Aulas de Imunopatologia e Imunodiagnóstico PDF

Nome: Anelise Franciosi Disciplina: Imunopatologia e Imunodiagnóstico Carga Horária: 40 horas (2 unidades com 2 aulas cada) Data: 02/07/2023 **Unidade 02 -- Imunodiagnóstico** **Introdução** Nesta unidade, vamos compreender como funcionam os métodos de diagnósticos chamados de imunodiagnóstico...

Nome: Anelise Franciosi Disciplina: Imunopatologia e Imunodiagnóstico Carga Horária: 40 horas (2 unidades com 2 aulas cada) Data: 02/07/2023 **Unidade 02 -- Imunodiagnóstico** **Introdução** Nesta unidade, vamos compreender como funcionam os métodos de diagnósticos chamados de imunodiagnósticos, ou imunoensaios. Veremos cada método de modo mais detalhado, para facilitar o entendimento do uso do imunoensaio para cada finalidade, como por exemplo, qual o melhor método de diagnóstico para identificar o vírus do HIV em um paciente que não apresenta sintomas? Pois é, para cada situação há um método de diagnóstico específico, que fará a diferença na detecção e consequentemente no tratamento. Vamos lá? **Objetivos** - - - - **Conteúdo programático** **Aula 1** -- Características gerais dos imunoensaios, ELISA e reações de aglutinação, e radioensaios. **Aula 2** -- Imunopreciptação, imunoeletroforese, Western blot e citometria de fluxo. **Referências** ABBAS, Abul K. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015. 536 p. ISBN 978-85-352-8164-4. LEVINSON, Warren. Microbiologia médica e imunologia. 13. ed. Porto Alegre: AMGH, 2016. 788 p. ISBN 978-85-8055-556-1. MURPHY, Kenneth; TRAVERS, Paul; WALPORT, Mark. Imunobiologia de Janeway. 7. ed. Porto Alegre: ArtMed, 2010. 885 p. + Acompanha CD-ROM ISBN 978-85-363-2067-0. SILVA, Adeline Gisele Teixeira da. Imunologia aplicada: fundamentos, técnicas laboratoriais e diagnósticos. São Paulo: Érica, 2017. 136 p. ISBN 978-85-365-0876-4. VAZ, Adelaide J.; TAKEI, Kioko; BUENO, Ednéia Casagranda. Imunoensaios: fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. 372 p. (Ciências farmacêuticas) ISBN 9788527713344. **Aula 01 -- Características gerais dos imunoensaios, ELISA e reações de aglutinação, e radioensaios.** Olá querido aluno, seja bem-vindo a mais uma aula da disciplina de imunopatologia e imunodiagnóstico, e nesta nova unidade vamos compreender a importância dos imunodiagnósticos. Está preparado? Começaremos nossos estudos pelas características gerais dos imunonsaios, que envolvem interações entre antígenos e anticorpos e apresentam diversas aplicações, como o diagnóstico de doenças infecciosas e não infecciosas, a determinação de prognóstico de doenças, a avaliação de responsividade a tratamentos e também a pesquisa científica. Os métodos de imunoensaio são baseados na interação de antígeno anticorpo, chamada de reação de imunocomplexo, e como sabemos, isso é possível através das porções de ligação do anticorpo, a porção constante chamada de FC que se liga à membrana celular, e a porção variável chamada de Fab que se liga aos diversos tipos de antígeno. O ser humano pode produzir milhões de anticorpos diferentes, cada um com um sítio de ligação à antígenos diferentes, isso se dá devido ao mecanismo de chave e fechadura, ou seja, há um anticorpo para cada antígeno, e é isso que confere a especificidade aos anticorpos. Os antígenos por sua vez possuem múltiplos epítopos diferentes, o que irá diferentes clones de linfócitos B, e consequentemente vários tipos de plasmócitos. O resultado disso são anticorpos com múltiplas especificidades, pois podem se ligar a diferentes epítopos de uma vez, esses anticorpos são chamados de policlonais. Porém, no caso do antígeno que possui epítopo específico, o mesmo irá estimular apenas um clone específico de linfócitos B, que irá se diferenciar em um único tipo de plasmócito, e que produzirá anticorpos com especificidade única, sendo chamados de anticorpos monoclonais por se ligarem apenas ao epítopo específico. E se o sucesso da técnica de imunoensaio está relacionada a reação de imunocomplexo, tendo como a base as informações anteriores sobre a quantidade de antígenos que podem existir, e a quantidade de anticorpos que podemos produzir, nos provoca o pensamento de que algo pode dar errado, e pode mesmo. Se por algum motivo o reconhecimento de um antígeno demonstrar um antígeno diferente do que o que está sendo apresentado, isso pode mudar o curso da reação, sendo chamada de reação cruzada. Neste caso, a resposta é semelhante a que deveria ser ativada pelo antígeno de origem (figura 1). Figura 1: Desenho esquemático da reação cruzada. Fonte: Próprio autor, 2023. Já sabemos o que promove a ligação de um antígeno com um anticorpo, como por exemplo o mecanismo de opsonização. Também já sabemos onde um se liga ao outro, mas o que faz com que essa ligação continue? Bom, a afinidade entre um anticorpo e um antígeno, que é a força de ligação entre um epítopo e seu anticorpo específico se dá por vários de tipos de ligação, como por exemplo a ponte de hidrogênio, ligação iônica, interação hidrofóbica, e até por força de Van der Walls. A afinidade é garantida pela constante de dissociação (K~d~), que indica a facilidade de separação do complexo antígeno anticorpo. Usualmente a K~d~ varia de 10^-7^M a 10^-11^M. A relação entre a constante de dissociação é inversamente proporcional à afinidade, o que quer dizer que quanto maior a K~d~, menor a afinidade, sendo neste caso igual a 10^-7^M, e quanto menos a K~d~, maior a afinidade, sendo igual a 10^-11^M. A soma de todas as forças mencionadas acima é chamada de avidez, e quanto maior a valência de interação, maior a avidez. Para a realização dos imunoensaios, as amostras que podem ser utilizadas são sangue, urina, fezes, saliva, sêmen, líquido cefalorraquidiano e amniótico. Porém, o soro, produto da centrifugação do sangue total sem qualquer anticoagulante, é mais indicado que o plasma (líquido sanguíneo mais anticoagulante), isso ocorre devido a interferência do anticoagulante e dos fatores de coagulação presentes no caso do plasma. Mesmo que as rações sejam bem específicas, existem fatores que podem influenciar as reações imunológicas in vitro, como por exemplo, a osmolaridade e o pH, o indicado são soluções isotônicas e com pH em torno de 7,4. A temperatura da reação é a ideal entre 20ºC e 37ºC, e em alguns casos como a crioaglutinação por meio das crioaglutininas, 4ºC. Tempo de incubação também é um interferente visto que as reações podem ocorrer minutos ou horas, bem como o isotipo de anticorpo, a natureza do antígeno, quando solúvel ou absorvido à uma partícula (ou célula), e até mesmo concentração dos reagentes. Outro fator que deve ser levado em consideração é a janela imunológica, período entre a infecção e o início da formação de anticorpos contra o agente infeccioso, já que o número de anticorpos produzidos aumenta à medida que o tempo de infecção se prolonga. Enfim, os imunoensaios são classificados em qualitativos quando os resultados informam apenas se houve a reação ou não, sendo chamados de negativos ou não reagentes, e positivos e reagentes; semi-quantitativos quando o resultado é dado pelo valor de titulação da reação; e quantitativo quando o ensaio informa a quantidade absoluta do material presente na reação. É de suma importância utilizar os diagnósticos imunológicos na rotina clínica, pois os mesmos demonstram sensibilidade clínica e especificidade. A sensibilidade diz respeito a porcentagem de resultados positivos na população comprovadamente doente, ou seja verdadeiros positivos. Testes com baixa sensibilidade demonstram uma elevada chance de resultados falso negativos. Já a especificidade é a relação da porcentagem de resultados negativos em pacientes comprovadamente sadios, ou seja verdadeiros negativos. Testes com baixa especificidade significam elevada chance de resultados falsos positivos. Porém vale lembrar que a sensibilidade clínica é diferente da sensibilidade analítica! A sensibilidade analítica refere-se à capacidade da técnica em quantificar concentrações de analitos, antígenos ou anticorpos. Por exemplo, em dois tubos com a mesma concentração de analitos, o imunoensaio A apresenta o resultado positivo, enquanto que o imunoensaio B apresenta o resultado com negativo, porém, quando há concentração maior do analito, o imunoensaio B apresenta resultado positivo. Isso significa que o imunoensaio B apresenta menor sensibilidade analítica do que o imunoensaio A. Os imunocomplexos podem ser evidenciados macroscopicamente por aglutinação de células ou partículas ou por precipitação por meio gelificado. A interação antígeno-anticorpo in vitro nem sempre é evidenciada por um fenômeno visível, neste caso, o conjugado pode ser um importante aliado na detecção de moléculas específicas. O conjugado se trata de duas moléculas ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas. Os conjugados podem ser construídos para radiação como os radioisótopos, ou para fluorescência como os fluorocromos, ou para os ensaios imunoenzimáticos como as enzimas com substratos cromogênicos, para fluorimetria como as enzimas com substratos fluorigênicos, e para quimioluminescência com as enzimas com substratos luminescentes. Para finalizar as características gerais, é importante mencionar os ensaios líticos, onde a interação antígeno-anticorpo pode ser evidenciada através da presença de lise celular, no caso, a quebra das hemácias. Essa hemólise é classificada em diversos graus de acordo com intensidade de lise, e cor da amostra. Quanto maior a hemólise, mais vermelho o soro estará. **Videoaula** Para compreender melhor as características dos imunoensaios, assista a vídeo aula a seguir. Continuando nosso estudo sobre os imunoensaios, vamos compreender melhor a técnica de ELISA (ensaio enzimático de imunosorbância), que permite quantificar um determinado antígeno ou anticorpo com alta especificidade e sensibilidade com rapidez e baixo custo. Este ensaio possui quatro diferenciações, o ELISA direto, indireto, sanduíche e o competitivo. Para a realização do teste de ELISA é necessário que um dos reagentes seja imobilizado em uma fase sólida. Atualmente, as fases sólidas mais utilizadas são as placas de poliestireno, polipropileno, policarbonato e polivinil, com fundo plano. Isso é muito importante porque requer a adsorção dos reagentes à placa por meio de interações hidrofóbicas, interações hidrofóbico-iônicas, forças eletrostáticas e força covalente. Este processo acontece durante a fase sólida do teste. Após a fase sólida vem o momento de sensibilização da placa, que consiste da adsorção, ou seja, ligação do antígeno ou anticorpo no fundo dos poços da placa. Com a sensibilização da placa com o anticorpo, chegamos ao próximo passo onde todos os sítios de reativos da placa devem ser bloqueados com uma alta concentração de proteína. O bloqueio pode ser realizado com leite desnatado, albumina sérica bovina, com gelatina, caseína, e com soro fetal bovino, o mais utilizado. No ensaio de ELISA direto, o objetivo da técnica é detectar e quantificar antígenos e/ou anticorpos. Neste caso, o antígeno presente na amostra do paciente é fixado no fundo dos poços da placa. Este método é utilizado para detectar a presença da *Giardia duodenalis* em fezes, por exemplo. Após a fixação do antígeno na placa, o anticorpo conjugado à enzima é adicionado a placa, e se liga ao antígeno da amostra do paciente, após este passo é adicionado o substrato, e a enzima irá reagir com o substrato promovendo a mudança de cor, já que o conjugado neste caso, possui o cromógeno. As enzimas agem sobre substratos cromogênicos gerando produtos coloridos. A fosfatase alcalina por exemplo age sobre o substrato cromogênico P-nitrofenilfosfato (NPP), já a peroxidase age com o substrato peróxido de hidrogênio, gerando os cromógenos orto-fenilenodiamina (OPD) e tetrametilbenzidina (TMB). Na oxidação de tetrametilbenzidina, estre composto atua como doador de hidrogênio para a redução do peróxido de hidrogênio (H~2~O~2~) em água, pela enzima peroxidase. Por fim, para que a reação seja devidamente finalizada, é utilizada a solução de parada, que é responsável por inativar a enzima, e pode ser uma base forte como o hidróxido de sódio, ou um ácido forte, como o ácido sulfúrico. Com a adição da solução de parada, haverá a mudança da coloração que foi formada pelo substrato cromogênico, e então, é o momento de realizar a leitura. Apesar de sua determinação poder ser feita visualmente, para resultados qualitativos, medir a densidade óptica da solução por meio da espectrofotometria, é de suma importância para os resultados quantitativos. Para a tal determinação é preciso um equipamento próprio (um espectrofotômetro), e então, com a placa da reação no interior deste equipamento, o aparelho de leitura lança uma luz sobre a amostra, e parte desta luz é absorvida pela amostra. O aparelho calcula a absorção de luz da amostra através de um sensor. Há uma relação matemática para isso, quanto maior a concentração do antígeno na amostra, maior a cor e maior a absorbância. Neste método de diagnóstico, existe uma forma de comparação com o resultado, que é chamada de curva padrão. Para formar esta curva, é realizada a diluição seriada de um padrão relacionado ao teste, e de concentração conhecida. Após a diluição, é realizada a leitura para obter as absorbâncias de cada ponto da curva, que posteriormente serão calculados por uma fórmula matemática. Onde a concentração é igual a absorbância do ponto da curva multiplicado pelo fato de calibração, sendo este as médias de concentração divididas pela absorbância. Posterior aos cálculos, é construído um gráfico baseado nos fatores encontrados. Outra variação do teste de ELISA é o ELISA indireto, cujo objetivo é detectar e quantificar anticorpos presentes no soro do paciente, podemos citar como exemplo a detecção da presença de anticorpos anti-HIV. Neste caso, será realizado uma incubação do antígeno nos poços da placa, e ao adicionar o soro do paciente, se houver o anticorpo específico para o antígeno na amostra, ele irá se ligar ao antígeno já preexistente. Com a ligação do anticorpo no antígeno, é adicionado à solução um anti-anticorpo conjugado à uma enzima, que se liga ao anticorpo do soro. Enzima essa que reage ao substrato adicionado na sequência, produzindo a mudança de cor. Podemos utilizar como método de diagnóstico o ELISA sanduíche ou de captura, em que o objetivo do teste é detectar e quantificar antígenos presentes no soro do paciente, utilizado na detecção do hCG no soro. Há o processo de sensibilização com um anticorpo que adere a placa, em seguida é adicionado o soro do paciente e, se houver o antígeno no soro, ele irá se ligar ao anticorpo já presente na placa. Em seguida, um anti-anticorpo conjugado à uma enzima se liga ao antígeno do soro, e com a adição do substrato, a enzima reage com o substrato mudando de cor. O mesmo processo de ELISA sanduíche ou de captura também pode detectar e quantificar IgM específico para um determinado vírus, e neste caso, é realizada a sensibilização na placa com anticorpo IgG anti-IgM humano. A próxima etapa que se segue é a adição do soro do paciente, e se teve contato com o vírus e estiver infectado, o IgM produzido em consequência a esse contato e presente no soro se ligará ao anticorpo ancorado na placa. Em seguida é adicionado o antígeno viral conjugado a uma enzima, e depois, o substrato também é adicionado. A enzima presente no antígeno viral reage com o substrato mudando de cor. O método de ELISA competitivo tem como objetivo detectar e quantificar antígenos e/ou anticorpos. Para tal é necessário uma pré-incubação de anticorpo com a amostra contendo o antígeno a ser mensurado. A mistura é então adicionada a uma placa cujos antígenos já estão adsorvidos, e somente os anticorpos livres irão se ligar aos antígenos ligados à placa. Depois, o anti-anticorpo conjugado à enzima se liga ao anticorpo, o substrato é adicionado à placa, e a enzima já presente na solução reage com o substrato mudando de cor. Se a amostra for incubada com pouco antígeno, haverá uma grande quantidade de anticorpos livres e um alta absorbância, porém, se a amostra for incubada com muito antígeno, haverá uma baixa quantidade de anticorpos livres, e consequentemente uma baixa absorbância. Isso nos mostra que quanto maior a absorbância, menor a quantidade de antígenos presentes na amostra. E por fim, quanto a ELISA de quarta geração, é realizada a sensibilização da placa, que consiste na adsorção de antígenos e anticorpos no fundo dos poços da placa, seguido do bloqueio da placa, onde todos os sítios reativos da placa são bloqueados com uma alta concentração de proteínas. Com este método também é possível detectar a infecção pelo vírus HIV, porém, de uma maneira diferente. A placa é sensibilizada com a proteína p24, que está presente no vírus, e também com o anticorpo anti-gp 120, sendo a proteína gp 120 mais um componente deste vírus. São então administrados o anticorpos IgG anti-gp120, o anticorpo IgM anti-p24, e ainda a própria proteína gp120 manipulada em laboratório. Na sequência, se adiciona o conjugado do antígeno ligado a enzima, e um conjugado de anticorpo ligado a enzima. Com a adição do substrato e da solução de cromógeno em um peróxido de hidrogênio, a reação se tornará colorida, indicando a presença do antígeno e/ou anticorpo. Todas as variações do método de ELISA podem ter o sinal do teste amplificado, aumento a sua sensibilidade através do sistema biotina estreptavidina, onde um anticorpo biotinilado é adicionado à solução na placa, e em seguida é adicionado o conjugado espreptavidinabiotina-peroxidase que se ligará ao anticorpo anterior de forma mais rápida e eficiente. **Videoaula** Para compreender melhor o método de ELISA assista a vídeo aula a seguir. Continuando nosso estudo sobre ensaios imunológicos, o próximo que veremos é o ensaio de aglutinação, que permite a detecção de anticorpos ou antígenos, sendo este muito vantajoso na rotina clínica, já que sua leitura é visual e rápida. A aglutinação ocorre quando há formação de agregados suficientemente grandes de micropartículas ou células com múltiplos epítopos interligados a anticorpos. Os ensaios de aglutinação apresentam vários tipos, como a aglutinação direta, indireta, a hemaglutinação, o teste de Coombs e a inibição da aglutinação. Independente dos tipos podem ser empregados para o diagnóstico laboratorial de doenças autoimunes, ou de doenças infecciosas, bem como a detecção de hormônios e a tipagem de grupos sanguíneos. Na aglutinação direta, o antígeno faz parte naturalmente da célula, e este teste é utilizado para a identificação de antígenos eritrocitários na tipagem sanguínea, na sorotipagem de bactérias, e na pesquisa de anticorpos contra bactérias. Na tipagem sanguínea tem-se como resultado positivo a aglomeração de células, formada pela aglutinação visível. Isso ocorre porque no sistema ABO há uma concentração específica de anticorpos que se ligam aos antígenos específicos presentes na membrana das hemácias, por exemplo, no sangue do tipo A, existem antígenos do tipo A, e no plasma deste indivíduos, existem anticorpos anti-B. No sangue do tipo B há antígenos do tipo B e anticorpos anti-A. Já no sangue tipo AB existem antígenos do tipo A e B, porém não há nenhum anticorpo contra esses antígenos presentes no plasma. E no sangue do tipo O não há antígenos sobre as hemácias, mas há anticorpos anti-A e anti-B no plasma. O segundo sistema mais importante depois do ABO é o Rh, onde a presença ou a ausência do antígeno D determina os fenótipos Rh^+^ (D^+^) ou Rh^-^ (D^-^). Os anticorpos anti-Rh estão relacionados com a doença hemolítica do recém-nascido, conhecida como Eristoblastose fetal. A aglutinação indireta emprega a ligação de anticorpos ou antígenos solúveis na superfície de micropartículas como plásticos, gelatina, hemácias e poliestireno (o famoso látex). Neste caso os anticorpos presentes na amostra se ligam às micropartículas de látx sensibilizadas com o antígeno. E o antígeno presente na amostra também pode ser ligado a micropartículas de látex sensibilizadas com anticorpos. As micropartículas de látex são esféricas, geralmente com cerca de 0,4 a 0,8µ de diâmetro, com cargas negativas. É um polímero plástico sintético e pode ser produzido na forma colorida (azul, verde, vermelho, amarelo), facilitando a visualização do agregado. Quanto à hemaglutinação indireta, este tipo de aglutinação está relacionado a pesquisa de anticorpos específicos no soro do paciente para um determinado antígeno utilizando hemácias sensibilizadas com um antígeno específico. Tem-se o resultado negativo quando há a ausência da formação de imunocomplexo, e o positivo quando há a formação do imunocomplexo. O teste de Coombs pode ocorrer por meio da aglutinação direta, denominado Coombs direto utilizado para determinar hemácias do paciente que se encontram sensibilizadas com anticorpos, sendo bastante útil para o diagnóstico de anemia hemolítica autoimune e para saber se as hemácias do recém-nascido possui anticorpos maternos adsorvidos. Para a realização deste teste, utilização a amostra do paciente, que por exemplo, se o mesmo estiver acometido pela anemia hemolítica autoimune terá eritrócitos sensibilizados por anticorpos, e ao adicionar o soro de Coombs, o reagente onde se encontram os anticorpos anti-IgG humana, haverá a aglutinação formando o complexo antígeno-anticorpo. Ou ainda pode ocorrer por meio da aglutinação indireta, denomina Coombs indireto. Neste caso é utilizado para determinar se uma mãe Rh negativa produz anticorpos anti-D, e também determinar se um paciente receptor para doação de órgãos, medula ou sangue possui algum anticorpo contra algum antígeno eritrocitário do doador. Para isso é utilizada a amostra de soro do receptor contendo anticorpos IgG, e então é adicionado ao tubo de soro a amostra de sangue de um doador. Com isso tem-se uma sensibilização das hemácias do doador formando um complexo antígeno-anticorpo. O soro de Coombs que contém anticorpos anti-IgG humana é adicionado a tudo, e se o teste for positivo para a pesquisa inicialmente descrita, haverá a aglutinação, os anticorpos IgG se ligarão às hemácias. No caso da inibição da aglutinação, utilizado como método para o diagnóstico da gestação, quando a amostra que não contém o hormônio HCG é submetida ao contato com o anticorpo anti-HCG, estes anticorpos ficam livres, e irão se ligar a partícula revestida de HCG presente no reagente, a presença de aglutinação indica um resultado negativo. E quando a amostra que possui o hormônio HCG é submetida ao contato do anticorpo anti-HCG, estes anticorpos se ligam fortemente ao HCG presente na amostra, assim a partícula revestida de HCG presente no soro fica livre, e tem-se a ausência de aglutinação, indicando a positividade do teste. Uma outra técnica bastante relevante é o rádioimunoensaio, uma técnica que permite a detecção e quantificação de um determinado antígeno utilizando antígenos ou anticorpos marcados com radioisótopos. No caso do uso de antígenos marcados com radioisótopos, há um grande risco operacional, porém o teste demonstra uma alta sensibilidade e especificidade, bem como baixo custo. Além disso é de fácil execução e requer uma pequena quantidade de amostra. Esta técnica permite a detecção e a dosagem de diferentes substâncias em amostras biológicas, como por exemplo anticorpos; vitaminas como a vitamina B12; hormônios como a insulina, o cortisol, a testosterona e o estrógeno; detecção de drogas como a morfina; alguns marcadores tumorais como o antígeno carcinoembrionário CEA e a α-fetoproteína; e ainda detecção de antígenos de agentes infecciosos como no caso da hepatite B. Os radioisótopos utilizados para a marcação podem ser o iodo ou o trítio. O iodo é o mais utilizado e possui uma meia vida de 57,5 dias, emite radiação γ e liga-se à grupos tirosil em antígenos. Já o trítio possui uma meia vida de 12,3 anos, o que explica o motivo para este radioisótopo não ser tão utilizado. O radioimunoensaio acontece por competição. A solução possui o antígeno marcado com o radioisótopo e o anticorpo específico para o antígeno, assim os antígenos marcados se ligam aos anticorpos, e com a adição da amostra do paciente, os antígenos presentes na amostra competem com o antígeno radioativo pelos sítios de ligação no anticorpo. Assim, quanto menor a concentração do antígeno na amostra, maior a radiação γ e quanto maior a concentração do antígeno na amostra, menor a radiação γ. O resultado do teste é apresentado mediante uma razão matemática que divide a radiação emitida por antígenos ligados pela radiação emitida por antígenos não ligados. **Videoaula** Para compreender melhor os ensaios de aglutinação e o radioimunoensaio, assista a vídeo aula a seguir. Com isso, finalizamos mais uma aula da disciplina de imunopatologia e imunodiagnóstico, te espero na próxima aula. **Aula 02 -- Imunopreciptação, imunoeletroforese, Western blot e citometria de fluxo.** Olá querido aluno, bem vindo a última aula da disciplina de imunopatologia e imunodiagnóstico. Nesta aula, continuaremos adquirindo conhecimento sobre os métodos imunológicos de diagnóstico, a começar pela imunoprecipitação. O objetivo do imunensaio de precipitação é identificar e quantificar o precipitado resultante da interação antígeno-anticorpo, mas neste caso existem algumas exigência, o anticorpo precisa ser bivalente ou com a valência maior do que o normal, e o antígeno precisa ser bivalente ou polivalente. Tudo isso porque a reação pode ser afetada pelo número de sítios de ligação que cada anticorpo possui para o seu antígeno, que é chamada de valência. As técnicas manuais de precipitação são realizadas principalmente em meio gelificado, chamado de ágar-ágar, e podem ser classificadas em imunodifusão simples ou dupla. Os géis necessários nesse tipo de reação podem ser a base de ágar, parecidos com os que usamos na microbiologia, obtidos a partir da agarobiose ou de agaropectina, de agarose ou poliacrilamida. No gel de agarose os poros possuem diâmetros que permitem a separação de fragmentos que variam de 200 pares de bases a 50 kilobases, e são obtidos a partir da agarobiose. O gel de poliacrilamida é o ideal para os processos de sequenciamento, pois permite a separação de fragmentos muito pequenos, de até 1000 pares de base, e é obtido a partir da acrilamida ou bis-acrilamida. Nestes ensaios, o que nos auxilia a interpretar os resultados obtidos é a curva de precipitação, relação entre a quantidade de precipitação e anticorpo adicionado. Essa curva é dividida entre três zonas importantes, a primeira prozona onde há o excesso de anticorpo, a zona de equivalência, onde antígeno e anticorpo estão ligados, e a segunda prozona hoje há o excesso de antígeno (figura 1).  Figura 1: Representação da curva de precipitação. Fonte: [[http://www.uoguelph.ca/mbnet/323IMMUN/C2\_AGAB]](http://www.uoguelph.ca/mbnet/323IMMUN/C2_AGAB). Na imunodifusão simples ocorre a quantificação de proteínas séricas, anticorpos, frações do sistema complemento e proteínas de fase aguda. Neste ensaio, os anticorpos são incorporados ao gel na placa, e a amostra é inserida no poço presente na placa, livre do gel. Com a difusão da amostra pelo gel, se houver antígeno na amostra, haverá a formação de um halo. A área do halo é diretamente proporcional à concentração do analito presente na amostra. Pela comparação do diâmetro do halo da amostra-teste com padrões a curva padrão estabelece-se a concentração do analito na amostra. Já na imunodifusão dupla, tanto o antígeno quanto o anticorpo são adicionados em orifícios na placa livres de gel, e sofrem a difusão. As soluções sofrem difusão e quando o imunocomplexo é formado na zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma de precipitação. Podem ser utilizados na pesquisa e diagnóstico de algumas doenças como a cisticercose. Linha essa que se torna visível a partir da lavagem do gel para retirada de proteínas solúveis e por coloração dos arcos de precipitação. São três padrões de linhas possíveis: a fusão dos arcos de precipitação dos antígenos indicando que o anticorpo está precipitando epítopos idênticos, chamada de linha de identidade. A segunda possibilidade é quando o anticorpo preparado consegue distinguir os três antígenos diferentes que formam arcos independentes de precipitação, essa linha é denominada de não identidade. E por fim, quando os antígenos compartilham o epítopo 1, porém um deles possui o epítopo 3, as linhas de precipitação não se encontram, neste caso, tem-se a identidade parcial. Para considerar um resultado positivo utilizando a imunodifusão dupla, é muito importante lembrar de avaliar a formação de uma curva, a precipitação em linha reta é desconsiderada, indicando um resultado negativo. Fica bastante claro que estamos lidando com proteínas a todo tempo, os próprios anticorpos são proteínas, como sabemos, e os antígenos possuem proteínas. E o melhor método para detecção de proteínas é o Western Blot, onde por meio da transferência eletroforética, as proteínas são separadas no gel para a membrana de nitrocelulose. A proteína alvo se liga à membrana contendo a proteína transferida no gel, e então o anticorpo primário se liga à proteína alvo. O anticorpo secundário contendo o substrato da enzima (sendo o famoso anticorpo conjugado) se liga ao anticorpo primário, e a enzima emite um sinal que é detectado. Os anticorpos aliados aos antígenos presentes na membrana são submetidos a autorradiografia, e a coloração para a melhor compreensão do resultado. Este método é altamente sensível e específico para detecção de anticorpos e proteínas de agentes infecciosos, e para diagnóstico de inúmeras doenças. Como por exemplo na detecção de anticorpos específicos para as proteínas do vírus do HIV. No método do western blot, se houver anticorpo contra a proteína do vírus na amostra do paciente, haverá a formação de uma banda no gel com a precipitação do imunocomplexo, antígeno presente no gel ligado ao anticorpo presente na amostra. Para o diagnóstico do vírus HIV, na membrana de nitrocelulose estão presentes as principais proteínas presentes no vírus, como as proteínas presentes no envelope viral gp160, gp120, p24 que foram separadas por corrente elétrica. Se o paciente estiver infectado pelo vírus HIV, na amostra deste paciente haverá anticorpos contra essas proteínas. No período de incubação da amostra em contato com a membrana, esses anticorpos se ligam às proteínas ali presentes. Posterior a este processo, vem a lavagem da membrana, e a adição da solução contendo anti-IgG ligado à enzima. Tem-se a segunda incubação, para que estes anticorpos possam se ligar aos complexos já existentes. Segue a segunda lavagem para a purificação da membrana e o substrato para a ligação da enzima presente no anticorpo conjugado é adicionado. Com a reação da enzima ao substrato são formadas bandas que representam a reatividade dos anticorpos às proteínas do HIV. **Videoaula** Para compreender os métodos de imunoprecipitação e western blot, assista a vídeo aula a seguir. Assim como o método de western blot, a imunoeletroferose também dependente da eletroforose, que consiste em um método para empregar uma corrente elétrica contínua para separar biomoléculas como peptídeos, proteínas, ou ácidos nucleicos presentes tem uma determinada amostra. A eletroforese é um método qualitativo que permite a discriminação de substâncias com base na carga elétrica, peso molecular, tamanho, forma, concentração e propriedades antigênicas. Para tanto, é utilizado um suporte de plástico ou acrílico próprio, separados em três regiões, uma que comporta o cátodo embebido em tampão, outra que comporta o gel de suporte, e a terceira com o ânodo embebido em tampão. As amostras são distribuídas em pequenos poços formados com um pente próprio, e a corrente elétrica criada pelo cátodo e ânodo promove a migração das bandas no gel, de acordo com o peso molecular, onde as bandas com o maior peso molecular ficam na parte superior, e as com menor peso molecular ficam na parte inferior. Para garantir a eficiência do método, o gel é tratado com dodecil sulfato de sódio (SDS) que promove a desnaturação das proteínas e mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas as moléculas migram para o ânodo, ou seja, para o polo positivo. A mobilidade das moléculas está relacionada ao tamanho (peso molecular) e carga positiva. Você já deve ter ouvido falar de eletroforese de proteínas, um método simples para separar proteínas presentes no soro humano em frações, cuja finalidade é a triagem para a investigação de anormalidades proteicas. Através da eletroforese de proteínas é possível identificar a albumina, e as demais globulinas presentes no sangue. A visualização da separação destas proteínas presentes no sangue também se dá por meio de bandas, e a análise dessas bandas produz um gráfico clássico que nos auxilia no estudo deste método (figura 2). Figura 2: Representação gráfica da eletroforese de proteínas. Fonte: adaptado de Os picos apresentados no gráfico sofrem alterações de acordo com a quantidade de proteínas de cada fração apresentada. Cada imunoglobulina possui uma característica específica, o que faz com que cada uma seja percebida em um dos picos. Por exemplo, a IgM tem a sua migração na junção das frações beta e gama e representa 5% das imunoglobulinas séricas. Já a IgA tem sua migração representada na junção das frações beta e gama e representa 19% das imunoglobulinas séricas. E a IgG tem sua migração por toda a fração gama, representando 73% das imunoglobulinas séricas. Com a alteração dos picos, podemos identificar diferentes doenças, e a mudança dos tamanhos dos picos são denominadas de acordo com o pico. Por exemplo, se houver uma diminuição da fração da albumina e o aumento da fração gama, é chamado de gamopatia policlonal. Neste gráfico, o curso apresenta uma base larga, e a resposta imunológica simultânea de diversos clones de plasmócitos, e consequentemente a produção elevada de diferentes tipos de imunoglobulinas. Pode significar uma infecção ou uma doença autoimune. Se a alteração ocorrer com a diminuição da fração de albumina, e o aumento na fração gama com a curva da base estreita é denominado de gamopatia monoclonal. Decorrente do aumento no nível de um único tipo de imunoglobulina, e pode representar o diagnóstico para o mieloma. A diminuição das frações resultando na diminuição dos picos é denominada de hipogamaglobulina, e a ausência deste pico é chamado de agamaglobulinemia, e pode ocorrer em casos de imunodeficiências. A imunoeletroforese é uma técnica que combina eletroforese, difusão e precipitação de proteínas em meio gelificado. Permite caracterizar proteínas em uma amostra, identificar anormalidades estruturais de acordo com o padrão de mobilidade eletroforética, e identificar alterações nas concentrações como a espessura do arco e de precipitação formada. A eletroforese de amostras consiste na separação de proteínas de acordo com a carga elétrica e tamanho, os antígenos presentes da amostra, bem como os anticorpos sofreram a difusão no meio, e quando se ligarem acontecerá a precipitação dos complexos imunes no gel formando arcos. A leitura dos arcos inclui o aspecto da migração e a intensidade do arco de precipitação, que é relacionado à concentração da proteína. Quanto mais forte o arco, maior a concentração. A imunoeletroforese pode ser substituída pela técnica de imunofixação no laboratório clínico, e graças à sua velocidade, sensibilidade e facilidade de interpretação, e dispensa a difusão em gel. É um método de eletroforese de proteínas, e ocorrer por meio da incubação do gel com anticorpos, como anti-IgA, anit-IgM, anti-IgI, anti-κ e anti-λ. E então ocorre a precipitação dos complexos imunes no gel, e por fim a coloração do gel para que as bandas possam ver visualizadas. **Videoaula** Para compreender o método de imunoeletrofores, assista a vídeo aula a seguir. Para finalizar nossa aula, vamos aprender sobre o método de citometria de fluxo, uma técnica utilizada para separar, contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Este processo analisa as características físicas e químicas de células isoladas de partículas biológicas e não biológicas. A citometria de fluxo permite analisar várias características de uma célula de forma rápida e por vários parâmetros, sendo então caracterizada como multiparamétrica. É dividida em sistemas, sendo um sistema fluído que introduz e alinha as partículas em um fluxo contínuo. Um sistema óptico que gera e coleta sinais de luz, e um sistema eletrônico que converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos, disponibilizando-os para análise no computador. Para isso são utilizados alguns parâmetros: o FSC, forward scatter, é utilizado para identificar o tamanho relativo da célula, o SSC, side scatter, utilizado para identificar a granulosidade ou complexidade celular, e o FL, relacionado a intensidade de fluorescência transmitida, e para isso utiliza vários canais, FL1, FL2, FL3 e assim por diante. A citometria funciona pelo conjunto de sistemas, onde o sistema fluído introduz e alinha as partículas para análise, o sistema óptico gera e coleta os sinais de luz, e o de fluxo converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos para a análise em computador. A fluorescência emitida e identificada diz respeito ao comprimento de onda gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz do laser. Os canais citados anteriormente são utilizados como detectores. O detector de FL-1 (fluorescência 1) capta a luz de comprimento de onda de aproximadamente 530 nm, que corresponde à luz verde, já o detector de FL-2 (fluorescência 2) capta luz de comprimento de onda aproximadamente 570 nm, que corresponde à luz laranja, e o detector de FL-3 (fluorescência 3) capta a luz de comprimento de onda aproximadamente 650 nm, o que corresponde à luz vermelha. Isso é possível devido a separação de células marcadas por fluorescência, por anticorpos dirigidos contra moléculas de membranas ou antígenos de acordo com o cluster de diferenciação (CD), e cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente. Com este tipo de detecção, pode-se ter um teste qualitativo e quantitativo. Com a incidência de fonte luminosa, a detecção da dispersão pode ocorrer de maneira lateral pela complexidade interna, denominado de SSC, ou pela dispersão frontal do laser FSC que irá detectar o tamanho da molécula. \` Para a emissão de luz é necessário respeitar os princípios da absorbância. Quando a luz é absorvida por um fluorocromo, seus elétrons tornam-se excitados ao passar de um estado de repouso a um nível máximo de energia chamado de "estado excitado singleto". O fluorocromo sofre a mudança conformacional interna liberando uma parte da energia absorvida como calor. Os elétrons, posteriormente, caem para um nível energético mais baixa, mais estável, chamado de "estado relaxado singleto" e os elétrons voltam para o seu estado fundamental e liberando a energia restante por meio da emissão da fluorescência. O fluorocromo excitado emite luz num comprimento de onda maior que o absorvido. E será visualizado pelo espectro de exitação/emissão do Isotiocianato de Fluoresceína (FITC). As células presentes na mistura heterogênea são submetidas a marcações por anticorpos monoclonais, como o fluorocromo, o FITC que possui a ficoeritrina e o PE, que possui isotiocianato de fluoresceína. Como marcadores mais comuns podemos citar CD3 presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timócito; o CD4 presente entre 55% a 65% das células T periféricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, presente também em monócitos, macrófagos e células dendríticas. O CD8 presente entre 25% a 35% das células T maduras do subtipo citotóxicas, o CD19 presente em mais de 95% das células B, o CD20 presente em todas as células B maduras do tecido linfoide e sangue periférico, e o CD45, expresso quase que exclusivamente em células hematopoiéticas podendo apresentar as formas CD45RA ou CD45RO. A dispersão é representada em formato de gráfico que compara o volume celular com a granulosidade. E é por isso que cada população celular vai ficar em um local do gráfico (figura 3).  Figura 3: Representação gráfica da dispersão da citometria de fluxo. Fonte: próprio autor, 2023. Os gráficos podem ser quatros tipos diferentes, o histograma, o dot plot, o density plot, e o contour plot. Cada ponto no gráfico é um evento, e cada evento corresponde a uma célula que passou pelo laser. Para análise de dados, conhecer as características relacionadas a tamanho e complexidade, como a presença de grânulos. É preciso escolher os campos de análises, para que os demais campos sejam excluídos, e após isso, as demais células presentes poderão ser analisadas. Quando as células são marcadas por dois marcadores diferentes, as análises de dados precisam ser feitas por meio da divisão de quatro quadrantes no gráfico, assim é possível calcular a porcentagem da quantidade de células presentes em cada quadrante. Demonstrando a eficácia do teste como qualitativo e quantitativo. A citometria de fluxo pode ser utilizada para realizar a imunofenotipagem, onde ocorre a diferenciação de populações celulares, diferenciando os clusters de diferenciação (CD), as moléculas utilizadas como marcadores, e análise de subpopulação linfocítica. Também pode ser aplicada para a análise da viabilidade celular, demonstrando as células mortas por apoptose e necrose. A análise do ciclo celular também pode ser realizada por meio da citometria de fluxo, desde que seja utilizado um tampão hipotônico de fluorescência (HFS), associado ao iodeto de propídio e a solução permeabilidade de membrana. Pode-se também analisar a proliferação celular, utilizando um corante citoplasmático fluorescente lipofílico. Este método é ainda empregado na detecção da produção de citocinas, sendo o CBA capaz de detectar 6 citocinas, e ELISA capaz de detectar 1 citocina apenas. Isso é possível devido à associação de microesferas ao fluorocromo, formando a diferença de intensidade de excitação. Quanto às aplicações clínicas, podemos utilizar a citometria de fluxo para realizar a contagem de linfócitos T auxiliares na infecção pelo HIV, pois sabe-se que se o vírus infectar a célula T, a população celular irá diminuir e com ela a imunidade do paciente. Pode ser utilizada para avaliar o DNA de células tumorais e a atividade proliferativa no câncer de mama e outras doenças malignas; e em transplante de órgãos. Através da citometria de fluxo é possível isolar cromossomos humanos para a construção de bibliotecas genéticas, e separar cromossomos X e Y na criação de animais e na fertilização in vitro. E no diagnóstico de leucemias e linfomas, diferenciadas pelos marcadores específicos, sendo o CD3, CD7, HLA DR, CD 42ª, CD61, CD19, CD33, CD13, CD14 e CD34 para as leucemias mielóides. O CD10, CD2, CD20, CD3, CD19, CD22, CD23, CD26 e CD5 para leucemias linfocíticas, e CD3, CD7, CD2, CD19, CD5, e CD56 para leucemias e mielomas. Pode-se ainda utilizar este método para realizar o diagnóstico e acompanhamento de mieloma múltiplo, para a detecção de células neoplásicas não-hematopoieticas, para o monitoramento quimioterápico, na doença e residual mínima, e para o diagnóstico de hemoglobinúria paroxística noturna. E para finalizar, a citometria de fluxo também é empregada na análise de reticulócitos, na detecção de anticorpos antiplaquetários, na análise do conteúdo de DNA, na quantificação de células progenitoras também chamadas de Stem cells, e na avaliação imunológica do paciente transplantado por meio da infusão leucocitária, e na manutenção da terapia imunossupressora. **Videoaula** Para compreender a citometria de fluxo, assista a vídeo aula a seguir. Com isso, finalizamos nossa unidade de imunopatologia e imunodiagnóstico. Espero que todos este conhecimento mostre a importância da imunologia para a ciência, para os profissionais da saúde e para os pacientes. Até a próxima! **Encerramento da Unidade** E com isso chegamos ao final desta aula. Nesta unidade compreendemos quais os métodos imunológicos são bem empregados no diagnóstico, bem como qual o método correto para o diagnóstico correto. Com este conhecimento, é possível expandir o raciocínio acerca de outros métodos, e é assim que é feito para que novos métodos sejam padronizados e utilizados para a melhora da saúde. Até a próxima!