La Biologie Cellulaire - PDF

La Biologie Cellulaire  Définition et Historique La biologie cellulaire, ou cytologie, est la science qui étudie les unités structurales et fonctionnelles communes à l'organisation de tous les êtres vivants Antonie van Leeuwenhoek (1632 -...

La Biologie Cellulaire  Définition et Historique La biologie cellulaire, ou cytologie, est la science qui étudie les unités structurales et fonctionnelles communes à l'organisation de tous les êtres vivants Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723)  Quelques notions Tous les êtres vivants, à tous les niveaux d’organisation, sont constitués de cellules Toute cellule possède tout ce qu’il faut pour vivre, à nuancer Ils existent des êtres unicellulaires (très nombreux), et des êtres pluricellulaires Les êtres unicellulaires sont « autonomes », les êtres pluricellulaires sont constitués de différentes cellules, qui dépendent les unes des autres pour rester en vie Toute cellule évolue dans un un milieu (intérieur ou extérieur), auquel elle doit son apparente autonomie Cellule et milieu environnant forment un système  Selon Christian de Duve Tout système pour vivre doit pouvoir 1- élaborer ses propres constituants à partir de matériaux disponibles autour de lui ; 2- extraire de l’énergie de son milieu environnant et la convertir dans les diverses formes de travail qu’il doit accomplir pour rester en vie ; 3- catalyser les nombreuses réactions chimiques nécessaires à ses activités ; 4- informer ses processus biosynthétiques et autres d’une manière telle que sa reproduction précise soit garantie 5- s’isoler de manière à conserver un contrôle strict sur ses échanges avec l’extérieur ; 6- exercer sur ses activités une régulation telle que son organisation dynamique soit maintenue en dépit de variations du milieu ; 7- se multiplier  Genèses et types cellulaires 1- Procaryote (y compris les cyanobactéries) , - Les plus anciennes sur terre (3,5 Milliards d’années) - Sont restés les seules formes de vie durant plus d’un milliard d’années - Pas de structure nucléaire - Pas de compartimentalisation - Les synthèses ADN-ARN- Protéine se font en série - Des transferts horizontaux fréquents - Déplacement - Formes de résistence -. -. -. Un plasmide désigne une molécule d'ADN distincte de l'ADN chromosomique, capable de réplication autonome. Le terme plasmide fut introduit par le biologiste moléculaire américain Joshua Lederberg en 1952, Découverte de la conjugaison bactérienne, Nobel en 58  Genèses et types cellulaires 2- Eucaryotes « animaux » - Union Eubactérie-Archébactérie (eucaryotes anaéorobies), puis -protéobactérie (2 milliards d’années) - Encore 1 milliard d’année avant l’intégration des cyanobactéries  Genèses et types cellulaires 3- Eucaryotes « végétaux » - Union eucaryotes-cyanobactérie, création de l’animal «végétarien » (1 Milliard d’année) - Encore 430 MA d’années avant l’apparition des structures pluricellulaires  Ribosomes Centriole Not in most Cytoskeleton Lysosome Flagellum plant cells Plasma membrane Nucleus Mitochondrion Rough endoplasmic reticulum (ER) Smooth Golgi endoplasmic apparatus reticulum (ER) Idealized animal cell Cytoskeleton Mitochondrion Central Nucleus vacuole Not in animal cells Cell wall Rough endoplasmic reticulum (ER) Chloroplast Ribosomes Plasma Smooth membrane endoplasmic reticulum (ER) Channels between cells Idealized plant cell Golgi apparatus  Genèses et types cellulaires 4- Eucaryotes pluricellulaires - Union eucaryotes-eucaryotes, création des tissus et fonctions (570 Millions d’années) - Encore 568 MA!!! d’années avant l’apparition de l’homme!!! Large colonial organisms with coordinated growth in oxygenated environments 2.1 Gyr ago Abderrazak El Albani, Stefan Bengtson, Donald Embryons d'animaux E. Canfield, Andrey Bekker, Roberto Macchiarelli, pluricellulaires conservés Arnaud Mazurier, Emma U. Hammarlund, Philippe dans les phosphorites Boulvais, Jean-Jacques Dupuy, Claude Fontaine, Néoprotérozoïques Franz T. Fürsich, François Gauthier-Lafaye, (570-580MA) Philippe Janvier, Emmanuelle Javaux, Frantz de Doushantuo (Chine). Ossa Ossa, Anne-Catherine Pierson-Wickmann, Armelle Riboulleau, Paul Sardini, Daniel Vachard, Martin Whitehouse & Alain Meunier Nature volume 466, pages 100–104 (2010)Cite this article Méthodes d’étude de la cellule  10 m Human height 1m Length of some nerve and muscle cells Unaided eye 10 cm Chicken egg 1 cm Frog eggs 1 mm Light microscope 100 mm µm Plant and animal cells µm 10 mm Nucleus Most bacteria Mitochondrion Electron microscope 1 mm µm Smallest bacteria 100 nm Viruses Ribosomes 10 nm Proteins Lipids 1 nm Small molecules Atoms 0.1 nm  Organe Homogénéisation Digestion protéases Culture de cellules (conservation de lignées, Trypsine Cellule Hybrides, Cybrides) Homogénéisation Centrifugation Etudes morphologiques, ultrastructurales: Coloration et microscopie - Cytométrie en Organites flux Lyse des membranes Technique immunochimiques (FISH, GFP, Centrifugation …) Macromolécules Biologiques Etude de la relation structure-fonction : Clonage, manipulation ADN/ARN Séparation - Purification : Protéines recombinantes Centrifugation - Electrophorèse Enzymologie Chromatographie Protéines Techniques biophysiques (RMN,…) Techniques immunochimiques (Elisa, …) Acides nucléiques Techniques radiochimique et moléculaire Lipides (Northern blot, PCR, RT-PCR,…) Glucides Techniques génomiques et Complexes transcriptomique à haut débit Techniques d’analyses bioinformatiques  Description de quelques techniques fréquemment utilisées 1- La microscopie La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures biologiques. Le principe est dans tous les cas le même : Une onde est envoyée sur la préparation ou émise par la préparation, Cette onde est captée par un objectif qui la concentre et passe par un oculaire qui crée une image observable, Cette image est soit observée à l'oeil nu, soit photographiée, soit enregistrée par caméra et stockée sur ordinateur pour retraitement.  Fixation et Coloration des Cellules La plupart des cellules (dont le poids est constitué de 70% d’eau) contiennent peu d’éléments susceptibles de faire obstacle au passage des rayons lumineux. Elles sont donc invisibles au travers un microscope ordinaire, Deux principaux modes d’observations sont possibles : - observation de cellules vivantes soit au contraste de phase (voir plus loin) soit après coloration vitale Colorant vital: peu toxique, se fixer de façon élective sur certaines structures, ne pas fournir de colorations diffuses Ex. Colorants basiques les plus utilisés : Bleu de méthylène, Bleu de toluidine, Bleu de Nil, rouge neutre, verts Janus - examen de cellules fixées et colorées Fixation : Tuer les cellules en les conservant dans un état le plus proche possible de l’état vivant (conserver la morphologie des constituants cellulaires) Chimiquement, Il s’agit d’une coagulation des protéines ; Les lipides sont généralement mal conservés Ex. de fixateurs : Mélange de CARNOY, Mélange de BAKER, Paraformaldéhyde, etc… Cryocongélation, Très utilisée, surtout pour étudier les molécules fragiles (ex. ARNm), et substances mal fixées chimiquement Inclusion et coupes des pièces : Permet la réalisation de coupes fines et régulières La matière la plus utilisée est la paraffine Les étapes sont : - La paraffine n’étant soluble ni à l’eau ni à l’alcool, les tissus sont déshydratés à l’alcool puis clarifiées par un solvant de la paraffine (le toluène) On procède donc par étapes en remplaçant : l’eau par un alcool, l’alcool par un solvant organique (Toluène), le solvant par la paraffine : Imprégnation à chaud dans la paraffine fondue (fusion à 56°C) Avant coloration, les coupes sont réhydratées (par passage dans l’alcool 95, 70, etc…) L’épaisseur des coupes doit être de : En microscopie: 2µm à 20 µm, en microscopie 60 à 100 nanomètres en microscopie électronique  Les différents microscopes a- La microscopie optique C’est la plus ancienne, il en existe le plus de variantes. Principe : La préparation est éclairée par une lampe. Les molécules à observer vont interagir avec la lumière de plusieurs façons : * soit en absorbant certaines longueurs d'onde de la lumière. C'est la microscopie en lumière directe. * soit en provoquant un déphasage des différents rayons lumineux. C'est la microscopie en contraste de phase. * soit en émettant de la lumière à une autre longueur d'onde que celle d'origine. C'est la microscopie à fluorescence.  a-1- la microscopie en lumière directe C'est le cas le plus simple. Les structures à observer sont colorées, soit qu'elles le soient naturellement, soit que ce soit le résultat d'un marquage. La lumière blanche émise par une lampe est concentrée sur la préparation et la traverse.  a-2- la microscopie en contraste de phase Cette technique permet d'observer les cellules sans préparation ni coloration dans leur milieu d'origine Elle permet donc d'observer des cellules vivantes Principe : Lorsqu’un rayon lumineux traverse une structure transparente à l’œil, l’objet émet deux sortes de vibrations lumineuses : - une vibration directe en phase avec la vibration qui traverse le milieu - une vibration diffractée, décalée par rapport à la précédente d’un quart de longueur d’onde. Le microscope à contraste de phase permet d’amplifier la différence de phase entre les rayons directs et les rayons diffractés  a-3- La microcopie à fluorescence Cette variante exploite la capacité qu'ont certaines molécules (fluorochromes) d'émettre de la lumière quand on les éclaire avec une lumière de longueur d'onde spécifique. Principe : la lumière émise par une source de lumière blanche est filtrée pour isoler la longueur d'onde qui va exciter la préparation puis focalisée sur la zone d'observation par l'objectif. La lumière émise est captée par l'objectif, filtrée pour isoler les longueurs d'ondes parasites qui pourraient brouiller le signal. Ex. le FITC (Fluoresceine IsoThioCyanate) fluoresce en vert quand il est éclairé avec une lumière bleue La BSA-FITC est injectée dans la circulation sanguine. Elle est retrouvée dans certains tissus en dehors des vaisseaux, absorbée par les cellules Ce genre de technique permet de déterminer la répartition d'une substance dans l'organisme et la perméabilité vasculaire au niveau local. Fluorochromes les plus utilisés : la phycoérythrine (PE), Fluorescéine isothiocyanate (FITC), la gamme d'Alexa Fluor, la Protéine fluorescente verte (green fluorescent protein, GFP).  b- La microscopie électronique La principale limitation de la microscopie optique est sa résolution. À cause de la faible portée des photons, D’où l’utilisation d’une autre particule élémentaire, l'électron. La longueur d'onde associée à l'électron est en effet très inférieure à celle du photon et la résolution finale est beaucoup plus élevée de l'ordre du nanomètre. Il existe deux variantes de la microscopie électronique : * la microscopie à transmission Fixation (glutaraldéhyde), post-fixation tétroxyde d’osmium (préserver les couches lipidiques) Préparation des coupes ultrafines (100 nm) * la microscopie à balayage Résolution plus faible que la précédente Donne des images spectaculaires, en pseudo 3D. Lorsque le faisceau d’électron bombarde la préparation, une partie des électrons la traverse, le reste émet des électrons secondaires du coté exposé de la préparation, ce sont eux qui serviront à construire l'image. Le résultat est une représentation de la surface de l'objet observée.  La microscopie électronique synthèse La microscopie électronique en volume Le microscope électronique en (volume EM) transmission (TEM) La tomographie électronique Le faisceau d’électron va L’Array tomographie traverser une couche mince Le serial Block Face (70-100 nm) d’un échantillon Le FIB SEM contrasté aux métaux lourds Ces techniques permettent de reconstituer en 3 dimensions Le microscope électronique en l’ultrastructure d’un échantillon à balayage (SEM ou MEB) l’échelle nanométrique Le faisceau d’électron va balayer la surface de La cryo microscopie électronique l’échantillon (cryo-EM) Cette technique permet d’explorer, à l’échelle du nanomètre, voire de quelques Å, la conformation et l’organisation des macromolécules en solution Prix Nobel de chimie 2017 TEM SEM c- Les nouvelles techniques de microscopie Limitation de la microscopie classique : Faible profondeur de champ de l'image : La zone observée de mise au point est nette, les zones immédiatement au-dessus et au-dessous sont floues et perturbent l'image observée. La microscopie Confocale est basée sur la microscopie à fluorescence (c'est donc une technique de microscopie optique), mais la lampe à lumière blanche est remplacée par un laser, Le laser est focalisé sur la préparation et seule la zone de focalisation sera suffisamment excitée pour émettre de la fluorescence, le reste de la préparation, que se soit sur les cotés ou sur un autre plan de focalisation restent sombres. En balayant par le laser tout le plan de focalisation, on obtient une image très nette de ce plan focale, les zones floues n'apparaissent plus. Cette technique peut aller encore plus loin : Entre chaque balayage, le plan focal peut être modifié pour traiter toute l'épaisseur de la préparation (axe Z). On dispose alors de la luminosité de tous les points de la préparation qui peuvent être utilisé de plusieurs façon : * En exploitant les coupes une à une, on peut étudier les connexions entre les différents éléments observés sur la préparation. * En reconstituant une image nette sur une épaisseur pouvant atteindre plusieurs microns, les éléments longitudinaux tels que les fibres nerveuses peuvent être suivies sur leur longueur sans interruption. * En construisant une image stéréoscopique qui peut être observée par des lunettes bicolores pour obtenir un effet 3D.  La microscopie de fluorescence synthèse Le microscope à épifluorescence Visualisation de molécules, d’organites, de cellules en les marquant avec des fluorochromes Epifluorescence Le microscopie confocal et multiphoton Augmentation de la résolution par l’utilisation d’une source lumineuse cohérente (laser) Confocal Pénétration plus profonde dans l’échantillon Conventional SIM Les techniques de super-résolution : SIM – STED – PALM/STORM Prix Nobel de chimie 2014 La microscopie SPIM (Single Plane Illumination Microscopy) ou LSM (Light Sheet Microscopy) ou Microscope à feuillet de lumière Observation d’organes entiers en fluorescence SPIM  2- La cytomètrie en Flux (FACS, flow cytometric analysis and Cell sorting) La suspension de cellules traverse le faisceau en un flux La lumière diffractée par les cellules est continu très fin. mesurée par des capteurs qui transmettent L’information à un ordinateur La lumière diffractée permet d'évaluer la taille des cellules (paramètre FSC des fichiers de WinMDI). La lumière diffractée, mesurée à 90° (paramètre SSC) donne une mesure de la granulosité de la cellule. L'utilisation de fluorochromes permet de détecter, de manière spécifique, la présence des molécules comme les marqueurs CD des leucocytes. PRINCIPALES TECHNIQUES SEROLOGIQUES B- Techniques secondaires Fluorescence orange Th Tc Fluorescence verte 2- La cytomètrie en Flux (FACS, flow cytometric analysis and Cell sorting) 3000 cellules/sec 3- Fractionnement Cellulaire Il est souvent nécessaire d’isoler les fractions cellulaires (membrane, mitochondrie, ribosome…) pour les étudier sur les plans biochimique, moléculaire et cellulaire. Ces fractionnements se basent sur la densité et la forme des particules et utilisent différentes valeurs de la force d’attraction (g) a- La centrifugation différentielle : dp>dm en tout point du tube Elle aboutit à une concentration des molécules les plus Dp: densité particule Dm: densité milieu lourdes au fond du tube D1 et D2: densité extrêmes du gradient une fois celui-ci établi Le facteur prépondérant est le diamètre des particules qui intervient au carré dans la vitesse de sédimentation Vs = kd2(p - s)/ d: diamètre particule (sphère) p, s: densité de la particule/solvant : viscosité du solvant K: constante fonction de la géométrie de la particule et de la force centrifuge Avantages et Inconvénients b- La centrifugation en gradient de densité Consiste à centrifuger en gradient de densité un mélange de macromolécules ou de particules à travers une solution (saccharose, CsCl) de densité croissante de haut vers le fond du tube. Deux possibilités : - si dp>d2>d1: on parle de centrifugation de zone - si d2>dp>d1: on parle de centrifugation isopycnique b-1- La centrifugation de zone Sépare les particules en fonction de leur coefficient de sédimentation La densité du milieu étant inférieure à celle des particules, au bout d’un temps suffisamment long, toutes finissent par sédimenter au fond du tube, ce qui n’est pas le but recherché!!! Il faut donc déterminer le temps et la vitesse de centrifugation adéquats b2- La isopycnique (dite « à l’équilibre ») Elle sépare les particules en fonction de leur densité apparente dans le milieu de centrifugation Produit Densité Avantage Inconvénient Peu coûteux, Problème de PO : Saccharose 1,3g/mL - 2,5M Électriquement neutre Éviter pour isolement Cell entières Densité t. élevée Chlorure de césium 1,9g/mL - 7,5M Très adapté à la séparation Coût / Sel (CsCl) des Ac. Nuc Metrizamide® Très soluble et Coût / forte absorption dans UV 1,5g/mL Instabilité (dérivé iodobenzamido Non chargé du glucose) Ficoll® Densités élevées sans Coût / forte viscosité (polymère de glucose) générer de fortes PO Adapté à la séparation de Cellules entières Faibles PO Percoll® Faible viscosité (silice recouverte de 1,3g/mL Adapté à la séparation de Coût / faibles densités atteintes Polyvinylpyrolidone) Cellules entières