono anche presenti copie silenti di PilS. Queste sono copie di PilE che hanno sequenze conservate con PilE, ma anche zone variabili. È dunque possibile la ricombinazione tra i geni PilE e il gene PilS (dello stesso ceppo o di ceppo diverso) per produrre diverse proteine di pilina. Pertanto, il batterio può evadere la risposta immunitaria dell’ospite. 10 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 LA TRASDUZIONE È il secondo meccanismo di trasferimento genico orizzontale ed è il trasferimento genetico mediato dai virus dei procarioti, i batteriofagi, detti anche fagi. Nell’immagine un batteriofago: è l’unico tipo di virus che presenta questa morfologia, caratterizzata da una testa contenente il materiale genetico, da un corpo e da appendici con cui aderisce alle cellule batteriche. Parlando di virologia generale, comunemente i virus patogeni per l’uomo non presentano questa struttura ma hanno esclusivamente una capside (caratterizzato in alcuni casi da un ulteriore rivestimento, detto pericapside) senza avere un corpo o appendici. La trasduzione può essere di due tipi: generalizzata o specializzata. Questi due tipi differenti si verificano in seguito ad errori, compiuti durante il ciclo replicativo dei batteriofagi. I batteriofagi sono caratterizzati da due stili di vita: presentano il ciclo litico o il ciclo lisogenico. In seguito agli errori compiuti nei due cicli, si ottiene la produzione di particelle fagiche trasducenti, le quali contengono, al posto del genoma fagico, parte del cromosoma batterico. La trasduzione generalizzata avviene in seguito ad un errore compiuto durante il ciclo litico. In questo caso, qualsiasi gene batterico può essere trasferito da un batterio all’altro mediante il fago. La trasduzione specializzata avviene invece in seguito ad un errore compiuto durante il ciclo lisogenico. Qua solo determinate sequenze del cromosoma batterico possono essere trasferite. Comune ai due cicli: Un batteriofago infetta una cellula batterica, si ha l’attacco del virus al rivestimento del batterio. Il fago inietta l’informazione genetica all’interno della cellula batterica. 11  Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Nel caso di un ciclo litico: La presenza dell’informazione genetica fagica nella cellula batterica altera la fisiologia dell’ospite. - Il genoma virale si replica, con produzione di nuove particelle fagiche. - Verranno sintetizzate le proteine del rivestimento capsidico e si avrà il successivo assemblaggio delle particelle virali. - La progenie virale fagica figlia viene rilasciata nell’ambiente per lisi della cellula infettata. - A loro volta le nuove particelle fagiche andranno ad infettare nuove cellule. Durante la replicazione del genoma fagico, si formano lunghi filamenti di DNA, detti concatameri. I concatameri sono caratterizzati dalla ripetizione di un’unità genomica di dimensione fissa. Successivamente il concatamero viene tagliato da enzimi virali, che riconoscono specifici siti, detti Tupac siti Pac. Ciascuna unità genomica viene incorporata nella testa del fago, pertanto si parla di “impacchettamento a testa piena” (la quantità di DNA che può essere incorporata nella testa di un fago dipende dalle dimensioni di quest’ultima). Tuttavia, gli enzimi virali che tagliano il genoma, possono non essere così specifici e per errore possono tagliare il cromosoma batterico, che presenta sequenze simili. Se la porzione di DNA di cromosoma batterico è delle giuste dimensioni, può essere inserita nella testa del fago al posto del genoma fagico. In questo modo si genera una particella fagica trasducente, che al posto del genoma fagico contiene il genoma batterico. Nel caso della trasduzione generalizzata, l’errore viene compiuto durante il ciclo litico e avviene nel corso del montaggio delle particelle virali. È un errore di impacchettamento del DNA. A sua volta la particella difettiva trasducente (definita difettiva perché non contiene più il genoma fagico) può infettare una nuova cellula batterica, iniettando il DNA ricevuto per errore. È possibile la ricombinazione genica col DNA ospite tramite due o più crossing over, se vi è omologia di sequenza. Si genera così una cellula batterica trasducente. Quindi se avviene ricombinazione, si ha integrazione di DNA a doppia elica e il batterio ricevente acquisirà un fenotipo diverso. La trasduzione può invece essere abortiva, quando non si ha ricombinazione, nè integrazione e i geni del donatore verranno persi, perché non saranno in grado di replicarsi autonomamente (sono porzioni di DNA batterico). Nell’immagine si vede il fago che infetta una cellula batterica iniettando il proprio genoma. In seguito a replicazione del DNA, si genera la progenie fagica. Per errore viene incorporata una porzione di DNA batterico in una particella fagica trasducente. Una volta che il batterio muore per lisi, rilascia la progenie e, in questo caso, una piccola percentuale di particelle fagiche trasducenti possono a loro volta infettare una nuova cellula batterica. Il processo avviene con l’iniezione dell’informazione 12 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 genetica, costituita da DNA batterico della cellula donatrice, e può o meno avvenire la ricombinazione. Se avviene, si ha trasferimento genico orizzontale. LA FREQUENZA DI TRASDUZIONE La frequenza di trasduzione è bassa, si stima circa una cellula/106 o 108. Ciò per due motivi: perché gli errori di impacchettamento sono rari e perché il DNA trasdotto deve mantenersi integro e sopravvivere nella cellula ricevente, per poi formare un trasducente stabile (il fago quindi non deve degradare completamente il DNA dell’ospite dopo l’infezione). Un esempio di trasduzione generalizzata: In questo caso un fago infetta un batterio prototrofo per la sintesi del Triptofano. Si ha la riproduzione del fago e, per errore, si ha l’incorporazione del DNA batterica (dell’operone per la sintesi del Trp, Trp+) in una particella fagica trasducente. Questa, può infettare una cellula ricevente auxotrofa per il Trp (una cellula ricevente Trp-), e iniettarvi il proprio contenuto genetico. Può avvenire ricombinazione e il DNA della cellula donatrice si integra in quello della ricevente, che ora sarà capace di crescere in assenza di Trp. Si ha una situazione di diploidia parziale, con due crossing over, uno scambio fenotipico e la cellula ricevente che diventa prototrofa per il Trp. CARATTERISTICHE DEI FAGI P1 E P22 Nella tabella si vedono due buoni fagi trasducenti: P1, il fago di Escherichia coli, P22, il fago di Salmonella typhimurium (entrambi batteri enterici). Le caratteristiche: - La lunghezza del DNA impacchettato: è differente, e dipende, come già detto, dalla dimensione della testa del fago. - La percentuale in lunghezza del cromosoma che viene trasdotto: molto bassa. - L’impacchettamento: a testa piena per entrambi i due fagi. - La percentuale di particelle trasducenti nel lisato e la percentuale di DNA trasdotto che ricombina nel cromosoma della cellula ricevente: bassa. 13 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 PROBABILITÀ DI TRASDUZIONE La trasduzione è più probabile quando la molteplicità di infezione fagica è bassa. Per molteplicità di infezione (MOI, Molteplicity Of Infection) si intende il numero di virus rispetto al numero di batteri che vengono infettati (ed è una terminologia che viene utilizzata anche per i virus patogeni per l’uomo). Perché è più probabile? È più probabile perchè una cellula ospite viene infettata solo da una particella fagica, se invece abbiamo infezioni multiple è probabile che avvenga la lisi da parte delle particelle fagiche normali. Inoltre, la trasduzione permette anche di stabilire la mappatura genica del cromosoma batterico e quindi l’ordine di distanza tra i suoi geni. I fagi che compiono il ciclo litico vengono detti virulenti. Ciclo lisogenico: I fagi capaci di ciclo lisogenico vengono detti temperati. Un esempio di fago temperato è il fago lambda. Un fago a DNA a doppia elica, che infetta Escherichia coli. Nel caso dei fagi temperati, dopo aver iniettato il proprio genoma, questo non si replica all’interno della cellula batterica, ma si può integrare nel cromosoma batterico. Lo step cruciale del ciclo lisogenico è infatti l’integrazione. Il genoma fagico nello stato integrato viene detto profago. Una volta che il profago è integrato, si replicherà con il cromosoma e potrà essere ereditato dalle cellule batteriche figlie. L’integrazione avviene mediante ricombinazione sito specifica, per sequenze omologhe tra il fago lambda e il cromosoma batterico. La ricombinazione sito specifica non è casuale, in particolare il fago lambda si integra tra l’operone del galattosio e l’operone per la biotina. L’INDUZIONE Il processo di integrazione del profago è reversibile. Questo perché occasionalmente, nella popolazione dei batteri infettati da un fago temperato, può esserci l’induzione dell’espressione dei geni fagici e si può passare da ciclo lisogenico a litico. 14 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Quindi, in seguito a induzione (solitamente da parte di stimoli ambientali), il genoma del fago si circolarizza e va incontro ad escissione (si stacca): ritorna quindi ad essere un elemento genetico indipendente che si replica autonomamente e capace di dare origine alla progenie fagica, che causa la lisi della cellula e il rilascio delle particelle fagiche nell’ambiente. Tuttavia è possibile, anche se è un evento raro, che ci siano errori di escissione. Significa che una porzione di DNA del cromosoma batterico viene scissa insieme a parte del genoma fagico. Se una porzione del DNA si stacca, nel cromosoma batterico resterà una porzione di genoma fagico. Si genera quindi una progenie di particelle fagiche trasducenti, ciascuna con una porzione di cromosoma batterico. Queste particelle fagiche sono difettive (così come quelle generate in seguito all’errore di montaggio) perché manca loro una parte di genoma fagico. In seguito ad errore di escissione si ha perciò la generazione di genomi fagici difettivi, in cui parte del patrimonio genomico fagico è sostituito da geni batterici. La generazione della particella fagica λdgal: λ: nome del fago, d: difettiva, gal: ha incorporato l’operone galattosio. Nel caso della trasduzione specializzata, vengono generate delle particelle fagiche trasducenti contenenti sequenze specifiche di DNA batterico. Queste sono le sequenze adiacenti al profago, poiché quando avviene un errore di escissione, si può generare un genoma fagico difettivo che contiene o l’operone gal (che si trova alla sx del profago) o l’operone biotina (alla dx). Si possono generare due tipi di particelle fagiche trasducenti che formano l’operone gal o l’operone bio, a seconda dell’errore compiuto durante il distacco del profago. Quindi, le particelle fagiche trasducenti possono a loro volta infettare nuove cellule. In realtà, nella particella fagica trasducente, una buona quantità di DNA fagico deve conservarsi per produrre il capside, le proteine, ecc. Esiste perciò un limite massimo di quantità di DNA fagico da sostituire col DNA dell’ospite. 15 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Tuttavia, la particella fagica trasducente può anche infettare una cellula in presenza di fagi normali helper (ossia fagi lambda originali, wild type). In questo modo basta avere una quota molto ridotta di genoma fagico (in particolare le regioni per l’integrazione, l’estremità adesive per l’impacchettamento e l’origine di replicazione). Se infetta una cellula auxotrofa per il galattosio, λdgal inietta nella cellula batterica il DNA, che si circolarizza, e può avvenire ricombinazione (in seguito ad integrazione). Si ha, dunque, la formazione di diploidi per la regione galattosio e la cellula ricevente batterica diviene quindi in grado di usare il galattosio come fonte di carbonio. SINDROME DA SHOCK TOSSICO Attraverso i meccanismi di trasferimento genico orizzontale, quali la trasduzione, alcuni batteri patogeni per l’uomo hanno acquisito i fattori di virulenza. Questo è il caso di Staphylococcus aureus, responsabile della Sindrome da shock tossico. Alcuni ceppi di Staphylococcus aureus, in grado di sintetizzare la tossina della Sindrome, possono causare questa rara ma grave patologia: è un’infezione fatale con coinvolgimento del tessuto cutaneo e di quello molle. In particolare la Sindrome è dovuta alla tossina della sindrome da shock tossico, chiamata TSSST-1. Il gene che codifica per questa tossina è contenuto in un’isola di patogenicità, IP-1 di S. aureus. I batteri possono acquisirla tramite un fenomeno di trasduzione generalizzata, mediata dal batteriofago dello stafilococco. Si immagini di avere una cellula batterica con l’isola di patogenicità: attL PI1 attR Questa viene infettata da un fago; PI1 excises and replicates Per errore di montaggio, l’isola di during 80 infection patogenicità contenente il gene per la tossina può essere incorporata nella testa del fago; Si generano così particelle fagiche PI1 is packaged into trasducenti, che potranno poi infettare 80 phage particles nuove cellule batteriche di S. aureus e trasferire il gene responsabile della sintesi della tossina. CONVERSIONE FAGICA Per conversione fagica si intende un fenomeno analogo alla trasduzione specializzata. In particolare, è l’acquisizione di nuovi caratteri fenotipici da parte di una cellula batterica, in seguito a lisogenizzazione di un fago temperato e la sua integrazione a stato di profago. 16 Matilde Doria/Lorena Munaro – Lezione 10 – MICROBIOLOGIA (Prof. David Lembo) – 21/04/2021 Le caratteristiche acquisite possono essere ad esempio l’immunità: un batterio lisogeno diventa immune ad un’ulteriore infezione da parte dello stesso tipo di fago. Oppure si possono acquisire nuove caratteristiche fenotipiche, come la capacità di sintetizzare delle tossine (come nel caso della tossina difterica). L’esempio di Corynebacterium diphteriae Possiamo osservare un ceppo di Corynebacterium diphteriae, insertion l’agente responsabile della difterite, non patogeno. site In seguito all’infezione ed integrazione del genoma del fago beta allo stato di profago, il batterio acquisisce la capacità di sintetizzare la tossina difterica. Corynebacterium diphteriae La tossina è tossica per l’uomo perché inibisce la sintesi proteica Non patogeno negli eucarioti. La lisogenia è spesso quindi una condizione normale che può toxin essere essenziale per la sopravvivenza in natura, in questo caso Fago prophage nel corpo umano, conferendo patogenicità. Corynebacterium diphteriae L’esempio di Vibrio choloreae Vibrio choloreae acquisisce diverse caratteristiche fenotipiche in seguito a conversione fagica da parte del fago CTX, codificante la tossina colerica. Vibrio choloreae è infatti responsabile del colera, caratterizzata da una diarrea acquosa con feci ad “acqua di riso”. Il paziente perde un numero elevato di litri di acqua. La patogenicità è quindi mediata dalla tossina colerica, quindi il batterio acquisisce capacità di sintesi della tossina grazie all’integrazione del genoma del fago temperato. 17