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Zusammenfassung Biologie Semester 1 Bestehend aus zwei heavy chains (blau) und zwei kleineren Peptiden (pink), welche durch Disulfidbrücken zusammengehalten wird (da O2 v...

Zusammenfassung Biologie Semester 1 Bestehend aus zwei heavy chains (blau) und zwei kleineren Peptiden (pink), welche durch Disulfidbrücken zusammengehalten wird (da O2 vorhanden). Scharnier (in der Mitte) ist nicht starr und die 3 Domänen können sich somit frei bewegen. Funktionelle Aspekte der Quartiärstruktur Fine-tuning der Reaktivität (Bsp. Hämoglobin besteht aus 2 - und 2 -Untereinheiten): kann erreichen, dass in der Lunge Sauerstoff ausgezeichnet gebunden wird, dieser Effekt aber verloren geht, sobald das Hämoglobin am Zielort des Sauerstoffs angekommen ist. Modularität (Von Oligomeren bis zu riesigen Assembly lines, z.B. Polyketidsynthasen): Viele Reaktionen am Substrat können an Ort und Stelle mit hoher Effizienz durchgeführt werden Proteindynamik Allgemein Sowohl kovalente als auch nicht-kovalente Bindungen schwingen. Oberflächen-Seitenketten viel dynamischer Proteinfaltung Die gesamte Information zur Ausbildung der 3D Struktur ist grundsätzlich in der Sequenz gespeichert. Dies gilt aber lediglich für ganze Protein Domänen Sequenzen. Werden die Betrachteten Protein Sequenzen zu klein, so ist nicht zwangsläufig klar, wie die 3D Struktur aussehen wird. Protein folding problem: Die 3D Struktur vorauszusagen ist nicht so leicht, wenn lediglich die 1D Struktur bekannt ist. Seite 31 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Durch die Tabelle links lassen sich voraussagen machen, sofern genügend AA betrachtet werden können (Slider window). Ausserdem können ähnliche Proteine zum Vergleichen herangezogen werden, um die 3D Struktur eines Proteins vorherzusagen (template based modeling). Aber: Die Voraussage einer 3D Struktur de novo ist relativ schwer, selbst wenn ein Template verfügbar ist. Diese Voraussage ist umso schwieriger, je genauer diese Voraussage sein soll. Genauso ist das protein design extrem herausfordernd, insbesondere wenn es de novo geschehen soll und nicht auf ein Gerüst (scaffold) aufbauen kann. Levinthals Paradoxon Aufgabe: Ein Protein mit 100 AA-Resten soll seine 3D Struktur erlangen, indem jede AA (Seitenkette Phi-Psi) ein Total von drei Konformationen testet, unabhängig von den anderen AA. Falls es 10-13 s dauert, um eine komplette 3D Struktur des Proteins in die nächste zu konvertieren, wie langedauert es, bis das Protein alle Kombinationen durchgespielt hat? Das Protein würde also länger benötigen, als das Universum existiert, um sich zu falten. Irgendwas kann nicht stimmen. Denn Realität: Protein faltet in ca. 1 s. Lösung des Paradoxons Die korrekt gefalteten Zwischenzustände werden sukzessiv (=nach und nach) stabilisiert (comulative selection), was um Grössenordnungen effizienter ist. Die Faltung ist also ein kooperativer Prozess, die Proteine bekommen mit, ob sie richtig gefaltet sind oder nicht. Treibende Kraft: Freiheit des Wassers. Zwar haben die Protein Atome Freiheit eingebüsst, aber die Wassermoleküle an Freiheit gewonnen (Hydrophober Effekt). Seite 32 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Proteinfaltung und Entfaltung Bei globulären Proteinen (-domänen) gibt es meist einen einzigen, scharfen Übergang zwischen der gefalteten (=native Konformation, so wie das Protein in der Natur vorkommt und auch wirksam ist.) und ungefalteten (=denaturierten) Form. Denaturanten Denaturanten wirken chaotrop, sie zerstören nicht-kovalente (und zum teil kovalente) Bindungen des Proteins. Auch Hitze wirkt denaturierend (durch erhöhung der Schwingungen der Atome des Peptids) kann aber auch schäden an der Chemischen Struktur bewirken. Werden hydrophobe AA aus dem Kern der Lösung zugänglich, kann der Entfaltungsprozess irreversibel werden (oder zumindest kann das Protein nicht mehr in nützlicher Zeit zurückfalten). Das Anfinsen Experiment Durch Denaturierung wurden die nicht kovalenten, aber auch die kovalenten Bindungen (Disulfidbrücken) eines Proteins zerstört. Als man ihm die Möglichkeit gab, sich erneut zu falten, so zeigte das Protein keine (extrem geringe) Wirkung mehr. Durch Zugabe von kleinen Mengen denaturierender Substanz hat man dem Molekül die Möglichkeit gegeben, «falsche» Disulfid Brücken zu brechen und sich neu zu falten. Das Ergebnis: Das Protein wurde wieder aktiv (hat sich richtig gefaltet). Seite 33 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Redox Chaperone In Zellen funktioniert dieser Prozess mit kleinen Mengen an denaturierender Substanz um die Proteinfaltung zu verbessern genauso: redox Chaperone (ein Enzym) brechen falsche Disulfidbrücken im Protein und helfen ihm, Disulfidbrücken zu bilden. Auch die Bildungen von nicht kovalenten Bindungen werden durch redox Chaperone unterstützt. Metamorphe Proteine Proteine, welche mehr als eine stabile Struktur einnehmen können werden metamorphe Proteine genannt und sind sehr selten. Ähnliche Struktur vs. Ähnliche Sequenz z.B.: Cytochrom c von Thunfisch und von einem Bakterium haben eine sehr ähnliche 3D Struktur, sind sich aber in der AA Sequenz nicht einmal ähnlich. Es gibt aber trotzdem gleiche AA in beiden Proteinen an derselben Stelle, welche für die Funktion derart wichtig sind, dass sie nicht ausgetauscht werden können. Diese AA werden Essenzielle Aminosäuren genannt. Aktive Stelle Faltung führt bei Enzymen dazu, dass sich eine aktive Stelle bildet Dabei kommen oft in der Sequenz weit Entfernte Seitenketten in direkte räumliche Nachbarschaft, was eine Aktivierung zur Folge haben kann Beispiel: Serinprotease Trypsin, katalytische Triade ändert den pKa des Serins (lokaler pKa) Seite 34 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Proteinoberfläche: Erkennung / Interaktion Protein-Protein-WW bedingen komplementäre Interaktionsflächen Oft spielen Ladungen eine Rolle, aber eine passende Form ist Voraussetzung Beispiel: Ein Vitamin-B12 Transportprotein und dessen Rezeptor auf der Zelloberfläche Konformationelle Änderung und katalytische Zyklen Proteine können mehrere Konformationen einnehmen, die sich strukturell unterscheiden. Dabei wird aber die Architektur nicht grundlegend verändert. Für viele von Proteinen katalysierten Reaktionen sind solche Konformationsänderungen essentiell. Beispiel: Ein ATP-abhängiges Transportprotein Posttranslationale Modifikationen (PTMs) Kovalente Modifikationen von Proteinen nach der Translation (Translation = Proteinsynthese durch das Ribosom (siehe Slider Window)) Es gibt sehr unterschiedliche Modifikationen mit verschiedenen zellulären Konsequenzen PTMs können die Reaktivität eines Proteins verändern (Regulation), die Konformation beeinflussen oder als Signal dienen Es ist nicht in allen Fällen gegeben, dass sämtliche von der Zelle hergestellten Kopien eines Proteins modifiziert sind. PTMs können lösliche Proteine in Membranen verankern Komplexe Proteinmodifikationen Kohlenhydrate bzw. komplexe Glycane spielen eine wichtige Rolle bei sekretierten Proteinen in eukaryotischen Zellen. Z.B.: An ein Protein ist ein Zucker gebunden, welcher für Aktivität und Regulität des Proteins sorgt. Green Fluorescent Protein Wichtiges Beispiel einer Modifikation, bei der keine chemische Verbindungen kovalent an das Protein gehängt werden. Aus den Seitenketten ensteht unter Sauerstoffverbrauch ein Fluorophor (Fluoreszenter Stoff). Seite 35 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Membranen I: Phospholipide, Detergentien und Membrandynamik Übersicht Zelluläre Membranen trennen Innen- von Aussenseite einer Zelle oder Zellorganellen / Kompartimente. Zelluläre Membranen sind nicht-kovalente Aggregate von Lipiden, deren chemische Struktur/Natur je nach Zelle und Organismus unterschiedlich ist. Lipiddoppelschichten sind dynamische und fluide Strukturen, die 2D Diffusion zulassen. Die zellulären Membranen sind asymmetrisch sowohl bezüglich der Lipidzusammensetzung ihrer beiden Schichten als auch der Modifikationen der Membranproteine. Zelluläre Membranen sind semi-permeabel. Zelluläre Membranen sind häufig polarisiert, d.h. es bestehen elektrochemische Potentiale. Zelluläre Membranen enthalten Membranproteine, die eine Vielzahl von Funktionen erfüllen. Transport- und Kanalproteine ermöglichen den Transport von spezifischen Substraten. (Nicht alle Formen von Transport, z.B. Endozytose u.ä., werden hier besprochen). Fettsäuren Nomenklatur Ungesättigt: Mind. 1 Mehrfachbindung im Alkylrest Gesättigt: Nur Einfachbindungen im Alkylrest Zählung: Beginnt immer beim C, welches am höchsten oxidiert ist Bemerkung: Wieso links cis-? Die Bindungen, welche von der Doppelbindung weg führen zeigen in dieselbe Richtung. Es kommen fast nur cis- Fettsäuren in der Biologie vor. Andere Nomenklatur: Nomenklatur. Zählung beginnt bei letztem C des Alyklrests. Obiges Beispiel ist eine -9 Fettsäure. 2 Wichtige Fettsäuren für Prüfung Gesättigt: Palmitinsäure (Systematischer Name:Hexadecansäure) Schmelzpunkt: 63.1 °C Besteht aus Insgesamt 16 C Ungesättigt: Ölsäure, Oleinsäure (Systematischer Name: 9-Octadecensäure) Schmelzpunkt: 12°C Besteht aus Insgesamt 18 C. Ist eine cis- 9 Fettsäure bzw. eine cis- -9 Fettsäure. Seite 36 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Es gibt aber viel mehr Fettsäuren. Grund dafür ist, dass alle unterschiedliche Schmelzpunkte besitzen. Die Länge und Anzahl Doppelbindungen von in Membran verbauten Fettsäuren Beeinflusst die Eigenschaft der Membran. Glycerin, Phosphat Obige Verbindungen werden durch Veresterung (Kondensationsreaktion, Wasser entsteht) eines Glycerins und Fettsäuren gebildet. Wichtig: Glycerin ist nicht chiral, denn es ist Spiegelsymmetrisch, nicht rotationssymetrisch. Enzyme können zwischen den 3 C des Glycerins unterscheiden. Somit muss das Glycerin nummeriert werden (wie im mittleren Bild mit den pinken Zahlen). Kopfgruppen Kopfgruppen können sein: Serine Ethanolamine Choline Glycerol Inositol (Zucker, ) Wichtig: Auch ganzer Name nach IUPAC eines Phospholipids bilden können z.B. 1-Palmityl-2-Oleoyl-3-phosphatidylserine Seite 37 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Spezialfall mit vier Fettsäureresten (Wichtig für Form der Membran) Phospholipide und Detergentien in Wasser Phospholipide Phospholipide können in wässriger Lösung Doppelschichten bilden (im idealfall). Diese können auch übereinander Aufgebaut sein (wie eine Zwiebel). Phospholipide bilden eine trübe Suspension in Wasser. Detergentien Seite 38 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Sind ähnlich aufgebaut wie Phospholipide, besitzen eine hydrophile Kopfgruppe und einen hydrophoben Rest und können geladen sein (z.B. SDS). Detergentien liegen in Wasser in Monomeren (einzelne Moleküle) vor. Ab einer gewissen Konzentration (kritische Konzentration) bilden sich Mizellen (oben links) in Wasser. Die Konzentration an Monomeren bleibt trotz höherer Konzentration an Detergens gleich. Da Mizellen viel kleiner sind als das sichtbare Licht, bildet sich eine klare Suspension in Wasser, selbst wenn Mizellen vorliegen. Oberflächenspannung Wie im Diagramm oben wird langsam die Konzentration an Detergens erhöht von links nach rechts. Mit der Zeit nimmt die Oberflächenspannung des Wassers (y Achse) ab und zwar so lange, bis die kritische Konzentration für Mizellen erreicht ist, und fast keine weiteren Monomere vorhanden sind. Daraus kann man schliessen, dass es die Monomere sind, die die Oberfläche des Wassers beeinflussen und zwar indem sie ihre hydrophoben ketten aus dem Wasser halten. Detergentien vs. Phospholipide : Eigenschaften / Unterschiede Detergentien und Phospholipide sind amphipathische Moleküle (g) Detergentien sind generell gut wasserlöslich und bilden spontan Mizellen, wenn die Konzentration über der CMC (critical micelle concentration) liegt. (u) Detergentien können hydrophobe Moleküle umschliessen und sie so wasserlöslich machen (emulgieren). Das wird in Waschmitteln, Seife etc. ausgenützt. (u) Phospholipide sind schlecht wasserlöslich und bilden keine Mizellen, sondern oft Lipiddoppelschichten (bilayers). Aber: Lysophospholipide können wie Detergentien wirken. (u) Detergentien (insbesondere geladene, z.B. SDS) können Proteine denaturieren, Phospholipide nicht. Milde, non-ionische Detergentien (z.B. Dodecylmaltoside oder Digitonin) können Membranproteine solubilisieren ohne ihre 3D Struktur zu zerstören. (u) Seite 39 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Solubilisierung von Membranen, Denat urierung von Proteinen Lösung mit Membranen Gibt man in eine Lösung mit Membranen Detergens, so schleusen sich die Detergens Moleküle in die Membran und ab einer gewissen Anzahl dieser Moleküle dominiert das Verhalten der Mizellen und die Membran löst sich auf. Es entstehen gemischte Mizellen. Lösung mit Proteinen Gibt man Detergens in eine Lösung mit einem Protein, so lagert sich der Hydrophobe Teil der Detergens an das Molekül und entfaltet so das Protein, sofern genügend Detergens zugegeben wurde. Form von Detergentien und Phospholipiden Gewisse Organellen haben Membranen, welche extrem stark gekrümmt sind. Im Bild links sieht man das inner Leaflet (grün und rot), welches nur wenig Platz für die Kopfgruppe hat und somit aus Phospholipiden besteht, welche kleine Kopfgruppen besitzen. Im outer Leaflet (gelb und orange) befinden sich Phospholipide, welche grosse Kopfgruppen besitzen. Auch der hydrophobe Teil hat einen Einfluss auf die Wahl der Phospholipide, jedoch werden diese verändert, so verändert sich auch die Fluidität der Membran. Seite 40 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Dynamik einer Membran Membranen sind extrem dynamische Gebilde. Moleküle wechseln ihre Position entlang der Membran (2D Diffusion, schnell) und sogar die Seite der Membran (Flipflop, langsam). Dies lässt sich auch durch die folgenden 2 Experimente beweisen. Fluoreszenzregenerierung nach Bleichen mit Licht (FRAP) Eine Zelle mit fluoreszierendem Protein an der Oberfläche (in der Membran) wird mit einem Laser beschossen und so wird der Fluorophor zerstört. Es bildet sich eine nicht fluoreszierende Stelle. Diese verschwindet mit der Zeit. -> Membranmoleküle bewegen sich 2D auf der Membran. Verschmelzen von Zellen aus z.B. Mäusen und Menschen Zwei Zellen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen werden fusioniert. Mit der Zeit vermischen sich die beiden Farben vollständig miteinander -> Membranmoleküle bewegen sich 2D auf der Membran. Seite 41 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Phasenübergang Stabilität der Membran ist von Fluidität abhängig. Die Temperatur des Phasenübergangs ist die «melting Temperature» (Tm). Beeinflussung von Tm durch unterschiedliche Ketten Tm (ein makroskopischer Parameter) wird stark von der Länge der Fettsäureketten sowie der Anzahl cis/Z Doppelbindungen ("degree of cis unsaturation") beeinflusst. Kürzere Fettsäureketten ermöglichen weniger Van der Waals Wechselwirkungen zwischen benachbarten Phospholipiden, was die Fluidität der Membran erhöht und Tm erniedrigt. Knicke ("knicks") in ungesättigten Fettsäureketten (cis/Z Doppelbindungen) erschweren das enge Packen benachbarter Phospholipide und erniedrigen stabilisierende VdW Interaktionen und somit auch Tm. Beeinflussung von Tm durch Cholesterin In tierischen Membranen ist die Fluidität der Phospholipid Doppelschichten stark von Cholesterin, in Pilzen von Ergosterol und in Pflanzen Phytosterole (und etwas Cholesterin) Cholesterin ist ein starres Molekül, dessen Hydroxylgruppe mit den Kopfgruppen der benachbarten Phospholipide interagiert. Der polycyklische Kern und die isooctylgruppe wechselwirken mit den Fettsäureresten und erniedrigen deren Beweglichkeit Cholesterin verbreitert den Phasenübergang der Membran (gelartig fluid). Es sitzt starr in der Membran und erniedrigt die fluidität der anderen Alkylreste. Cholesterin verbreitert den Phasenübergang einer Lipidmembran. Unter der Tm erhöht Cholesterin die Fluidität, weil es die VdW Interaktionen von starren Fettsäureketten stört. Über der Tm erniedrigt Cholesterin die Fluidität, weil es durch seine starre Form die hohe Dynamik der Fettsäureketten erniedrigt. Seite 42 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Hopanoide «bakterielles Cholesterin» Auch Bakterien besitzen Moleküle, um die Liquidität der Membran herabzusetzen, die Hopanoide. Es gibt Bakterien, welche diese nicht besitzen, und dessen Membran ist viel instabiler. Lipide in Archaeen Gesättigte Form von Geranylgeranyl (20 Kohlenstoffe). Keine Doppelbindungen: Sauerstoffunempfindlich, keine Oxidation. Etherbindung: Viel stabiler in Bezug auf Hydrolyse als Esterbindung. Tetra-Ether: Noch grössere Stabilität, geringere Dynamik in der Membran (keine eigentliche Lipiddoppelschicht mehr falls nicht gemischt mit GlycerolDiether Lipiden) Crenarchaeol: Zusätzliche Stabilität durch Ringstrukturen. Membranproteine Membranen II: KD Plots und Transport durch Membran Hydrophile Skala von Aminosäuren Experimentell: Man stellt einer Aminosäure eine hydrophile und eine lipophile Umgebung zur Verfügung und prüft, wo sich ein grösserer Prozentsatz AA befinden. Das Ergebnis ist, dass es tatsächlich eine «Rangliste» der Hydrophobie der AA gibt. Seite 43 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Analyse: In gelösten Proteinstrutkuren wird geprüft (Kyte & Doolittle haben dies durchgeführt): wie oft sieht man eine AA Seitenkette im Kern des Proteins und wie oft sieht man sie Exponiert. Das Ergebnis ist ebenfalls eine Rangliste der Hydrophobie. Werden beide Ranglisten vermischt so entsteht die kombinierte Kyte & Doolittle Hydrophobie Rangliste (links). Kyte-Doolittle-Plot Slider Window: Es wird z.B. Immer 10 AA verglichen und dieser Durchschnitt auf die Mitte des Slider Windows abgetragen. Durchschnitt AA 1 bis 11: Wert 6 Durchschnitt AA 2 bis 12: Wert 7 Durchschnitt AA 3 bis 13: Wert 8 Das ist auch der Grund, wieso bei 0 bzw. beim Schluss keine Werte im Plot gibt. Die Grösse des Slider Windows (wie viele AA) ist variabel. Wählt man es zu klein sieht man nichts (zu viele dicht aufeinander liegende Ausschläge). Wählt man es zu gross wird es zu ungenau. Plot interpretieren Im Diagramm links in Rot eine Transmembran Domäne (befindet sich in der Membran). Im Diagramm in orange ist eine lösliche Domäne, da Plot um 0 (befindet sich innerhalb oder ausserhalb der Membran). Im Diagramm in Hellblau sind Ausschläge nach oben angezeigt. Manchmal ist nicht ganz einfach zu erkennen, ob es sich (z.B. im Diagramm ganz in der Mitte) um zwei -Helices oder nur um eine handelt. Dafür wird die 3D Struktur benötigt. Seite 44 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Electrostatic surface potential Im Bild links ist weiss ungeladen, rot negativ geladen und blau positiv geladen. Der ungeladene weisse Teil muss sich in der Membran befinden und interagiert dort mit dem hydrophoben Teil der Membran. Blauer Ring in der Mitte: Effekt der Proteinherstellung. Arten von Membranproteinen Es gibt zwei Arten von Membranproteinen: -helikale Membranporteine (ein Beispiel davon oben) -barrel Membranproteine -barrel Membranproteine Kommen im Allgemeinen nicht in den gleichen Membranen wie -helikale MProteine vor sondern in «äusseren Membranen» von Bakterien und Organellen Voraussage auf Grund von Kyte Doolitle Plots wesentlich anspruchsvoller Bei beiden: Der Weisse Teil im ESP ist in die Membran eingebaut und ist auch der einzige Hydrophile Teil des Proteins. So wird verhindert, dass das Protein aus der Membran «rutschen» kann. Seite 45 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Membranprotein-Lipid-Wechselwirkungen Die Membran beeinflusst die Funktion von vielen Membranproteinen und umso stärker, je mehr konformationelle Änderungen Teil des Reaktionszyklus sind. (lateral pressure) Cholesterin und Phospholipide können stark an der Oberfläche von Membranproteinen gebunden sein. (Werden fast Teil des Proteins und Regulieren die Funktion des Proteins) Lipidgehalt und Ionen Die meisten biol. Membranen weisen eine Asymmetrie auf Die beiden Schichten enthalten unterschiedliche Antheile verschiedener Phospholipide Viele biol. Membranen sind «geladen» d.h. es existiert ein Membranpotential (praktisch immer innen negativ, aussen positiv, siehe Bild unten) Wenige biologisch relevante Lyophile (hydrophobe) Moleküle können (effizient) frei durch Phospholipid Membranen diffundieren entlang ihrem Konzentrationsgradienten. (In Tieren sind fast alle physiologischen Transmembranprozesse katalysiert, ausser die von Gasen). Wasser und Harnstoff können (aber nicht mehr so leicht) durch die Membran diffundieren, da sie genug klein sind. Biol. Membranen stellen eine effektive Barriere für ionische und polare Substanzen dar. (hydrophobe Zone der Lipiddoppelschicht ist eine sehr Ungünstige Umgebung für diese Substanzen) Fundament Transport durch Membran Membran: Passiver Transport: Entlang Konzentrationsgradient. Die treibende Kraft ist Diffusion von höherer zu tieferer Konzentration. Protein: Passiver oder aktiver Transport möglich: Aktiver Transport läuft entgegen dem Konzentrationsgradienten. Die treibende Kraft / Energie muss dann von gekoppeltem Prozess geliefert werden. Seite 46 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Wassertransport Treibende Kraft: Osmose: Durch höhere Konzentration an gelöstem Stoff kann Wasser von der Seite mit weniger gelöstem Stoff durch eine semi-permeable Trennschicht (Membran) diffundieren. Dies passiert langsam und kann durch Aquaproteine beschleunigt werden. Wenn keine Stabilisierung der Plasmamembrane vorhanden ist (z.B. durch eine Zellwand), gefährdet eine hypotonische Umgebung (mehr gelöster Stoff auserhalb der Zelle) die Stabilität einer Zelle. Darum benötigen Organismen oder Zellen, die unterschiedlichen Umgebungen (isotonisch, hypertonisch, hypotonisch) ausgesetzt sind, Mechanismen oder Strukturen zur Stabilisierung der Plasmamembran. Die Mehrheit der tierischen Zellen (aber nicht alle) ist von isotonischen Lösungen (gleiche Konz. An gelösten Stoffen) umgeben. Gibbs Freie Energie und Transport Wenn c2 = c1 wird der erste Term 0. Wenn c2 grösser als c1 wird der 1. Term Positiv, sonst wird er Negativ. Seite 47 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Passiver Transport ungeladen (Beispiel: Glukose) Das Transportprotein ist spezifisch (unterscheidet zwischen Substanzen) -> spontan Es werden keine Ladungen verschoben (2. Teil der Gleichung vernachlässigbar) Alternating access: Alternierender Zugang zum Protein. Es sind nie beide Schleusen offen. Berechnung: Seite 48 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Passiver Transport geladen (Beispiel: Na+ und K+ Ionen) Der Transportprozess ist spezifisch (Verschiedene Kanäle für verschiedene Ionen). Der Transportprozess beruht auf Diffusion, ist reversibel und folgt dem -> Spontan). Da Ladungen verschoben werden: Zweiter Term muss auch berücksichtigt werden. Kanalproteine haben mechanismen, die Diffusion von Ionen stoppen (gating oder inactivation) Kanalproteine u.a. für Übertragung von Nervensignalen sehr wichtig. Berechnung: Seite 49 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Sekundärer Aktiver Transport Grüne Moleküle sollen entgegen ihrem Konzentrationsgradienten transportiert werden. In diesem Fall «bezahlen» pinke Moleküle für diesen Transport. Symport: Beide Transporte in die gleiche Richtung Antiport: Ein Transport in die eine Richtiung, der andere in die Andere. Berechnung: Seite 50 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Primärer Aktiver Transport Die NA/K ATPase pumpt Na+ und K+ Ionen, beide entgegen ihren Konz. Gradienten Der Prozess wird durch die ATP Hydrolyse ermöglicht, welche die notwendige Energie liefert. Die Aktivität dieses Transporters generiert einen Na+ Gradienten uns sorgt dafür, dass aktiver Sekundärtransport stattfinden kann. Ausserdem ermöglicht er die Wiederherstellung des Nervenzellen-Ruhepotentials. Berechnung: Seite 51 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Beispiel der Transporte in Darmepithelzelle Glukose wird Sekundär Passiv in die Darmepithelzelle aufgenommen durch Symport von Na+ (Zellen bauen Na+ Gradienten durch aktiven Transport auf) Die Glukose kann durch ein Protein (Passiver Transport durch Protein) in die Glukoseärmeren Kapillaren transportiert werden. Seite 52 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 D: Universelle Mechanismen der Replikation, Transkription, Translation (N. Ban) Allgemein Replikation allgemein: Extrem genau (1 von 10-10 Fehlerrate) DNA Synthese Korrekturlesung Reparieren Architektur und Geometrie von DNA Kovalente Struktur von DNA Zucker-Phosphat Backbone Verbunden durch Phosphodiester Verbindungen Variierende Basen Komposition, aber Komplementäre Basen (A, T und C,G) Seite 53 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Einige Wichtige Punkte und Zahlen zu DNA Struktur und Architektur (in normaler B Form): DNA Formt eine rechtsseitige Doppelhelix (Zwei einander entgegengesetzte Stränge, s.o.) Breite der DNA: 24 Å Distanz zwischen zwei Basen: 3.4 Å (kleinste Mögliche Distanz, ohne sterische Clashes) Turn zwischen zwei Basenpaaren: 36°. Somit: 10 Basenpaare ergeben 360° (einen vollen Twist in der DNA). 10 BP = 1 Twist. Major and Minor Groove side der Doppelhelix Major groove: Breit Minor groove: Schmal Zweite mögliche Form der DNA: A Form Wenn zu wenig Wasser verfügbar ist, bildet die DNA eine leicht mehr geöffnete minor groove und nicht mehr 10 Basenpaare für einen vollen Turn. Sie sieht aus wie die Doppelhelix von RNA. RNA bildet entweder mit sich selbst lokale Doppelhelices oder eine Doppelhelix mit einem komplementären Strang (wie bei der DNA) und bildet eine A Form. Zucker Falten Konfirmation ist der Grund für die unterschiedlichen Architekturen von A form und B form von DNA. DNA und Genetische Informationen Nukleinsäure (nucleic acid): Enthalten genetische Information über Nucleotide (nucleotides = Monomere der Nukleinsäuren) DNA (Genetischer blueprint) und RNA (Produkt der Transkription): Sind Polynucleotide, kurze Segmente von Nukleinsäuren werden Oligonukleotide genannt. Gen: Funktionelle Einheit der Genetischen Information. Gene sind Teil von genetischen Elementen: Grosse Moleküle und/oder Chromosomen Seite 54 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Grösse: Die Grösse von DNA wird in Basenpaaren angegeben (base pairs). 1000bp = 1kbp. at 4.46 Mbp) Die lineare Grösse von DNA ist um einige hundert Male grösser als die Zellen, Supercoiling sorgt dafür, dass DNA unterbringbar wird. Wichtige Forscher und Experimente Friedrich Miescher (1860): Entdeckte die DNA indem er Moleküle mit unterschiedlichen Eigenschaften und Proteinen von Zellkernen isolierte. Nannte die Substanz «Nuclein». Albert Kossel (Nobel 1910): Isolierte die Fünf Nukleotid Basen: Adenin, Cytosine, Guanin, Thymine und gab DNA seinen Namen. (die Funktion von DNA war noch nicht klar). Hershey-Chase Experiment (1952): Bestimmung, welches Molekül für die Weitergabe von erblichen Informationen verantwortlich ist. Versetzten einmal Schwefel Atome von Bakteriophagen nuklear (Bestandteil von Proteinen) und einmal Phosphor Atome (Bestandteil von DNA). Nach der Infektion fand man in den infizierten Zellen keine Spuren von radioaktivem Schwefel, jedoch von radioaktivem Phosphor -> Beweis, dass DNA Verantwortlich für Weitergabe von erblichen Informationen ist. Linus Pauling (1950er): Zeigte die Struktur der -Helix von Proteinen (Siehe Teil Experimente von Proteinen). Er dachte ausserdem, dass die DNA eine tripple Helix sein könnte (war der erste der die Struktur der DNA voraussagte). Erwin Chagraff: - Die Komposition von DNA Variert von Spezies zu Spezies (Relative Mengen A, C, T, G) - In allen Spezies: Gleich viele A wie T und gleich viele C wie T Rosalind Franklin: Durch X-Ray Diffraktion wurde aufgezeigt, dass die DNA in einer Helix vorliegt Watson and Crick (1953): Entschlüsselten die DNA Struktur (Doppelhelix). Ausserdem stellten sie fest, dass A und T sowie C und G starke Wasserstoffbrücken (Watson and Crick Basenpaare) bildeten sowie, dass nur ein Strang DNA mit ihren A, T, C und G Basenpaaren nötig waren, um den anderen zu kopieren. Meselson und F. Stahl (1958): Benutzten E. coli und zwei Isotope von Stickstoff (14N und 15N). Sie liessen die Bakterien in 14N Medium kultivieren (nur E. coli mit 14N) und transferierten diese Bakterien in 15N Medium. Ergebnis: Nach 20 Minuten (eine Zellteilung) war 14N 15N DNA vorhanden. Nach 40 Minuten (zwei Zellteilungen) war 14N15N und 15N15N DNA vorhanden. Dies bedeutet: Replikation ist semi-konservativ (Immer ein Strang vom alten Strang wird behalten). Seite 55 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Volkin and Astrachan (1958): Infizierten ein Bakterium mit einem Bakteriophagen (mit einem Strang DNA) und prüften die Mengen von Nukleotiden des DNA Templates und des RNA Produkts. Ergebnis: DNA A = RNA U DNA T = RNA A DNA G = RNA C DNA C = RNA G Dies Zeigte die Beziehung zw. Transkript DNA und dem RNA Produkt (T in DNA = U in RNA sowie die Beziehungen zwischen den Nukleotiden oben) Mit diesen Ergebnisen fanden später Francois Jacob, Sidney Brenner und Francis Crick heraus, was das mRNA Molekül ist. Sydney Brenner und Francis Crick: Entdeckten den genetischen Code: Crick and Brenner Bacteriophage T4 Genetisches Experiment (Versetzten RNA mit Chemikalien und erreichten so eine Verlängerung der RNA um ein Nukleotid, dies wurde 3 mal wiederholt und erst dann machte der Code wieder sinn -> Es muss sich beim genetischen Code um Triplets handeln) RNA Tie Club: Wollten den Genetischen Code entschlüsseln Marshall Nirnberg: Versuchte den Genetischen Code experimentell zu entschlüsseln. Verwendete Synthetisiertes polyU und mixte es mit Zellen. Das Ergebnis: Polyphenylalanin entstand. Er dekodierte somit den ersten Code: UUU -> Phe. Dann verwendete er radioaktiv markierte Aminosäuren und implementierte andere Triplets in Zellen, um zu prüfen, wo die Radioaktivität zu finden ist. So entschlüsselte er einen Teil des Genetischen Codes. synthetisiert (durch Gobind Khorana) und in Zellen eingeschleust. Je nach Startpunkt (3 Möglichkeiten) wurde eine Polypeptidkette mit immer derselben Aminosäure erstellt. Dies wurde von Robert Holley druchgeführt, welcher so die Abhängigkeit des Startpunktes bewies. Um herauszufinden, in welche Richtung die RNA translatiert wird wurden kurze synthetisierte polyA + -Lys-Lys- -Lys-ASN-COO-. Der Gen. Code war zu dieser Zeit schon bekannt: AAA = Lys, AAC = ASN. Ergebnis: Translation läuft an der nem weiteren Experiment wurde einer Zelle radioaktiv markierte Aminosäuren zur Verfügung gestellt. Nach einer gewissen Zeit wurde geprüft, wo sich der radioaktive Teil der Aminosäuren im Protein befindet (C Ende oder N Ende). Dabei kam heraus, dass sich der Radioaktive Teil vor allem am C Ende befand. Ergebnis: Das Protein bildet sich von N Ende zum C Ende. Theodor Escherich (1886): Entdeckung E.Coli Bakterium Francisco Bolivar: Erstellte erstes synthetisches Plasmid Seite 56 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 DNA Replikation, Rekombination und Reparation Probleme der DNA Replikation 1. Problem: Kopieren der DNA erzeugt Überwindung der restlichen DNA Lk auch "linking number" genannt: Ist die Anzahl an Watson- Crick Twists in einem zyklischen Chromosom in einer planaren Projektion. Tw auch "twist" genannt: Die Anzahl an Watson-Crick Twists in dem Chromosom, wenn es nicht eingeschränkt wäre in einer Ebene zu liegen. Wr auch "writhe" genannt: Anzahl an superhelical Twists. Lösung zu Problem 1: Kontrolle von Supercoiling spielt eine entscheidende Rolle bei der Entspannung von supergewickelten DNA und der Organisierung von DNA in Bakterien und Archaeen. Topoisomerase Führt einen Cut an einem DNA Strang durch. Dies erlaubt der DNA sich zu entspannen, wenn sie für die Replikation abgewickelt wird. Danach verbindet das Protein den Strang wieder. Seite 57 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Links: Supergewickelte DNA in Bakterien und Archaeen. Diese Organismen verwenden sogar ATP, um die DNA superzuwickeln. So kann sie im Organismus geordnet werden und braucht nicht so viel Platz, als wäre sie linear. Ausserdem dient diese Form der Stabilität (Aus diesem Grund können einige Archaeen und Bakterien auch bei hohen Temperaturen überleben, ohne dass die DNA geschmolzen wird). 2. Problem: DNA Stränge sind antiparallel, eine Synthese muss in die Entgegengesetzte Richtung ablaufen, besitzt aber dieselbe Reaktion. Der Beginn der Replikation ist viel weniger Akkurat, als wenn die Replikation einmal läuft. Aus diesem Grund wird der sogenannte RNA primer (nicht so genau, viele Fehler) durch die Primase erstellt. Die DNA Polymerase III beginnt dann die Replikation an diesem RNA Primer mit einer extrem hohen Genauigkeit. Unten: Templatestrang Oben links: Primer Seite 58 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 Polymerasen Haben eine Form wie eine rechte Hand («Finger und Daumen»). Die Aktive Stelle des Proteins befindet sich bei der «Handfläche». Ausserdem besitzen sie einen Teil (Exonuclease), welcher für die Fehlerkorrektur benötigt wird. Reaktionsmechanismus Nukleophiler Angriff: Der Sauerstoff attackiert den Phosphor von einem Triphosphat (ATP, erstellt so eine Bindung zwischen dem Sauerstoff und dem Phosphor. Dabei wird Diphosphat (PPi) abgespalten. Dieses Reagiert mit Wasser zu 2 Phosphat (Pi), welches wieder zur Herstellung von Triphosphaten verwendet werden kann. - Lösung zu Problem 2: Lagging Strang (3 (Okazaki Fragments). Dies Führt zu einem neuen Problem: Lücken schliessen und RNA Primer entfernen. a) Die DNA Polymerase III Synthetisiert das Okazaki -P Ende eines RNA Primers b) Die DNA Polymerase III verlässt den Strang und die DNA Polymerase I Bindet an dem Strang c) Die DNA Polymerase I schneidet den RNA Primer Nukleotid pro Nukleotid heraus und vollendet den Strang bis es den Start der DNA erreicht und verlässt dann den Strang. DNA Ligase bindet an den Strang. d) Die DNA Ligase schliesst die Lücke zwischen den zwei erstellten Strängen (Die Lücke ist eine Backbone Lücke: hat kein fehlendes Nukleotid!) e) Die DNA Ligase verlässt den Strang, die Okazaki Fragments sind verbunden. Seite 59 von 136 Zusammenfassung Biologie Semester 1 DNA Replikation Gabelung Replikation in E. Coli Die DNA in E. Coli bildet Ringe. Die Replikation beginnt an einem Startpunkt und geht von diesem in beide Richtungen (2 Replikationsgabelungen, replikation bubble). Der kritische Moment ist, wenn diese Gabelungen sich beim Terminus treffen. Die Replisome* geben einander das Signal, dass die Replikation vorbei ist und beenden die Replikation. Zwei identische Genome sind das Ergebnis. *Replisome (DnaA): Gesamtheit aller an Replikation beteiligter Enzyme. Bestehend aus zwei Kopien von DNA Polymerase III (da die Replikation in diesem Fall unbedingt Synchronisiert ablaufen muss), Helicase, Primase und anderen Elementen, welche die Effizienz erhöht. DNA Reparatur DNA Polymerasen haben einen Fehlerkorrigierenden Exonuclease Teil, welcher eine Fehlerrate von 1 in 1'000'000 garantiert. (Synthese; Fehlerrate 1 in 10'000) Es gibt zusätzliche Fehlerkorrekturmechanismen als die der DNA Polymerase (weil 1 von 1'000'000 Fehlern führt zu ca. 1000 Fehlern pro kopiertes menschliches Genom) Spontane Mutationen (10'000 pro Tag pro Zelle) Seite 60 von 136