Zusammenfassung Genetik PDF

ZUSAMMENFASSUNG GENETIK SUBDISZIPLINEN DER GENETIK:  Klassische Gene9k  Molekulare Gene9k  Popula9onsgene9k  Entwicklungsgene9k  Quan9ta9ve Gene9k o Polygenische Merkmale: Mehrere Genotypen spielen zusammen um ein Merkmal auszuprägen...

ZUSAMMENFASSUNG GENETIK SUBDISZIPLINEN DER GENETIK:  Klassische Gene9k  Molekulare Gene9k  Popula9onsgene9k  Entwicklungsgene9k  Quan9ta9ve Gene9k o Polygenische Merkmale: Mehrere Genotypen spielen zusammen um ein Merkmal auszuprägen o QLT-Mapping: Kar9erung von quan9ta9ven trait loci)  Iden9Lka9on von trait loci: Chromosomenregion mit einem oder mehreren Genen die zu einem Merkmal beitragen MODERNE PROBLEME UND ANWENDUNGEN DER GENETIK  Humangene;sche Diagnos;k: o Erkennen und Nachweisen von Erbkrankheiten o Entwicklung von Nachweisverfahren o Erfassen von gene9schen Risikofaktoren  Genomanalyse: Analyse von Genomen durch Sequenzanalyse o Vorhersage der Genregula9on  Genom-wide associa;on studies o Erfassen von polygener Erbgänge o Wechselspiel allelischer Varianten o Erkennen der Risikofaktoren gene9scher Erbkrankheiten GENETIK IST EIN STUDIUM VON MODELLORGANISMEN & Anforderungen an Modellorganismen: &  Leichte Aufzucht im Labor  Große Nachkommenschaf  Gute Unterscheidbarkeit in Phänotypen Gene :  Kleines Genom abgesehen) - S  Mu9erbarkeit S  Relevant für den Menschen Studium von MODELL - ist ein Contik , Woraus bestehen Gene? ORGANISMEN 4) kleines Genom Kriterien welche ein Gen erfüllen muss: Menschen S relevant für den  Informa9on muss stabil gespeichert werden  Informa9onen muss genau replizierbar sein  Informa9on muss veränderbar sein (Muta;on) EXPERIMENT VON GRIFFIN Er isolierte zwei Stämme von Streptococcus pneumoniae:  S Stamm bildet glaYe (smooth) Kolonien  R Stamm bildet raue (rough) Kolonien Der S Stamm ist virulent und führt zur Infek9on (weil er eine Polysaccharidkapsel die Virulenz und glaYe OberZäche verursacht trägt), der R Stamm hingegen ist nicht pathogen! Verschiedene Arten von Polysaccharid Hüllen führen zu verschiedenen S Hüllen S I, S II, S III S Stämme können in R Stämmen mu9eren und auch wieder revidieren! Mu9ert ein S II Stamm in einen R Stamm, so kann dieser nur wieder zu einem S II Stamm revidieren. Die Injek9on von lebenden S Bakterien führt zum Tod. Mischen von lebenden RII Stämmen mit hitzeinak-vierten IIIS-Stämmen führt scheinbar zur Transforma9on lebender IIR Bakterien in lebende IIIS Bakterien. (gene9sches Material wurde von den toten IIIS auf die lebenden IIR Bakterien übertragen) Gribth hielt dieses gene9sche Material für Proteine, führte aber den Begric der Transforma)on ein. S Stämme wurden lysiert und verschiedenen Bestandteile enzyma9sch zerstört, nach Verdauung mit DNAsen war keine Transforma9on mehr möglich. erung vostripespremotion & -S-Stamm ↳ virulent - führt zu Infektion = polysaccharidkapsel ↑ glatte Oberfläche R-stämme verursacht wird in von lebenden S-Bakterien verursa  THE HERSHEY AND CHASE EXPERIMENT Verwenden den T2 Bakteriophagen um Bakterien zu inLzieren. Viren leben nicht und sind bei der Vermehrung auf Wirtszellen angewiesen. Viren sind Vehikel für gene9sche Informa9on. - & Hypothese: pement phagen infizieren Bakterien Gene9sches Material ist die DNA ↳virenlebennichtSinde Vermehrung hirtzellen der angewisen muti Möglicher Test: Onen Wird DNA oder Proteine von einer Genera9on auf die nächste weitergegeben? Test der Hypothese: Phagen werden in Bakterien, welche in Medien mit radioak9ven Protein- bzw. Nukleinsäurebestandteilen gezogen werden, vermehrt. So entstehen Phagen deren Nukleinsäuren (32P) oder Aminosäuren (35S) markiert sind. Die radioak9v markierten Phagen (Protein oder Nukleinsäure) werden für die Infek9on neuer Bakterien und die Erzeugung neuer Phagen verwendet. Nur die 32P-markierten Phagen hinterlassen Spuren in den Bakterien und führen zur Produk9on neuer Phagen, welche wiederum radioak9v sind - · M · 1. Phagen mit 32P-labeled INA infizierttilmedium ↳ wachst in ein 32p-contain PHAGEN MIT 35 S-laBeRED PROTEIN - zuruck - - * ·. Infizierte E 1. di mit 32P-labered T2 ~ er den leicht gemischt ↳ Radioaktivität wird aus dem nachko Wirt gewonnen und an den mmenden Phagen weitergegeben 2. Infizierte E cali mit. 355-Protein werden leicht gemischt den ↳Radioaktivität wird aus Zurückgebliebenen Viruspartikeln gewonnen und Nich - weiter. an denNachkommen gegeben BESTANDTEILE DES GENETISCHEN MATERIALS RNA kann komplexe Faltungen eingehen und so enzyma9sche Ak9vität erlangen (Ribozyme) DNA und RNA sind Polymere welche über Phosphodiesterbrücken verbunden sind. ChargaM Regel: Es gibt in etwa gleich viele A und T bzw. G und C  fördern/verlangen! Watson und Crick postulierten: * · da  Die DNA besteht aus zwei Polynukleo9dkeYen welche sich rechtsdrehend umeinanderwinden !   Die zwei Polynukleo9dkeYen verlaufen an9parallel Das Zucker-Phosphat Rückgrat beLndet sich auf der Aussenseite der Helix,während die Basen in deren erst Inneren übereinander gestapelt liegen.  Die Basen der zwei KeYen sind durch schwache Wasserstokrücken miteinander verbunden. A-T Doppelthelikes Basenpaare und G-C Basenpaare passen in die Dimension der Doppelhelix. Dies führt zur andereander ↳  Komplementarität der zwei Helices Einzelne Basenpaare in der Helix sind 0,34 nm voneinander ennernt. Eine Drehung der Helix nimmt 10bp oder 3,4 nm ein. Die Helix ist 2nm im Durchmesser.  Das Rückgrat der DNA wird durch eine Phospho-desoxy-Ribose KeYe aufgebaut, welche die Helix asymetrisch umwinden. Dies führt zur Bildung der Minor und Major Groove (Grosse und kleine Furche). Wasserstokrücken stellen schwache Bindungen dar, welche durch Erhitzen leicht gelöst werden können. D.h. Erhitzen denaturiert die DNA. Basenkomplementarität ermöglicht die Herstellung zweier exakter Kopien bei der Replika9on. d ⑫eine Verpackung von DNA ↓ find DNA ist eng verpackt in der Zelle Viren: DNA oder RNA, linear oder zirkulär Prokaryoten: zirkuläre DNA Eukaryoten: lineare DNA Chromosomen Po Enkaryothen lineare DNA , Chromosomen -Organchen : zirkulärere DNA Organellen: zirkuläre DNA Genome Genome Bakterielle DNA ist stärker gepackt durch Supercoiling  Wird einer der beiden Stränge eines Supercoils gebrochen, entsteht ein open circle Supercoiling kann posi9v (mehr Windungen) oder nega9v (weniger Windungen) sein. Supercoiling wird durch Topoisomerase herbeigeführt. Topoisomerasen spalten DNA winden oder entwinden sie und verknüpfen sie wieder. Sie sind für alle Arten von DAN Kompak9erung essen9ell. Bsp: Topoisomerase I: schneidet einen Strang der Helix und führt den zweiten durch den geschniYenen Strang.  ·commen # Zusätzlich sind bakterielle Chromosomen in loops organisiert. in Loops organisiert DNA Gehalt einer Zelle in pglbp - syne: Oktamere bestehend aus : 2x , H2a, ↳ DNA2b ,Histon Oktamer gewunden Pikogramm -Basenpaare Der C-Wert: bezeichnet den haploiden, nicht replizierten DNA Gehalt einer Zelle in pg oder bp. Im Zellkern von Eukaryoten ist DNA als Chroma9n organisiert. DNA komplexiert mit Histonen. Histone sind Oktamere bestehend aus je 2x H2a, H2b, H3, H4 DNA ist 2x um das Histon Oktamer gewunden. Das Linker Histon H1, ermöglicht höhere Kompak9erung. DNA REPLIKATION & Die Zentromere der Chromosomen stellen die Punkte des Spindelansatzes in der Mitose dar. DNA Replika9on ist semikonserva9v.  Meselson und Stahl Experiment  Verschiedene Dichte der DNA Stränge (S9ckstoc , N14, N15) DNA Polymerisa9on erfordert Desoxynucleo9dtriphosphate (Bausteine), eine DNAPolymerase (Enzym), ein freies 3’ OH Ende (Startpunkt) und ein Template (Vorlage) DNA-Replika9on verläuf IMMER von 5’ nach 3’ Die Energie für die Neusynthese stammt aus der Hydrolyse eines dNTPs (desoxyncleo9de-triphsophate) in ein n dNMP (…monophosphate). DNA Replika;on ist sehr schnell:  Bakterien- 850 Nukleo9de pro Sekunde  Eukaryoten- 60 bis 100 nt pro Sekunde DNA REPLIKATION IN BAKTERIEN DNA Replika9on beginnt an einem Origin of Replica;on. Eine Helikase (entwindet die DNA) wird durch ein Ladeprotein DnaC auf die DNA geladen. DNA wird par9ell entwunden. An dieser Stelle kann Replika9on beginnen. - Guania Proteine und Faktoren welche an der DNA Replika9on beteiligt sind: 1. DNA als Template (Vorlage) 2. DNA als Primer (freies OH-Ende) drign of Replication 3. dNTB durch DNal auf die DNA geladen 4. DNA-Polymerase 1 - Helicase word. ↳ partick entwunden 5. Magnesium Replikation ↳ Start der v  DNA Polymerasen und deren mögliche Ak;vitäten: Die Entfernung  5’-3’ Polymerase Ak9vität (zur Neusynthese von DNA) von Nudestiden  3’-5’ Exonuklease Ak9vität (Ennernt gerade eingebaute Nukleo9de vom 3’ Ende wenn diese nicht wird durch Spaltung korrekt zB falsche Basenpaarung eingebaut wurden) “Proofreading Ak9vität” Von Phosphoriester  5’-3’ Exonuklease Ak9vität (Ennernt DNA oder RNA Stränge von deren 5’ Ende) eine  bindungenit Bakterielle DNA Pol I hat alle 3 Ak9vitäten  & Bakterielle DNA Pol III hat nur 5’-3’ Polymerase und 3’-5’ Exonuklease Ak9vität, jedoch keine 5’-3’ - Exonuklease Ak9vität erreicht ! Da DNA Polymerase keine de novo DNA Synthese beginnen können bedarf es immer einer Primase, welche ein kleines RNA Fragment zur Verfügung stellt (und somit ein 3’ OH Ende) Das 3’ OH Ende des RNA Primers wird durch DNA Pol III verlängert. Einer der beiden Stränge kann kon)nuierlich verlängert werden (leading strand). Der andere Strang wird diskon)nuierlich verlängert (lagging strand): Hier müssen ständig neue RNA Primer und kurze DNA Fragmente (Okazaki Fragmente) erzeugt werden, welche anschließend miteinander verknüpf werden (Ligiert). Um den RNA-Primer der DNA Synthese wieder zu ennernen wird DNA Poll III durch DNA Poll I (welche 5 – 3 Exonuclease Ak9vität besitzt) ersetzt. Ligase verschließt verbleibenden Nick DNA Synthese ist meistens bidirek9onal und bildet ein Auge. An jedere Replika9onsgabel Lndet sich daher ein leading und ein lagging strand: Semidiskon9nuierliche DNA Synthese. DNA REPLIKATION BEI EUKARIOTEN Eukaryoten besitzen mehrere Replikons (Startpunkte der DNA Synthese) welche durch ARS (Autonomous Replica9ng Sequences - ist eine Nukleo9dsequenz auf der DNA, die als Replika9onsursprung zur Einleitung der Replika9on dient.) deLniert sind. ARSs werden durch ORCs (Origin Recogni9on Complexes – Protein Komplexe) ⑫ erkannt. Jedes eukaryo;sche Chromosom besitzt mehrere ARS.  GENEXPRESSION Was ist die Funk9on von Genen?  Gene kodieren für Proteine  Herstellung von Proteinen ARCHIBALD GARROD EXPERIMENT Der Arzt Archibald Garrod studierte 1902 Alkaptononurie Pa9enten. Er zeigte, dass Alkaptonurie eine rezessive Erbkrankheit darstellt. Garrod zeigte, dass Alkaptonurie Pa9enten Homogen9sinsäure ausscheiden. Er Bakterienstämme postulierte daher, dass Alkaptonurie Pa9enten Homogen9sinsäure nicht metabolisch abbauen können. Er , die aufgrund einer schloss, dass eine Blockade in einem metabolischen Prozess zur Anhäufung von Schadstocen eines Mutation Synthese Fähigkeit verloren Stocwechselintermediats führt.. haben & AUXOTROPHE (Mangelmutante) MUTANTEN Neurospora – (GaYung von Schimmelpilzen) verwendet man um Mutanten zu isolieren, welche in bes9mmten Stocwechselwegen defekt sind. Auxotrophe Mutanten sind auf zugegebene Aminosäuren angewiesen, da bes9mmte Gene ausgefallen sind und der Prozess nicht mehr funk9oniert. eng ② Beadle und Tatum isolierten a. M. aus N. crassa Proteinen Alkaptonurie Patienten ↳ eine rezessive Erbkrankheit ! A Patienten scheiden > - 13. Homogentisin. Saure aus H säure > A - Bakterien können. , keine metabolisch abbahen ? => eine Blokade in einem metabolischen n PreAufungvonSchadsto I ! Id E AUXOTROPHE MUTANTEN : Mutanten Isolierung = Neuro- spora ↳ sind in bestimmten Stoff. wechselwegen defekt A Mutanten =) auf. Zugegebene Aminoscuren augenisen I ↳ bestimmte gene ist ausgefallen und Prozess kann der nicht mehr funktionieren - wenn ein Organismus einebestimmteVerbindungse an den kann , fehlt muscheinlich wir für die Umwa ein Enzym , das norung erforderlich ist ↳ Mutation Liegt in den Gen , das dies Enzym codiert - Durch Analyse mehrerer met- Auxotrophie Mutanten gelang es, biochemische Pathways zu erstellen und die daran beteiligten Enzyme zu bes9mmen. Dies führte zur 1 Gen- 1 Enzym Hypothese. Da bald klar wurde, dass manche Enzyme aus mehreren Proteinen bestehen, wurde die Hypothese als 1 Gen- 1 Polypep)d Hypothese neu formuliert. BEISPIELE NICHT KODIERENDER RNAS (WERDEN NICHT IN PROTEINE UMGESCHRIEBEN)  Ribosomale RNA (rRNA): bildet den Grossteil des Ribosoms (Transla9on)  Small nuclear RNA (snRNA): bildet den kataly9schen Teil des spliceosoms (RNA splicing)  Small interfering RNA (siRNA): essen9eller Teil der RNA gesteuerten Interferenz (RNAi)  Small nucleolar RNAs (snoRNAs): steuern ModiLka9onen in der rRNA  Micro RNAs (miRNAs): regulieren die Transla9on und Stabilität von RNAs  Short heterochroma7c RNAs (shRNA): Kontrollieren die S9llegung von chromosomalen Regionen TRANSKRIPTION Wie wird die gene9sche Informa9on in Polypep9dkeYen umgesetzt?  1: Bei der Transkrip9on wird DNA in RNA umgeschrieben.  2: Bei der Transla9on wird die in RNA gespeicherte Informa9on in Proteine übersetzt Bei der Transkrip9on wird ein DNA Strang in RNA umgeschrieben. Da RNA (wie DNA) nur in 5’ –> 3’ Richtung synthe9siert werden kann, muss die DNA in 3’ – 5’ Richtung gelesen werden. D.h. der 3’-5’ Strang ist der Template Strang! Der 5’-3’ Strang ist dem RNA Strang nahezu ident (Coding strand). Die Synthese neuer RNA wird durch eine RNA Polymerase katalysiert. Um den Startpunkt der RNA Synthese zu deLnieren, werden regulatorische Sequenzen benö9gt. TRANSKRIPTION IN BAKTERIEN Transkrip9on in Bakterien erfordert Ini)a)on, Elonga)on und Termina)on der Transkrip9on erfordert einen Promoter. Der Promotor bes9mmt ORT und RICHTUNG der RNA-Neusynthese. Der Promotor und die kodierende Sequenz sind Teil eines Gens, d.h. bilden eine funk9onelle Einheit. Promotor, Elonga;on und Terminator bilden ein Gen! Bes9mmte Nukleo9de kommen an bes9mmten Posi9onen eines Genes (Pos. -10 und -35) aucällig häuLg vor. Grund dafür ist ein Faktor, welcher der Polymerase hilf den Start (Ini9a9on) einzuleiten (Sigmafaktor ist eine Proteingruppe). Er entwindet dieses RNA Stück. Nach dem Entwinden der DNA fällt der Sigma Faktor herunter und die RNA Polymerase kann Transkrip9on beginnen. Während der Elonga9on verändert die Polymerase Ihre Form (wird kompakter). Bakterielle RNA Polymerase hat eine eigene entwindungs Ak9vität und kann den Strang im vortlauf selbst entwinden. Termina;on der Transkrip;on (Beendung von Transkript) auf 2 Wegen:  Rho (=Helikase) abhängige Termina9on: Eine C Reiche Sequenz in der RNA erlaubt das Binden von Rho. Rho ist eine Helikase und folgt der RNA Polymerase. Durch ATP-abhängiges Entwinden der RNA dissoziiert (fällt herunter) die RNA.  Durch terminale Hairpins (Haarnadeln) reguliert.  Einzelner RNA Strang möchte mit Basen paaren und so entsteht diese Struktur eines Hairpins. Die Struktur verlangsamt die RNA Pol. Die folgenden U- reichen Sequenzen destabilisieren die RNA Interak9on mit dem Template Strang und die Polymerase dissoziiert (fällt herunter). TRANSKRIPTION IN EUKARYOTEN In Eukaryoten werden verschiedene RNAs durch verschiedene RNA Polymerasen gebildet:  Ribosomale RNA (rRNA) macht den Großteil der zellulären RNA aus. Aus rRNA werden Ribosomen gebildet. rRNA wird durch RNA-Polymerase Isynthe9siert.  Messenger RNA (mRNA) kodiert für Proteine. Enthält die Informa9on, die am Ribosom in ein Protein übersetzt wird. mRNA wird von RNAPolymerase II synthe9siert.  Kleine nicht kodierende RNAs (snRNAs, tRNAs, snoRNAs) haben regulatorische oder kataly9sche Funk9on. Werden von RNA-Polymerase III synthe9siert.  Regula9on der Proteinkodierenden Gene: Beginn der eukaryo9schen Transkrip9on ist bei der TATA-Box. Pol II wird an die TATA- Box Stelle gebracht. Zusätzlich braucht Pol II Promotoren und Enhancer- Sequenzen ( sind aber weiter weg auf dem RNA Strang). TBP und TFIIs (Transkrip9onsfaktor) assemblieren (= vereinigen, versammeln) an der TATA Box. An die RNA Pol II lagern sich SchriY für SchriY immer mehr Transkrip9onsfaktoren an. Zum Schluss ist 1 Molekül dabei welches die Ladung des Phosphorrests der Pol II verändert, und ganz stark nega9v macht. Und dies führt dazu das die Polymerase von diesen Komplex losgelöst wird und mit ihrer Transkrip9on beginnen kann. Wich9g ist der TFII H: Er hat sowohl Helikase und Kinase Ak9vität (= hängt Phosphate dran). Die Helikase entwindet die DNA. Die Kinase Phosphoryliert den C-Terminus von Pol II. Transkribierte RNA besteht aus der proteinkodierten Sequenz und daneben hat man eine 3`untransla9erte und eine 5`untransla9erte Region. 5’ und 3’ Untransla9erte Region bes9mmen die Stabilität und Transla;erbarkeit einer RNA. Wenn ein Stück RNA synthe9siert worden ist, wird ein methyl-Guanosin (= auch Cap genannt) an ein 5`Ende gebunden. Bewerkstelligt wird das Ganze von dem „capping-Enzym. Jedes RNA Stück das dieses Cap hat, wird in weiterer Folge in Proteine übersetzt. Am 3´Ende werden Pol II Transkripte auch nochmal modiLziert. Ein langes Stück welches lauter As enthält wird drangehängt. Wenn ein Transkript ins Lnish geht, gibt es Erkennungsproteine welche an die Sequenz binden und einen SchniY machen (RNA wird gespalten). Dann wir von PAP (Poly A Polymerase ) am 3`Ende viele A Nukleo9de drangehängt (=Polyadenyla9on). Eukaryo9sche Gene sind immer von nicht kodierenden Sequenzen (Introns) unterbrochen. Diese Introns werden durch prä-mRNA Spleissen ennernt. Exon = kodierene Sequenz. Alterna9ves Spleissen ist eine Möglichkeit aus einem Gen mehrere verschiedene Proteine zu erzeugen. Ein weiterer Unterschied zwischen Prokaryoten und Eukaryoten: Prokaryo9sche RNA wird bereits kotranskrip;onell transla;ert. Eukaryo9sche RNA wird modiLziert, prozessiert, aus dem Kern expor9ert und erst im Zytoplasma transla;ert. TRANSLATION Sie Lndet am Ribosom staY. STRUKTUR EINER AMINOSÄURE Einzelne Aminosäuren werden durch Pep9dbindungen miteinander verknüpf. Diese Verknüpfung erfolgt am Ribosom. GENETISCHER CODE (TRIPLETT CODE) Der Code ist redundant: Für eine bes9mmte Aminosäure gibt es mehrere verschiedene TripleYs. Diese unterscheiden sich meist in der driYen Base. Dies ist nur möglich, weil von den insgesamt 64 Kombina9onen nur 23 benö9gt werden und 41 überzählig wären. EXPERIMENT AN BAKTERIOPHAGEN T4 BESTÄTIGEN DEN TRIPLETTCODE Pro\avin (wurde den Stämmen hinzugefügt)  Hinzufügen oder Ennernen einzelner Basen; führt zur Muta9on und Bildung anderer Aminosäuren Wenn eine Base hinzugefügt wird, wird nach zwei Falschproduk9onen wieder die rich9ge Aminosäure gebildet. Durch das Hinzufügen von 3x je einer Base an benachbarten Posi9onen kann die Proteinfunk9on wieder hergestellt werden. WIE LAUTET DER GENETISCHE CODE? Nieren und Khorana decodierten den gene9schen Code indem sie synthe9sche RNA (sie wussten genau wie der Code aussieht) in ein zellfreies Transla9onssystem zufügten. So fanden sie heraus welcher Code für welche AS kodiert. Die driYe Posi9on eines TripleYs kann eine ungenaue Basenpaarung eingehen (Wobble Hypothese) WOBBLE BASEPAIRING Eine ungenaue Basenpaarung, welche zur Diversität der AS führt. Neues Nucleo9d in der tRNA Inosin (I) ist dem Adosin sehr ähnlich. Es fehlt eine Aminogruppe. Jede tRNA wird mit einer speziLschen Aminosäure beladen. Das An9codon der tRNA basenpaart mit dem Codon der mRNA. tRNAs nehmen eine Kleebla^struktur (durch Basenpaarungen) ein. (2 dimensional) Alle tRNAs haben eine CCA Sequenz an deren 3’ Ende. Diese Sequenz wird post- transkrip9onell angefügt. Ermöglicht das Anhängen an das Ribosom durch Aminoacyl-tRNA Synthethase (belädt tRNAs unter ATP Verbrauch) Die Carboxylgruppe der As bindet an das 3`oder 2`Oh der tRNA. tRNA ist mit AS beladen und mach sich auf dem Weg zum Ribosom. Dort angekommen bindet An9codon der tRNA mit mRNA Code. An P Side wird Polypep9dkeYe ausgebildet. Leere tRNA wird durch E Side herausgeschleust. In gefaltetem Zustand nimmt die tRNA eine L-Form ein. RIBOSOMEN IN BAKTERIEN UND EUKARYOTEN Prokaryoten: Eukaryoten: rRNA zur Bildung von Ribosomen. Transla9on wird in 3 Phasen reguliert: Ini9a9on (Start), Elonga9on, Termina9on (Stop) In Bakterien: Shine-Dalgarno Sequenz deLniert wo sich Start auf mRNA beLndet. Erst dann kommt tRNA dazu. In Bakterien ist das erste Methionin (AUG) modiLziert= Formylmethionin ): TRANSLATION IN EUKARYOTEN  Erfordert eIFs  Benö9gt keine Shine Dalgarno Sequenz weil Caps vorhanden sind  mRNA muss ein Cap tragen (wenn RNA fer9g synthe9siert wurde bekommt sie durch ein Capping- Enzym ein Cap) 1. eIFs und eine mit met-tRNA beladene kleine Untereinheit der Ribosomen, scannt das 5‘ Ende der RNA bis zum ersten AUG (Start). 2. Nach Erkennen des AUGs bindet die große Einheit des Ribosoms an die kleine Untereinheit und die eIFs werden bis auf das eIF4E entlassen. Dieser erkennt die Cap Struktur. 3. Ef-TU (Elonga;onsfaktor) wird benö9gt damit tRNA an die a-site binden kann (1. Sta9on) 4. tRNA mit Aminosäure ist in a-site  die Pep9dkeYe aus der p-Stelle wird an die neue AS von tRNA in a-stelle geknüpf und alle tRNAs rutschen um eine Stelle weiter Richtung Exit. 5. Leere tRNA wird durch e-site herausgeschleust 6. Nächste tRNA mit Aminosäure kommt ins Ribosom, gibt AS wieder an p-site ab und p-site verknüpf AS (Pep;dyl-transferase Ak;vität) durch Pep9dbindung aneinander (Wiederholungsprozess) 7. Bis das tRNA Stopp Kodon gelesen wiederholt sich dieser Vorgang immer wieder Sobald das Risosom einige codons vom Start-Codon ennernt ist, kommt es zu einer neuen Transla9onsini9a9on. Dieser Prozess wiederholt sich immer wieder, sodass ein Polysome (mRNA mit vielen Ribosomen) entsteht. Der Vorgnag endet wenn Stopp-Kodon UAA, UGA, UAG) in mRNA erscheint. Es gibt keine tRNAs die an diese Kodons andocken können. StaY einer tRNA bindet ein Releasefaktor (RF1 erknnet Stopp-Kodon) an Stopp- Kodon. Daher zerfällt das Ribosom wieder in seine Einzelteile und die Pep9dkeYe wird freigegeben. RF 3 ini9iert Termina9on/Zerfall des Ribosoms) REGULATION DER GENEXPRESSION IN BAKTERIEN UND PHAGEN Genexpression: Wie der Genotyp eines Organismus oder einer Zelle als Phänotyp ausgeprägt wird. Inducers und Repressors kontrollieren die Genexpression. Inducers sind of kleine Moleküle (z.B. Metabolite). Diese kleinen Moleküle werden of von DNA-bindenden Proteinen erkannt, welche als Ak9vatoren oder Repressoren der Transkrip9on wirken. Operon-Modell: AbschniY der DNA Sequenz besteht aus Regulator und Operon (Operator, Gene und Promotor) Einfachste Form der Energiegewinnung für eine Zelle ist der Abbau von Glucose. Wenn Glucose nicht vorhanden ist wird Lac-Operon angeschalten. Lac-Operon ist ein GenabschniY der für einige Gene kodiert um Energie zu gewinnen indem Laktose abgebaut wird. Dieses kodiert für ß-Galactosidase (lacZ), Lactose permease (lacY), ß-Galactoside transacetylase (lacA). Ist Laktose vorhanden, bindet sich das Laktose Molekül an den Repressor. (Schlüssel-Schloss-Prinzip) Deshalb kann der Repressor nicht mehr an dem Gen binden. Aus diesem Grund setzt Polymerase fort und es werden Enzyme zum Abbau von Laktose hergestellt. Ist keine Laktose vorhanden ist der Repressor wieder ak9v, bindet am Gen und stoppt die Produk9on.  SUBSTRATINDUKTION: Kontrolle zum Abbau von StoMen (Wenn Substrat (z.B.: Laktose) vorhanden ist, wird der Form des passenden Repressor verändert und er kann nicht mehr binden. Danach werden Enzyme zum Abbau des vorhandenen Substarts hergestellt. Wenn keine Glukose aber Laktose vorhanden ist wird Laktose durch ß-Galactosidase in Allolaktose umgewandelt. Die Anwesenheit von Lactose und die Abwesenheit von Glukose induziert die Expression dieser Gene 1000x. Die RNA ist instabil. Abwesenheit von Lactose schaltet diese Gene sofort ab. ABER: Die Zelle entscheidet sich immer zuerst für den Abbau von Glucose (wenn Glucose vorhanden ist), Lactose wird nur im „Nonall“ abgebaut. Nega9ve Regula9on = Repressor verhindert das Binden der RNA Polymerase EXPERIMENT VON JACOB UND MONOD (BILDER SIEHE FOLIE) Experimen9erten an Lac-Operon. Cis Ak;vität des Operators: Ausgangslage: 2 Gensequenzen; bei einer Sequenz wurde ein Gen und der Operator mu9ert  Repressor konnte nicht an den mu9erten Operator binden, daher wurden mu9erte Enzyme hergestellt (synthe9sch verkleinert) Ausgangslage: 2 Gensequenzen, bei einer Sequenz wurde ein Gen und der Operator mu9ert und anschließend ein Inducer (Allaktose) hinzugefügt  Repressor konnte nicht an den mu9erten Operator binden, daher wurden mu9erte Enzyme hergestellt (synthe9sch verkleinert) Zusätzlich fällt der Repressor beim nicht mu9erten Operator herunter, daher werden auch normal große Enzyme hergestellt Trans Ak;vität des Repressors Ausgangslage: Lac-Operon bei dem der Repressor mu9ert ist  Repressor kann nicht an Operator binden, daher werden Enzyme durchgehend hergestellt Ausgangslage: 2 Gensequenzen, bei einer Sequenz wurde ein Gen und der Repressor mu9ert, sodass er nicht an Operator binden kann  Nicht mu9erter Repressor von Sequenz 1 bindet sowohl an den eigenen Operator als auch an den von Sequenz 2, Mu9erter Repressor kann nicht binden Ausgangslage: 2 Gensequenzen, bei einer Sequenz wurde ein Gen und der Repressor mu9ert, sodass er nicht an Operator binden kann und anschließend ein Inducer (Allaktose) hinzugefügt  Inducer löst nicht mu9erten Repressor von beiden Sequenzen, daher werden sowohl mu9erte als auch nicht mu9erte Enzyme hergestellt, Inducer hat keinerlei Auswirkungen auf mu9erten Repressor Ausgangslage: 2 Gensequenzen, bei einer Sequenz der Repressor mu9ert, aber er kann an Operator binden, anschließend wurde ein Inducer (Allaktose) hinzugefügt  Inducer kann nicht an mu9erten Repressor binden, daher wird Polymerase weiterhin unterbunden  ENDPRODUKTREPRESSION: Kontrolle zum Auaau von StoMen (Wenn das Endprodukt (z.B.: Tryptophan) in ausreichender Konzentra9on in der Zelle vorhanden ist, bindet sich das Endprodukt an den Repressor, wird also zum Inducer und stoppt die Produk9on, solange bis eine niedrige Konzentra9on herrscht und Repressor wieder vom Operator fällt. In der Abwesenheit von Tryptophan bildet die DNA Sequenz eine Sekundärstruktur aus, welche die Termina9on verhindert. GENREGULATION BEI EUKARIOTEN Genregula9on auf verschiedenen Ebenen:  Transkrip9onskontrolle  Regula9on des RNA- Processing (Herausschneiden der Introns)  RNA Stabilität (Poly A Tail – wird an RNA angefügt um zu stabilisieren)  Transla9onskontrolle  Proteinstabilität (Unterschiedliche Halbwertszeiten)  Protein ModiLka9on (Reste werden angesetzt um die Faltung eines Proteins zu beeinZussen) Es ist einfach ein bereits fer9ges Protein zu modiLzieren als eine ganz neue Transkrip9on für ein neues Protein zu starten  schnellere Reak9on auf UmwelteinZüsse TRANSKRIPTIONSKONTROLLE 1. Transkrip9onsfaktoren binden am Start = TATA Box mit Promotor (sind in der Nähe der Polymerase angesiedelt) 2. Kontrollsequenz (Enhancer) reguliert die Genak9vität (HäuLg/nicht häuLg) 3. Enhancer ist auf weitere Transkrip9onsfaktoren (Ak;vatoren) angewiesen um Transkrip9onsrate zu steigern 4. Silencer reduzieren die Transkrip9onsrate = Gegenstück zu Enhancer (Transkrip9onsfaktoren von Silencer heißen Repressoren) 5. Falls nö9g binden sich Ak9vator/Repressor an die Transkrip9onsfaktoren vom Promotor (direkter Kontakt, sofor9ge Einleitung) 6. Mediator Bindungsstelle zwischen Ak9vatoren/Repressoren und Promotor samt Transkrip9onsfaktoren und TATA Box Ak9vatoren bzw. Repressoren arbeiten nach demselben Schema wie bei Prokaryoten MÖGLICHE WIRKWEISEN VON HORMONEN AUF DIE TRANSKRIPTION Hormonproduzierende Zelle kann Hormone auf zwei Wegen an Zellen weiterleiten: 1. Polype9dhormon: An der Außenseite der Zellmembran ist ein Repressor, welcher mit dem Hormon bindet  Startet Informa9onsweitergabe an Zellkern 2. Steroidhormon: Dicundiert durch Zellmembran, bindet in der Zelle an Rezeptor und dieser schleust Hormon in Zellkern  HSP90 „Mantel“ um den Rezeptor (Heat shock protein) verhindert die vorzei9ge Ak9vierung des Steroidhormon- Rezeptors im Zytoplasma. Wenn Hormon in die Zelle eintriY löst es den Mantel vom Rezeptor und bindet sich selbst an  diesen Rezeptor.  Weiterleitung in den Zellkern und Ak9vierung der Transkrip9on Umso mehr Ak9vatoren vorhanden sind, desto weniger Transkrip9onsfaktoren werden benö9gt und eine größere Anzahl von Genen kann kontrolliert werden. GLOBALE REGULATION Histon ModiLka9onen können Transkrip9on regulieren  Chroma9n wird gelockert um Transkrip9on zu starten Bei Eukaryoten werden teilweise die Basen der DNA selbst modiLziert. Cytosin wird Methylgruppe angehängt  Führt zur dichteren Verpackung der DNA, dadurch kann Transkrip9on inhibiert werden. MUTATION UND REPERATUR Arten von Muta;onen:  Chromosomale Muta;on: Betrecen ganze Chromosomen oder deren Teile. Führt so zum Fehlen mehrerer Gene.  Punktmuta;onen: Betrecen einzelne Gene  Muta;on durch transportable Elemente: Mobile DNA Muta9onen können, müssen aber nicht zur Veränderung eines Genprodukts führen. Experiment von Luria und Delbrück: Das Experiment bewies die Rich9gkeit des Darwinismus. Adap9on Soma;sche (Zelle betreMende) Muta;onen betrecen nur das Soma. Sind nicht vererbbar Keimbahn Muta;on Betrece alle nachfolgenden Genera9onen (bringen aber für den Träger keine Veränderung mit sich.) PUNKTMUTATIONEN 1) Transi;on (Purin bzw Pyrimidendesaminierung) HäuLg durch Desaminierung, Iden9tät der Base wird nicht verändert aber die SeitenkeYe 2) Transversion (Austausch von Purin und Pyrimidin) Bsp: C-G wird zu G-C 3) Missens (Iden9tät des Codes wird verändert) Andere Aminosäure entsteht  4) Nonsense (Coding zu Stop) Aus einem Code für Aminosäure, wird ein Stopcodon. Führt zur Bildung von verkürzten Proteinen Supressor Muta9on können dies wieder kompensieren  Sie können intra- oder extragenisch aufreten (im selben oder in einem anderen Gen) 5) Neutrale (AS Charakter bleibt gleich) Es kommt zum Einbau einer ähnlichen AS 6) Silent (Iden9tät des Codes bleibt gleich) 7) Frameshib (Leserahmen wird verändert) Durch Addi9on oder Dele9on einer Basenpaarung Muta;onen werden in weiteren Replika;onsschri^en cxiert. (=tautomere Basenpaarung) Replika;onsfehler können zur Inkorpora;on (Einfügung) zusätzlicher Basenpaare führen (slippage) Dies geschieht meistens, wenn viele gleiche Nucleo9de hintereinander transkribiert werden müssen. Depurinierung kann zum Verlust von Purin führen! Desaminierung ist die häucgste Muta;on (Cytosin wird durch Deamina;on zu Uracil) UV-Strahlung führt zur Bildung von Nucleo;d-Dimeren (aus zwei gleichen Molekülen aufgebaute chemische Verbindung). HäuLg bilden Thymine Thymin-Dimer aus, welche über kovalente Bindungen (teilen sich ein Elektronenpaar) zusammenhalten. Ionisierende Strahlung (Röntgen) oder Radioak9vität erzeugt Punktmuta9onen in niedriger Konzentra9on, hohe Konzentra9onen erzeugen Chromosomenbrüche. CHEMIKALIEN UND DEREN MUTAGENE WIRKUNG: Beispiel, das sie näher erklärt hat. AMES TEST Test auf mutagene Wirkung chemischer Komponenten. Nicht toxische Komponenten werden of erst durch deren metabolische Veränderung toxisch. Toxisches MiYel wird mit RaYenleber-Extrakt vermengt und danach wird untersucht ob die Substanz mutagene Eigenschafen hat. Da Bakterien haploid können Muta9onen zur Ausprägung eines Phänotypen führen. REPARATUR VON MUTATIONEN NUKLEOTID EXICISON REPAIR Exis9ert in fast allen Organismen. Thymin Dimere werden erkannt. Der defekte Strang wird geschniYen und eine Helikase entwindet den Strang. Nach Reparatur durch Pol 1 wird die Stelle durch Liga9on versiegelt. MISMATCH REPAIR In Bakterien: Falsche Base wurde eingebaut. Enzym erkennt Mismatch (MutS). Alter Strang wird erkannt durch Metyhlierungsreste am Adenin. MutH und MutL unterscheiden den methylierten vom unmethylierten Strang und entscheiden welcher der neue ist welcher korrigiert werden muss. Exonuklease ennernt die falsch eingebauten Nukleo9de. Pol III repariert den Strang. In Eukaryoten: keine Methylierung am Strang. Vier Gene MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 werden für mismatch repair benö9gt. Defekte in Reparaturmechanismen sind Auslöser für Erbkrankheiten und Tumoren. MENDELSCHE GENETIK Merkmale (traits) werden durch Gene und UmwelteinZüsse beeinZusst und ergeben so den Phänotyp! Uniformitätsregel: Werden reinerbige Linien, welche sich in einem Merkmal unterscheiden, miteinander gekreuzt, so sind alle Nachkommen dieser Kreuzung in Bezug auf dieses Merkmal uniform. (=reziprok, unabhängig welches Elternteil vererbt) Spaltungsregel: Wird die Monohybride F1 mit sich selbst gekreuzt (bei zweigeschlechtlichen Organismen ge-selfed) so spaltet sich das Merkmal in der F2 in einem bes9mmten Verhältnis auf. Hier: 3:1 Da glaY über runzelig dominant ist. Die verschiedenen Varianten eines Gens, werden als Allele bezeichnet. Unabhängigkeitsregel: Allele, welche unabhängige Merkmale beeinZussen, werden unabhängig voneinander vererbt. Dies gilt natürlich nur, wenn diese auf unterschiedlichen Chromosomen liegen. Die F1 einer solchen Dihybriden Kreuzung ist wieder uniform. Die F2 einer solchen Kreuzung erhält Merkmale im Verhältnis von 9:3:3:1 DOMINAT-REZESSIV: DIE URSACHEN Albinismus = rezessiver Erbgang Achondroplasie (Zwergwuchs) = dominante Muta9on in FGFR3 (Lbroblast growth factor receptor 3) CHROMOSOMALE GRUNDLAGEN DER VERERBUNG Die Posi9on des Zentromeres (Spindelansatzpunkt) bes9mmt den Typ des Chromosoms. FISH Fluoreszenzfärbung der Chromosomen und wird zum Erstellen eines Karyogramms verwendet. Im Zellzyklus wird die DNA in der S Phase verdoppelt, in der M Phase (Mitose) wieder auf die zwei Tochterzellen aufgeteilt. Mit C Wert wird der DNA Gehalt einer haploiden G1 Zelle bezeichnet. Eine Diploide Zelle in G1 hat demnach einen 2C Wert, während eine Zelle in G2 (nach der S Phase und vor der Mitose) einen 4C Gehalt hat Chromosomen welche in G1 aus einer Chroma9de bestehen, werden in der S Phase dupliziert sodass diese aus 2 Chroma;den bestehen, welchen am Zentromer zusammengehalten sind. MITOSE In der Mitose werden homologe Chroma9den voneinander getrennt und auf zwei Tochterzellen aufgeteilt.  Prophase: Centriolen verdoppeln sich, die Chromosomen Kondensieren, die Kernhülle beginnt sich aufzulösen  Prometaphase: Der Spindelapparat triY mit den Zentromeren der Schwesterchroma9den in Kontakt  Metaphase: Die Chromosomen ordnen sich in der MetaphaseplaYe an, alle Kinetochoren sind mit Spindeln versehen.  Anaphase: die Chroma9den trennen sich und werden an die gegenüber-liegenden Pole gezogen.  Telophase: Die Chromosomen dekondensieren, eine Kernhülle bildet sich wieder aus.  Zytokinese: Eine neue Zellmembran wird zwischen den Tochterzellen gebildet. MEIOSE Die Meiose ist eine spezialiserte Zellteilung welcher zur Reduk9on des diploiden Chromosomensatzes auf einen Haploiden dient. Rekombina9on zwischen homologen Chromosomen führt zur Neukombina9on von paternalen und maternalen Genen. Die Meiose besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Teilungen. Meiose I Während Meiose I kommt es zur Rekombina9on zwischen den Chroma9den der homologen Chromosomen. Rekombinierte homologe Chromosomen werden anschließend getrennt. Meiose II Während Meiose 2 werden die homologen Chroma9den voneinander getrennt umso 4 Geschlechtszellen (Gameten) zu erzeugen. Merkmale welche am gleichen Chromosom liegen werden gekoppelt vererbt und durch Rekombina;on können diese voneinander getrennt werden. Rekombina9on kann gekoppelte Gene neu kombinieren. Die Rekombina9onshäuLgkeit steigt mit der Ennernung am Chromosom. Durch Bes;mmen der Rekombina;onsraten (in einer großen Nachkommenschab) kann die Anordnung und Distanz von Genen am Chromosom bes;mmt werden. Fehlerhafes Aufrennen von Chromosomen (hier X- Chromosomen) kann zu Trisomien oder Monosomien führen. GENOMANALYSE & REKOMBINANTE DNA-TECHNOLOGIE Restrik9ons-Endonukleasen (sind Wacen der Bakterien, die fremdes DNA Material abwehren) sind meist Prokaryo9sche Enzyme, welche Palindrome („regallager“) Sequenzen (DNA-Sequenzen) zerschneiden. In der Mikrobiologie werden diese Enzyme dazu verwendet um DNA Sequenzen in weiterverwertbare Sequenzen zu zerschneiden/zerkleinern. Diese Enzyme können eine ganz bes9mmte Abfolge von Nucleo9den der Sequenz erkennen. Für bes9mmte DNA-AbschniYe gibt es speziLsche Enzyme (Scheren) zum zerschneiden. RE können blunt (gerade) oder s9cky (klebrige) Enden Erzeugen. Nur s9cky Ends mit gleichen Überhängen können wieder verknüpf werden. Bakterienplasmid (zirkuläre DNA) und ein Teil von einer Fremden DNA (lacZ+) wurde eingefügt. Ori: Origin of replica;on – Replika9onsstart Amp: Resistenz gegenüber An9bio9ka Ampizillin Dieses modiLzierte Plasmid wurde dem Bakterium wieder eingefügt und es konnte auf einer Ampizillin PlaYe wachsen  Ampizillin Resistenz vorhanden – Vermehrung auf Ampizillin Boden möglich, ansonsten nicht BAC (Bacterial Ar;ccial Chromosom) Ar9Lzielle Chromosomen erlauben das Klonieren großer (300kB) Fragmente. YAC (Yeast Ar;ccial Chromosom) Erlauben die Klonierung von bis zu 2 Mb an DNA. Ordnung von verschieden großen DNA Stücken: DNA ich wegen Phosphatrückgrat nega9v geladen und in einem Gel wandern sie zum Plus Pol (kleiner Stücke schneller als größere Stücke) DANN-SEQUENZIERUNG Ke^enabbruchverfahren nach Sanger (1977) Man möchte die Sequenz eines DNA Stranges bes9mmen: 1) Wasserstokrückenbindungen zwischen den Basen durch Hitze aufschmelzen. 2) Man bekommt Einzelstränge und auf Einzelstränge werden ein Primer gesetzt die einen Teil des Stranges erkennen und dann kann eine DNA Synthese vollzogen werden. 3) Einbau von didesoxy-Nuklo9d (ddNTP) führt zum Abbruch der Synthese führt (SANGER!)  so kann mehrere Stücke eines DNA Stranges bekommen. 4) Verschiedene Didesoxy-Nuklo9de sind mit Fluoreszierenden Farbstoc makiert. D.h sind alle Moleküle, welche mit einem ddG enden z.B Grün oder mit ddC enden Blau, alles ddT rot und alle ddA Gelb.  5) Laser erkennt welche Farbe die einzelnen DNA Fragmente haben.  Man ca 800 Nuklo9de pro Lauf bes9mmen. Erstes Genom welches sequenziert worden ist: Haemphilus inZuenza (1995) Humanes Genom wurde 2004 entschlüsselt. Alles mit Sanger KeYenabbruchsverfahren entschlüsselt worden. (Sehr sehr tolles verfahren mhmmm) Next Genera;on Sequencing (NGS): (alterna9ve zu elektrophore9scher Sequenzierung) Misst biochemische Reak9on des Einbaus. (Nukleo9deinbau wird gemessen)  Pyrosequencing: Reak9on an der man die Synthese der Nukleo9de beobachtet und misst. Nachteil: kurze Sequenzen, teuer pro Lauf Vorteil: Millionen an Sequenzen gleichzei9g, billig pro Base Man hat DNA wo man die Sequenz ermiYeln möchte 1) DNA mobilisiert man auf einen Träger (Bead) 2) Primer wird gesetzt und erkennt die Sequenz 3) Der Reak9on wurde abwechselnd Gemische (dGTP, dCTP, dTTP, dATP) hinzugefügt. (Bsp in Bild: dCTP wird mit C -komplementär zu G-eingebaut) 4) Durch Einbau wird Pyrophosphat frei welches Molekül (im Bsp ATP) angeregt wird und man kann einen Lichtblitz messen. 5) In der nächsten Runde wird dCTP „weggewaschen“ und dATP wird der Reak9on hinzugefügt.  wird aber nichts passieren, weil anhand dieses Bsp kein A eingebaut wird. 6) Nächste Runde wird dATP wieder weggewaschen und dGTP wird hinzugefügt und Gs werden eingebaut. Illumnia Sequencing: auch NGS Man beobachtet auch hier den Einbau von Zuresszierenden Nuklo9den. Polymerasen wurden so op9miert das sie sehr strikt nur ein Nukleo9d einbauen. 1) Library Prepara;on: DNA wird in kleine Fragmente zerstückelt und an Enden werden Adaptoren drangehängt und Adapotoren tragen bekannte Sequenzen. 2) Cluster Genera;on: Reak9onen Lnden auf einem ObjekYräger staY. Und auf der OberZäche gibt es Primer die zu den DNA Stücken dazu passen und basenpaaren. Es kommt zu BridgeapliLka9on (Brückenschlag). Man hat Molekül wo man Sequenz bes9mmen möchte welches durch Adaptar an Primer hybridisiert. Durch den Primer wird nächster Strang synthe9siert. Der erste Strang ist nicht verankert und verliert man und so kommt es zu dem Brückenschlag, weil der Strang an den nächsten Adapter bindet. Dann wird wieder neuer Strang hergestellt.Durch Erhitzen bricht die Brücke auf und man hat wieder 2 einzelne Stränge  Brückamplifzierung kann man viele male wiederholen und hat dann am Ende viele Stränge. Man hat dann jede Menge an Leading und Lagging Strängen und einen Sorte von Strang kann man wegnehmen. Danach werden Enden von Strang blockiert damit es nicht mehr zum Brückenschlag kommt und Primer sequenzieren.  Man kann Einbau von Zuoreszierenden Nukleo9den verfolgen durch Lichtblitz. 3) Sequencing: Einbau von Zuoreszierenden Molekülen.  So kann Nukleo9dabfolge von diesem DNA Stück ermiYeln. 4) Date analysis Nukleo9dabfolge von mRNA: cDNA Banken: 1) mRNA wird miYels Hybridisierung an oligo dT Säulen gereinigt. 2) Von einem oligo dT Primer wird miYels reverser Transkriptase eine cDNA hergestellt. 3) DNA Pol stellt den zweiten Strang her 4) Die cDNA Fragmente werden miYels Linker in einen Vektor kloniert. Varia9onen in Genomen können mit Signale nucleo9de polymorphismus (SNPs) iden9Lziert werden. SNP-maps können miYels Microarrays iden9Lziert werden. Auf einem ObjekYräger sind Oligonukleo9de, welche das gesamte Genom abdecken aufgebracht. An dieseSequenzen können markierte Sequenze hybridisiert werden. SNP Varia9onen in einer isolierten Popula9on(zBIsland) können gut zur Iden9Lka9on von gene9schen Risikofaktoren und Prädisposi9onen herangezogen werden. Genanalyse im 21. Jahrhundert: Vergleichende Genomik: KompleY sequenzierte Genome erlauben die Iden9Lka9on homologer Gene miYels Bioinforma9k. Bioinforma9sche Vergleiche erlauben die funk9onelle Zuordnung vieler Gene. In der Abb.: 60% aller S. cerevisiae Gene kann einer Funk9on aufgrund bioinforma9scher Ähnlichkeit zugeordnet werden. IsolaAonvon homologen Genen miCels KomplementaAon: In Abb.: Hefe DANN wird in einen Expressionsvektorkloniert. Alle Plasmide werden in S. cervisiae Zellentransformiert welche kein Arginin synthe9sieren können. Die Rekombinanten Zellen werden auf Wachstum auf Medium ohne Arginin getestet. Nur Zellen, welche das fehlende Gen am Plasmid enthalten können wieder wachsen und Kolonien bilden. Reverse Gene;k: Vom Gen zum Phän. Erlaubt die Analyse von Gen-Funk9onen aufgrund speziLscher Inhibi9onen (Hemmungen) eines bes9mmten Genes. Isola9on eines bes9mmten Gens miYels Polymerase Chain Reac9on (PCR). Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung der PCR war die Isolierung von thermostabilen DNA- Polymerasen. Diese wurden in Thermophilen Prokaryoten gefunden (leben in heißen Quellen). Rekombinante Mäuse: Um rekombinante Mäuse zu generieren, wird das Zielgen in Embryonalen Stammzellen (ES) Zellen durch homologe Rekombina9on zerstört. Rekombinante ES Zellen werden in Blastozysten injiziert, wo diese zum sich entwickelnden Embryo beitragen. Die Blastozysten werden in scheinschwanger Mäuse injiziert. Ist die Injek9on erfolgreich entsteht eine chimäre Maus. Haben die transgenen Zellen zur Keimbahn beigetragen, kann eine heterozygote Maus entstehen, die anschließend homozygo9siert wird.