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TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO UD 1. El sistema inmunitario. Aplicaciones basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias. 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. El sistema inmunológico permite al organismo poder responder frente a los diferentes ataques de patógenos y sustancias extrañas. Se trata de...

TÉCNICAS DE INMUNODIAGNÓSTICO UD 1. El sistema inmunitario. Aplicaciones basadas en reacciones antígeno-anticuerpo secundarias. 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. El sistema inmunológico permite al organismo poder responder frente a los diferentes ataques de patógenos y sustancias extrañas. Se trata de un sistema muy complejo en el que van a intervenir diferentes órganos, glándulas y una gran variedad de células y sustancias que van a conseguir neutralizar estos ataques. En la repuesta inmunológica es clave la función de los anticuerpos. En esta unidad didáctica vamos a desgranar las características generales tanto de los diferentes anticuerpos presentes en el organismo, así como de los antígenos que producen dicha respuesta. Es clave, también, conocer las características que rigen la unión entre el antígeno y el anticuerpo. Además, vamos a conocer los diferentes tipos de respuesta inmunológica que se dan, además de introducir la aplicación técnica que dichas respuestas, pueden aportar a las cuestiones que aparecen en el laboratorio de inmunodiagnóstico, diferenciando las reacciones antígeno-anticuerpo “in vivo” y las reacciones “in vitro”. Al terminar el tema deberás conocer:  Los órganos del sistema inmune  Las células linfoides y las mieloides  Los conceptos de antígeno y anticuerpo.  Distinguir los diferentes tipos de inmunoglobulinas.  Diferenciar entre respuesta inmunitaria celular y humoral.  Entender los distintos mecanismos de la respuesta inmunitaria celular.  Reacciones de aglutinación.  Reacciones de precipitación. 2. CARACTERÍSTICAS DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO 2.1 Órganos del sistema inmune En el sistema inmunológico está formado por órganos linfoides primarios y secundarios, además de diferentes células que circulan porel organismo con función defensiva. Los órganos linfoides se conectan entre sí por los vasos sanguíneos y linfáticos, esto permite el encuentro entre linfocitos y antígenos, además de permitir la circulación de estos elementos por todo el organismo para llegar a los patógenos en cualquier lugar. Los órganos linfoides primarios son a la médula ósea y el timo, en ellos se produce la maduración y la diferenciación de los linfocitos. En el timo vamos a encontrar sobre todo Linfocitos T, mientras que en los Linfocitos B se localizarán sobre todo en la médula ósea. Los órganos linfoides secundarios son el bazo, los ganglios linfáticos y amígdalas. En ellos se da el encuentro entre los linfocitos y los antígenos que es el inicio de la respuesta inmune. En los órganos linfoides secundarios vamos aencontrar poblaciones celulares tanto de linfocitos T como de linfocitos B. La ruta que siguen los antígenos podría resumirse de la siguiente manera: Los antígenos entrarán en el organismo a través de la piel y las mucosas, viajando por el sistema linfático hasta llegar a los ganglios linfáticos o hasta ser fagocitados por células del sistema fagocítico mononuclear (células del SMF, macrófagos, histiocitos, etc.), que serán los encargados de conducirlos hasta los ganglios. Una vez en los ganglios, estos antígenos son procesados por las células presentadoras de los antígenos a los linfocitos T, comenzando la respuesta inmunológica. Además, al mismo tiempo, los linfocitos que estaban en circulación llegan al ganglio, activándose y transformándose en células efectoras y algunas de ellas en células memoria, saliendo posteriormente del ganglio para intervenir en la repuesta inmune. 2.2 Células del sistema inmune Todas las células sanguíneas (y por tanto las del sistema inmunitario) provienen de una célula llamada célula madre hematopoyética (HSC, del inglés Hematopoietic Stem Cell). Existen muy pocas HSC en la médula ósea y son difíciles de cultivar en laboratorio por lo que aún se desconocen muchos de los mecanismos que regulan su proliferación y su diferenciación. Esta célula madre se puede diferenciar en dos grandes linajes celulares denominados: Linaje Mieloide y Linfoide. Cada uno de estos dos linajes dará origen a determinadas células de la sangre. Un ser humano produce un estimado de 1011 (un "1" seguido de 11 "0"s) glóbulos blancos por día. Células mieloides Las células derivadas del linaje mieloide son las plaquetas, eritrocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, mastocitos, monocitos, macrófagos y células dendríticas. En la médula ósea, las células hematopoyéticas y sus descendientes crecen, se diferencian y maduran dirigidos por factores de crecimiento y diferenciación (citocinas). Esta diferenciación ocurre mediante una serie de poblaciones precursoras intermedias que a su vez se van diferenciado cada vez más hasta la última célula de la descendencia. Las células de este linaje participan en la Respuesta Inmunitaria Innata. Las plaquetas participan principalmente en los procesos de coagulación sanguínea cuando existe un daño. La coagulación evita la pérdida de sangre pero también bloquea el paso de antígenos a tejidos más profundos. Las plaquetas también liberan citocinas (moléculas de comunicación celular) durante el proceso inflamatorio. Los eritrocitos tienen un papel central en el transporte de oxígeno mediante el sistema circulatorio hasta los tejidos. También tienen receptores en su superficie capaces de unir a proteínas del Sistema del Complemento que les permiten capturar complejos antígeno-anticuerpo que estén en la sangre y transportarlos al bazo para eliminarlos mediante fagocitosis por los macrófagos. Los neutrófilos pertenecen a una categoría llamada granulocito debido a que vistos en el microscopio parece tener unos "granitos" en su citoplasma. Estos gránulos son vesículas cargadas con componentes necesarios para combatir a los antígenos, como por ejemplo enzimas digestivas. Los neutrófilos representan una línea de defensa muy importante frente a infecciones bacterianas y de hongos. Los basófilos también son células del sistema inmune del tipo granulocito. Son los responsables de desencadenar los procesos de alergia y participa Los eosinófilos son granulocito que participan en la defensa contra parásitos. en la inflamación. Los mastocitos son las principales células que coordinan la inflamación. Son del tipo granulocito, se encuentran en los tejidos cerca de vasos capilares y producen histamina (principal molécula moduladora de la inflamación). Los monocitos son células que se encuentran en el torrente sanguíneo y que migran a los tejidos cuando se detectan antígenos. Una vez fuera de los capilares se diferencian a macrófagos para eliminar a los agentes extraños. Los macrófagos son células relativamente grandes, destruyen a los antígenos mediante fagocitosis. Representan una línea de defensa importante frente a infecciones causadas por bacterias, virus, hongos y parásitos. También participan en la regulación del proceso inflamatorio y son capaces de atacar y destruir a células cancerígenas. Las células dendríticas también destruyen antígenos mediante fagocitosis, se localizan en los tejidos realizando un "patrullaje" buscando antígenos que deban ser eliminados. Una vez que localizan antígenos, los fagocitan para destruirlos y una parte la procesan para "presentársela" a los Linfocitos T ubicados en los ganglios linfáticos para que pueda activarse una respuesta inmune adaptativa. Células linfoides Las células derivadas del linaje linfoide son los linfocitos B, linfocitos T y células asesinas naturales, mejor conocidas como células NK (del inglés Natural Killer). Se denominaron linfocitos porque son muy abundantes en la linfa (99% de las células que hay en linfa son los linfocitos). Los linfocitos B y T pertenecen al Sistema Inmunitario Adaptativo mientras que las células NK pertenecen al innato. Linfocitos T: Se van originar en la médula ósea, pasando al sistema circulatorio y alcanzando, así, el timo. En el timo dónde van a sufrir una diferenciación es dónde adquieren unos marcadores de superficie, denominados CD, que se van a ir modificando en función del antígeno que tengan en frente. Cuando este receptor se vuelve específico para el antígeno se denomina TCR y hace que ese Linfocito T se vuelva específico para ese antígeno. Una vez estimulado dicho linfocito T, éste activará a otro tipo de linfocitos para desencadenar la respuesta inmunológica. Los Linfocitos T se clasifican en: o Linfocitos T reguladores  Linfocitos T colaboradores o TH (helper)  Linfocitos T supresores o Linfocitos TS o Linfocitos T efectores:  Linfocitos T citotóxicos o Linfocitos TC  Linfocitos T de Memoria o Linfocitos T productores de linfocinas. Linfocitos B: Se crean en la médula ósea, además maduran en dicha médula con un proceso de diferenciación que no depende del antígeno. Antes de pasar a la sangre, un linfocito B inmaduro tendrá en su superficie IgM, mientras que cuando ya es maduro, tendrá en su superficie tanto IgM como IgD, además de otros receptores. En este punto, pasará al torrente sanguíneo y llegará a los ganglios. Una vez en el ganglio, podrá entrar en contacto con el antígeno y ahí comienza la maduración Antígeno-dependiente. Los Linfocitos B se diferencian entre Linfocitos B vírgenes que son los que presentan en su superficie IgM e IgD, es decir, que intervienenen la respuesta inmunológica primaria y luego están los Linfocitos memoria que presentan IgG y se encargan de la respuesta secundaria. 3. TIPOS DE RESPUESTA INMUNOLÓGICA En el Sistema Inmunológico podemos hablar de dos tipos de respuesta bien diferenciadas. Así, tenemos la respuesta inmunológica Humoral y la respuesta inmunológica Celular. No obstante, se puede hacer otra distinción, así tenemos la respuesta inmune natural y la respuesta inmune adquirida. Esta clasificación de la respuesta inmunológica nos sirve para poder identificar la intervención de los diferentes elementos que actúan en la respuesta inmunológica, dependiendo de si se trata de una u otra, ya que los mecanismos difieren dependiendo del tipo de patógeno y del tipo de respuesta que se dé. 3.1 Respuesta inmunológica humoral La respuesta inmune humoral es la reacción que tiene lugar como consecuencia de la unión del AntígenoAnticuerpo. En este caso, el Anticuerpo es el encargado de reconocer al Antígeno y activar, así, los diferentes mecanismos de defensa. Dichos anticuerpos pueden ser solubles o pueden presentarse unidos a células y en ambos casos, la unión específica del anticuerpo con el antígeno es la que provoca una serie de reacciones por parte del sistema inmunológico. La respuesta humoral depende pues, tanto de las sustancias solubles (anticuerpos), como de la intervención de algunos tipos celulares como pueden ser: • Linfocitos: pueden ser Linfocitos T o Linfocitos B. Así, los linfocitos T van a producir una serie de factores solubles que sirven para la activación de los linfocitos B y actúan como mediadores en la activación de la respuesta. Los linfocitos B y sus derivados (células plasmáticas), son productores de los Anticuerpos. • Otros tipos celulares que van a intervenir en los mecanismos de respuesta, como son los fagocitos. 3.2 Respuesta inmunológica celular La respuesta inmunológica celular requiere de la intervención de algunas células que no son los linfocitos B y tampoco requiere de Anticuerpos. Se trata de un mecanismo que se lleva a cabo para hacer frente a agentes extraños como pueden ser algunos microorganismos que se encuentran dentro de células fagocíticas, las cuáles no han sido capaces de destruirlos por los mecanismos líticos mediante los que normalmente se suelen destruir dichos elementos extraños. Además, también es empleado para acabar con células que han sido infectados por agentes patógenos, tales como los virus y que son utilizadas por dichos agentes para reproducirse. La interacción entre las células que intervienen en la respuesta inmune celular con los microorganismos desencadenantes de dicha respuesta. 4. Tipos de inmunidad 4.1 Inmunidad natural Es la que se lleva a cabo de manera inmediata tras haberse producido el contacto con el antígeno, por lo que será una respuesta inespecífica ya que no requiere que haya existido previamente un contacto con el agente extraño (antígeno), por lo que la memoria inmunológica no entra en juego. Por ello, los elementos del sistema inmunológico que la llevan a cabo están presentes en el organismo de forma continua con el fin de poder eliminar cualquier elemento extraño que pretenda atacar al mismo. Entre estos elementos, tenemos: • Barreras primarias: constituidas por la piel, mucosas, flora intestinal, etc. Estas barreras impiden la entrada de los microorganismos a través de la queratinización, la elaboración de secreciones, liberación de compuestos o la activación de mecanismos antimicrobianos como la histamina. • Células fagocíticas: dentro de este tipo de elementos podemos incluir a los monocitos, o a los polimorfonucleares (Neutrófilos, basófilos y eosinófilos). • Células NK: también conocidas como las “células asesinas”. Son un tipo de linfocitos y morfológicamente no se diferencias a penas de los linfocitos grandes a excepción de unos gránulos que contienen. • Factores solubles: entre los cuáles podemos encontrar desde lisozimas, interferón (agente antiviral inespecífico que puede inhibir la replicación viral) o el complemento, que son sustancias producidas por el sistema inmunológico que intervienen junto a las células para producir la lisis del agente exógeno. 4.2 Inmunidad adquirida La inmunidad adquirida es de actuación tardía y no inmediata, ya que se necesita el contacto previo con el agente patógeno frente al cual va a intervenir, es decir, requiere de la existencia de la “memoria inmunológica” que aparece tras un primer contacto con la sustancia a combatir. Es una respuesta específica para la que se necesita la participación de los elementos que constituyen el sistema inmunológico específico que expusimos anteriormente, es decir, linfocitos T, linfocitos B y los anticuerpos. Dentro de la inmunidad adquirida también se pueden hacer otras dos distinciones claves: • Inmunidad adquirida activa: los anticuerpos que intervienen en la inmunidad adquirida pueden provenir del propio organismo como respuesta al antígeno. Dentro de este tipo, también existen variantes dependiendo de si el antígeno aparece tras haber padecido una enfermedad infecciosa y haberse curado, caso que corresponde a la inmunidad adquirida activa espontánea o de si el antígeno se ha introducido de una forma artificial, caso que corresponde a la inmunidad adquirida activa artificial. • En la inmunidad adquirida pasiva, los anticuerpos pueden provenir de otro organismo que actúa de donante de dichos anticuerpos para el organismo que desarrolla la respuesta inmunológica. En este caso, la duración de la respuesta no es muy prolongada puesto que los anticuerpos son eliminados por el propio sistema inmune, ya que no son elementos que hayan sido generados dentro del propio organismo. Además, cabe señalar que en la inmunidad adquirida pasiva, también podemos diferenciar entre inmunidad adquirida pasiva espontánea, cuando dicha donación se hace en la vía materno-filial a través de la leche o de la placenta y entre la inmunidad adquirida pasiva artificial, cuando la donación de estos anticuerpos se hace por medio de la inyección de sueros que contienen los anticuerpos formados por otros organismos. 5. INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas son proteínas con capacidad de reconocer de forma específica otras moléculas extrañas del organismo. Las inmunoglobulinas intervienen en el sistema inmunitario de dos formas. “Como parte del BCR,” está presente en la membrana del linfocito B y reconoce antígenos. Como moléculas circulantes, denominándose entonces anticuerpos, Ac o Ab (en inglés). Los anticuerpos son secretados por las células plasmáticas en respuesta al contacto con un antígeno, y reaccionan específicamente contra él. 5.1 La estructura de las inmunoglobulinas Las inmunoglobulinas son proteínas globulares, aunque presentan un 2% de hidratos de carbono. Están compuestas por subunidades o monómeros, algunas de las inmunoglobulinas están compuestas por una sola unidad, aunque otras, como el caso de la IgA, estarán formadas por dos monómeros o unidades estructurales básicas. Cada monómero está compuesto por cuatro cadenas polipéptidicas unidas entre sí por puentes de disulfuro y otras uniones no covalentes. Estas cadenas pueden ser de dos tipos: • Cadenas pesadas o cadenas H: Son polipéptidos de alto peso molecular. La secuencia de aminoácidos será la que determine la existencia de clases y subclases de inmunoglobulinas (M, G, D, E y A). • Cadenas ligeras o cadenas L: son cadenas de bajo peso molecular formadas por la unión. En este caso, las cadenas ligeras son iguales en todos los tipos de inmunoglobulinas. Dominios estructurales de las inmunoglobulinas Si analizamos con detalle a las cadenas pesadas, veremos que existe una zona con pocos aminoácidos llamada zona Bisagra que presenta una gran flexibilidad y permite el movimiento de la inmunoglobulina, facilitándose la unión con el antígeno. Las funciones de las inmunoglobulinas consisten básicamente en el reconocimiento específico del antígeno, tras el cuál, se van a iniciar una serie de procesos del sistema inmunológico que persiguen acabar con dicho antígeno. Además, también llevan a cabo la interacción con otros elementos del sistema inmunológico como puede ser el sistema del complemento (moléculas plasmáticas implicadas en la respuesta inflamatoria, lisis o en la fagocitosis), los fagocitos por medio del fragmento Fc, mastocitos y/o basófilos. 5.2 Isotipos de Igs Las cinco variantes isotípicas de las cadenas pesadas dan lugar a cinco clases de inmunoglobulinas. Cada una de ellas presenta características específicas y funcionales particulares. Inmunoglobulinan A (Ig A) La acción de esta inmunoglobulina suele centrarse en la superficie de las mucosas y de los líquidos biológicos tales como las lágrimas, la saliva, etc. Su función principal va a consistir en llevar a cabo una defensa local del organismo en aquellas zonas que son más vulnerables, como son los ojos, la boca, la vagina, el aparato digestivo, etc. Esto se debe a que es una inmunoglobulina que puede ser excretada por las mucosas y las glándulas exocrinas. La IgA tiene la capacidad de precipitar y neutralizar a los patógenos, aunque no va a fijar al sistema del complemento y no tiene capacidad de atravesar la placenta. La IgA se encuentra en la leche materna de manera que puede ayudar al lactante ya que va a proteger el sistema digestivo de éste. Inmunoglobulinan D (Ig D) Hasta ahora no se le ha descubierto una función específica aunque siempre aparece una clara relación con los Linfocitos B, ya que van a formar parte de la membrana de los mismos, como receptores, por lo que se puede deducir que interviene en el proceso que permite al Linfocito B adquirir su competencia inmunológica. Se encuentra en una concentración muy escasa en el suero, concretamente en menos de un 1%. Inmunoglobulinan G (Ig G) La IgG constituye el 8O% de las inmunoglobulinas plasmáticas totales. También, es predominante en la linfa y fluidos peritoneal y cerebroespinal. Debido a su bajo peso molecular, difunde bien al espacio extravascular y atraviesa fácilmente la barrera placentaria. Es la inmunoglobulina mayoritaria de la respuesta inmunitaria humoral secundaria, es la única capaz de neutralizar toxinas bacterianas. IgG1, IgG2, IgG3 activan el sistema de complemento. Inmunoglobulinan M (IgG M) Es una inmunoglobulina formada por cinco monómeros. La IgM permanece dentro del espacio intravascular, y debido a su elevado peso molecular no atraviesa la placenta. En el neonato es la primera inmunoglobulina sintetizada por él mismo, siendo de vital importancia en la respuesta humoral primaria. Debido a su multivalencia, tiene una capacidad mayor de unirse a antígenos particulados como partículas virales o eritrocitos provocando su aglutinación. También fijan y activan el complemento de forma muy eficaz. Inmunoglobulinan E (IgG E) Se trata de una inmunoglobulina muy presente en personas que padecen alergia pero que es muy escasa en aquellas que no sufren procesos alérgicos. Esto es debido a que su síntesis está directamente relacionada con la presencia en el organismo de antígenos de diferente naturaleza, denominados alérgenos que, previamente han atravesado las barreras primarias del organismo, como son la piel o las mucosas. Cuando se produce la unión del antígeno con la IgE, dicha IgE activa a determinadas células (mastocitos, eosinófilos, basófilos…), que liberarán histamina y otras sustancias vasoactivas tales como la serotonina, dando lugar a reacciones alérgicas o anafilácticas. Además del desencadenante de las reacciones alérgicas, la IgE tiene también un papel fundamental en la neutralización y destrucción de determinados parásitos, tales como los helmintos. 6. ANTÍGENOS Los antígenos son compuestos de origen muy diverso caracterizados por ser capaces de inducir una respuesta inmune. A esta característica se la conoce como inmunogenicidad. No se debe confundir con la antigenicidad que es la capacidad que tienen los antígenos de interaccionar con los productos de la respuesta inmune, haciendo especial referencia a los anticuerpos. Los alérgenos son un tipo de antígeno capaz de provocar una reacción de hipersensibilidad. Los antígenos tumorales son el resultado de transformaciones neoplásicas y los autoantígenos son compuestos propios que el sistema inmune reconoce como antígeno por error originando las enfermedades autoinmunes. Los PAMPs bacterianos que pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario son: peptidoglucanos, lipopolisacáridos, lipoproteínas, flagelina (una proteína del flagelo), proteínas de superficie, ADN, toxinas y factores de secreción, entre otros. 6.1 Epítopo Se conoce como epítopo o determinante antigénico a los fragmentos de la molécula de antígeno, generalmente estructuras de superficie, reconocidos específicamente por los anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales se unen a un solo epítopo del antígeno. 6.2 Reacción Antígeno-Anticuerpo El anticuerpo y el antígeno se unen a través de la región variable del anticuerpo, mientras que la región constante está implicada en el acoplamiento de las dos moléculas ya que la zona bisagra presenta una gran flexibilidad. La unión del Anticuerpo con el antígeno se va a hacer por medio de la formación de enlaces no covalentes reversibles como son los enlaces de hidrógeno, las interacciones hidroestáticas, enlaces de Van der Waals e hidrófobas. Mientras más se complementan las configuraciones moleculares, más uniones secundarias se forman entre el antígeno y el anticuerpo, y es más difícil que ese complejo sea alterado por fuerzas tales como la agitación térmica. Las regiones hipervariables son las que contactan con el antígeno, mientras que el resto de las regiones variables van a mantener la integridad de la región combinante. La unión antígeno-Anticuerpo se va a caracterizar por: • Afinidad: Se trata de la fuerza de unión individual entre el epítopo de un antígeno y la zona del anticuerpo que se va a unir con él. Esta fuerza será mayor o menor, dependiendo de la complementariedad entre ambas zonas de manera que si existen más zonas en común entre ellas, existirán más fuerzas intermoleculares y mayor será la atracción. • Avidez: Mide la fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une a un antígeno multivalente. Los anticuerpos tienen al menos, dos zonas de unión con el antígeno, es decir que son multivalentes. Además, los antígenos también pueden ser multivalentes por poder poseer varios determinantes antigénicos. Esta fuerza de unión entre antígeno multivalente y anticuerpo multivalente será mayor que la suma por separado de las fuerzas individuales de cada sitio de unión. • Especificidad: Se refiere a que la región combinante del anticuerpo que se establece específicamente frente al epítopo de un determinado antígeno, no pueden ser complementarios con los epítopos de otros antígenos. • Reactividad cruzada: Este fenómeno se da cuando dos antígenos contienen un determinante antigénico en común o que se parece bastante. En este caso, una determinada proporción de los anticuerpos que se crearon contra un antígeno, reaccionarán contra el otro antígeno. 6.3 Antígenos de histocompatibilidad Se trata de un conjunto de antígenos presentes en la membrana de las células nucleadas de los mamíferos y son los responsables de las reacciones de rechazo que pueden darse en los trasplantes de órganos. Estos antígenos provienen de la codificación de unos genes a los cuáles se les llaman Complejo Mayor de Histocompatibilidad. En el caso del ser humano se les denomina HLA, siglas que se refieren al nombre completo de Antígenos Leucocitarios Humanos, esto no significa que solamente los encontremos en los leucocitos, si no que fueron descubiertos por primera vez en los mismos, de hecho, se pueden encontrar en todas las células nucleadas y plaquetas, salvo en los glóbulos rojos. Dentro de los CMH, encontramos a los MHC-I y a los MHC-II. Existe una diferencia patente entre ellos, por ejemplo, el MHC-I es el más general y se va a encontrar en todas las células nucleadas y en las plaquetas. Sin embrago, al MHC-II sólo lo vamos a encontrar en aquellas células que son las presentadoras de antígenos, en macrófagos y células dendríticas, también en monocitos y linfocitos T, como en B y células NK 7. ANTICUERPOS MONOCLONALES En inmunología existe un proceso que consiste en inmunizar artificialmente a un organismo con la intención de obtener anticuerpos frente a un determinado antígeno. Estos anticuerpos obtenidos son policlonales, ya que son varios los clones de linfocitos obtenidos que se activan para dar lugar a anticuerpos que tienen al mismo antígeno como objetivo, pero que se han creado para reaccionar frente a diferentes epítopos del antígeno. No obstante, en inmunología es mucho más útil el proceso que consigue obtener los llamados anticuerpo monoclonales, es decir, anticuerpos monoespecíficos que sólo reaccionan frente a un solo epítopo del antígeno y que son homogéneos entre sí. Esto se basa en la característica funcional de los linfocitos B, ya que cada linfocito B produce anticuerpos con una única especificidad, por lo que si se consigue clonar dicho linfocito B tendremos una gran cantidad de anticuerpos destinados a unirse al mismo epítopo del antígeno. Para ello, se une una célula plasmática (célula derivada del linfocito B activado y productora de anticuerpos) y se une a una célula de mieloma , que son células de un tipo de cáncer, concretamente células plasmáticas tumorales que tienen una enorme capacidad proliferativa, dando lugar a un Hibridoma, que es un híbrido entre ambos tipos de células que va a tener la capacidad de multiplicarse indefinidamente, tanto in vitro como in vivo, como consecuencia de las características proliferativas de la célula del mieloma, produciendo una gran cantidad de anticuerpos específicos que produce el plasmocito. De esta forma se pueden producir una gran cantidad de hibridomas de acuerdo con el tipo de anticuerpo que estemos buscando, teniendo en cuenta que todos estos anticuerpos producidos son clones y son específicos para un determinado epítopo de un determinado antígeno. Además de obtener una gran cantidad de dichos anticuerpos frente a un determinado antígeno, existe también la ventaja de poder conservar los hibridomas durante bastante tiempo. La técnica para obtener estos anticuerpos consiste en inmunizar a los ratones con el antígeno objeto, dicha inmunización se hará intraperitonelamente. Posteriormente se aíslan los plasmocitos (células plasmáticas), productores de los anticuerpos específicos frente a esos antígenos. A continuación se realizará la fusión celular entre las células plasmáticas y las células mieolomatosas dentro de un medio que contenga antibióticos y polietilenglicol, que es un detergente que disuelve parte de la membrana celular y es el responsable de la fusión. Después se seleccionarán a los hibridomas formados mediante medios de cultivo que sólo van a permitir el crecimiento de las células híbridas. Después se clonarán los hibridomas y se pasa a seleccionar los cultivos que generen el anticuerpo deseado. 8. LAS TÉCNICAS SECUNDARIAS Las reacciones secundarias de los Anticuerpos-Antígenos, es decir, en las reacciones en las que la interacción entre el Anticuerpo y el Antígeno dan lugar a una manifestación visible que nos va a permitir un control visual de los resultados y se trata, además, de unas pruebas que son relativamente sencillas a la hora de ponerlas en marcha. Este tipo de pruebas incluyen la precipitación y la aglutinación, en todas sus variantes. En el diagnóstico serológico, existen diferentes tipos de pruebas basadas en las interacciones entre anticuerpos y antígenos. Tal es así, que si nos fijamos en el procedimiento a seguir, las podemos dividir en función de la reacción AG/AC, dividiéndolas en dos grandes grupos: primarias y secundarias. En esta unidad nos vamos a fijar en las pruebas secundarias que incluyen la precipitación y la aglutinación. En este tipo de técnicas, la interacción entre Ac-Ag darán un resultado visible a simple vista. Las técnicas secundarias no valoran directamente los complejos inmunes sino que lo hacen de forma indirecta, atendiendo a los cambios físicos visibles que se producen en el medio. Reacciones de aglutinación. Cada anticuerpo puede unirse a varios antígenos, y cada uno de estos a varios anticuerpos; como consecuencia, se forma una red de antígenos y anticuerpos que provoca una aglutinación en el medio. Reacciones de precipitación. Algunas uniones antígeno-anticuerpo son complejos demasiado grandes para mantenerse en disolución y precipitan en el medio. Fijación del complemento que utilizan los hematíes como sistema revelador. En este caso lo que se observa en el medio es la lisis de los hematíes. Las reacciones de aglutinación directa son útiles para la detección y titulación de Anticuerpos en distintos fluidos biológicos. Lo que ocurre con este tipo de aglutinación es que no es posible determinar la concentración de anticuerpos, si no que en el mejor de los casos, podemos determinar el título del anticuerpo. Para poder averiguarlo, se van a realizar una serie de incubaciones de diluciones seriadas de suero del paciente con unas cantidades constantes de antígeno y se define el título del anticuerpo como: la inversa de la máxima dilución del suero que va a producir una aglutinación visible. Si existe una gran cantidad de Anticuerpos, es posible que a diluciones bajas, es decir, en diluciones que llevan una gran concentración de suero, no se observe ninguna aglutinación. A esta zona la llamamos Prozona y es debido a que el exceso de anticuerpo hace que se formen preferentemente complejos de antígeno-anticuerpo solubles, tal y como ocurría en la zona de exceso de Anticuerpos en la curva de precipitación, ya explicada anteriormente, al existir un marcado exceso de anticuerpos frente a los determinantes antígenos de la superficie celular, estadísticamente es muy poco probable que los dos sitios activos del Ac puedan unirse a grupos receptivos específicos ubicados en células diferentes . Pues bien, como hemos definido anteriormente, podremos decir que el título de ese Anticuerpo es la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible. Para que sirva de ejemplo, ponemos el siguiente esquema: Seroconversión, que consiste en obtener dos muestras de suero de un mismo paciente tomadas a diferentes tiempos, comparando el título de los anticuerpos en ambas muestras. Se dice que existe seroconversión cuando aumenta el título del anticuerpo en 4 veces en un período de entre tres o 4 semanas. En el ejemplo anterior, pasadas cuatro semanas, el título del anticuerpo pasa de 32 a 128, lo que significa que el límite en el que existe aglutinación es en una dilución de 1/128, que a efectos prácticos, quiere decir que en aumenta la cantidad de anticuerpo presente en el suero del paciente, pudiendo producir una respuesta de aglutinación con una menor concentración de suero. 9.2 TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN Las técnicas de aglutinación se basan en la capacidad que tienen los antígenos particulados multivalentes para unirse a sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados visibles a simple vista. Si tenemos en cuenta las diversas clases de anticuerpos, IgM es el de mayor poder aglutinante, porque su estructura es pentamérica, es decir, tiene diez puntos de unión al antígeno (valencia=10). Por eso es el más eficaz para entrecruzar epítopos dispuestos sobre partículas próximas. La aglutinación ocurre cuando las concentraciones de antígeno y anticuerpo son equivalentes. Si existe desequilibrio, tanto por exceso de antígeno como por exceso de anticuerpo, se produce un fenómeno de zona, y el resultado es un falso negativo. Si hay exceso de antígeno se bloquean los dos fragmentos Fab de la molécula de anticuerpo (paratopos) y se impide que las partículas antigénicas queden unidas entre sí. Si hay exceso de anticuerpos se bloquean todos los puntos de unión del antígeno (epítopos),de igual modo, se impide la agregación de las partículas antigénicas. Dependiendo de que el antígeno sea particulado o haya necesidad de insolubilizarlo mediante fijación sobre un soporte (partículas o células), existen dos tipos de reacciones de aglutinación: directa e indirecta. 9.2.1 TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN DIRECTA Detectan la reacción de aglutinación que provoca la formación de algunos inmunocomplejos. Una suspensión de antígenos formes o particulados (bacterias, protozoos, esporas), que en sus membranas o paredes celulares expresan los determinantes antigénicos o epítopos que van a intervenir en la formación de los complejos inmunes. Suero problema que contiene anticuerpos frente a esos epítopos, se producirá la correspondiente aglutinación por formación de los inmunocomplejos (Ej. Brucelosis). La lectura es inmediata, dado que a simple vista se aprecia la formación de esos agregados insolubles. La forma de visualizarlos depende del soporte sobre el que se realice la reacción. - Soporte plano (portaobjetos, tarjeta), la reacción positiva implica la formación de «grumos», que son los patógenos unidos entre sí por los anticuerpos específicos formando agregados macroscópicos. - Placa de microtitulación, el positivo se evidencia por la formación de un velo en la superficie del pocillo correspondiente. Si no hay aglutinación, los antígenos particulados sedimentan en el fondo de los pocillos, en forma de botón Las técnicas de aglutinación pueden ser cualitativas o semicuantitativas si se efectúan diluciones del suero y se determina el título (medida relativa de la actividad de los anticuerpos) Las técnicas directas, tanto de aglutinación como de precipitación, se empezaron a utilizar para identificar bacterias o tipificar eritrocitos, pero debido a su simplicidad y sensibilidad se comenzaron a aplicar para la identificación de anticuerpos, para el diagnóstico de procesos infecciosos. Prueba rápida de aglutinación en placa: Suspensión de bacterias del género Brucella teñidas con Rosa de Bengala como antígeno para diagnóstico de Brucelosis. Hemaglutinación directa: tipo especial de aglutinación directa es la hemaglutinación directa. Esta técnica se aplica a la determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO y Rh. Se usan Anticuerpos Monoclonales. 9.2.2 TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN INDIRECTA A diferencia de la aglutinación directa, en esta se emplean antígenos inicialmente solubles, que hay que insolubilizar mediante fijación a un soporte sólido inerte (bolas de látex, partículas de bentonita, carbón activo o gelatina), o a una célula (eritrocitos). De este modo se conforma un antígeno particulado (partícula sensibilizada con el antígeno). Las técnicas más habituales son: - Aglutinación de látex en placa: una de las técnicas de aglutinación indirecta que más se usan. Las partículas de látex son pequeñas esferas de poliestireno suspendidas en un tampón sobre las que se pueden unir a Ag o Ac solubles mediante interacciones hidrofóbicas entre sitios de la proteína y la superficie de poliestireno de las partículas. Así quedan «sensibilizadas» y se pueden utilizar para la detección de Ac o Ag, según el caso. Normalmente, la técnica es cualitativa con resultado positivo o negativo, pero puede convertirse en semicuantitativa si se lleva a cabo con diluciones seriadas de un suero. - Hemaglutinación indirecta (HAI): Como soporte de los antígenos se usan los hematíes convenientemente tratados (Ej. Toxoplasmosis). Hay que destacar que no se trata de antígenos de los propios hematíes, como ocurre con la hemaglutinación directa para determinación de grupos sanguíneos, sino de los hematíes como soporte para unirles antígenos de distinta procedencia, frente a los que se buscan anticuerpos específicos. Es altamente sensible y específica. - Inhibición de la hemaglutinación (IHA): Es una variante de la técnica de hemaglutinación indirecta. La hemaglutinación se debe a la capacidad que tienen algunos virus y bacterias de unirse a receptores de membrana de hematíes de mamíferos y aves, provocando su aglutinación. Esto se puede aprovechar para detectar en un suero problema anticuerpos específicos frente a esos virus o bacterias. En ausencia de anticuerpos específicos, los antígenos del patógeno provocarían la aglutinación de los eritrocitos. Por el contrario, si se incuban esos patógenos con el suero de un paciente que contenga anticuerpos específicos (frente al virus de la rubéola), los anticuerpos neutralizarían los antígenos bacterianos o víricos, inhibiendo así su capacidad para aglutinar hematíes. La lectura es lo contrario de la de las pruebas de hemaglutinación. NEGATIVO: Velo en los pocillos. POSITIVO: Botón en el fondo del pocillo. - Pruebas de Coombs (o de antiglobulina): Basadas también en reacciones de hemaglutinación. Estas pruebas usan el reactivo de Coombs, que es un antisuero animal contra globulinas humanas y que contiene, por tanto, anticuerpos frente a las inmunoglobulinas humanas. Cuando se incuba con eritrocitos lavados del paciente, el reactivo de Coombs provoca su aglutinación. Existen dos variantes de la prueba de Coombs: La prueba de Coombs directa permite la detección de anticuerpos unidos a los eritrocitos. Entre sus aplicaciones está el diagnóstico de anemias autoinmunes o de anemia hemolítica en un recién nacido Rh+ hijo de una madre Rh–. La prueba de Coombs indirecta Permite la detección de inmunoglobulina anti-Rh en el suero materno para por ejemplo la detección de inmunoglobulina anti-Rh en el suero materno. 9.3 TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN Reacción de dos componentes, Ag multivalente y Ac específico, que por separado son solubles, precipitan cuando se unen para formar un inmunocomplejo que precipita. Al igual que sucede con las reacciones de aglutinación, es necesario trabajar con concentraciones equimoleculares de antígeno y anticuerpo en el punto de equivalencia. Esto es fácil de comprobar, mezclando concentraciones crecientes de antígeno en solución con un suero que contenga anticuerpos específicos. 9.3.1 TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO Las reacciones de precipitación en medio líquido se basan en medir la turbidez que produce la precipitación de inmunocomplejos en un medio líquido. La medición de la turbidez se puede realizar mediante dos técnicas analíticas, la turbidimetría y la nefelometría, que se basan en la transmitancia o dispersión de un haz de luz respectivamente. Hablaríamos de Inmunoturbidimetría y de Inmunonefelometría. Se pueden utilizar para determinar anticuerpos, factores del complemento, proteínas de fase aguda y otras proteínas séricas. A penas se utilizan en la actualidad en el inmunodiagnóstico, ya que han sido desplazadas por las reacciones de precipitación en gel. 9.3.2 TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN EN GEL En la actualidad es más frecuente la utilización de un soporte semisólido que de un medio líquido. El soporte es un gel de agar o agarosa, cuya preparación es muy sencilla:  Se prepara agarosa al 1% en tampón fosfato PBS o solución salina.  Se deposita en caliente sobre el soporte en que se va a efectuar la reacción.  Una vez frío y solidificado, se excavan en él los pocillos necesarios con un sacabocados.  Los componentes de la reacción se depositan en los pocillos, difunden a través del gel y en la zona donde alcanzan el punto de equivalencia, es decir, donde existen concentraciones equiparables de antígeno y anticuerpo, forman los inmunocomplejos y aparecen líneas, arcos o bandas de precipitación, que se ven a simple vista. La velocidad de difusión de un antígeno o anticuerpo en el gel depende de varios factores: La concentración: a más elevada mayor será la difusión. La temperatura: cuando es elevada se favorece la difusión. El tamaño de las moléculas: la velocidad de difusión es inversamente proporcional al peso molecular. La viscosidad del medio: una viscosidad elevada hace disminuir la velocidad de difusión. Como la velocidad de difusión depende de estos factores, si se trabaja con una mezcla de diferentes anticuerpos o con una solución con diferentes proteínas antigénicas, se van a formar varias bandas de precipitación. El número de bandas de precipitación formadas representa el número de complejos antígeno-anticuerpo formados. Existen diferentes modalidades de precipitación en gel, en función de que:  Difundan por el gel uno o los dos componentes de la reacción.  La difusión sea espontánea o forzada por aplicación de un campo eléctrico.  Se trate de una técnica cualitativa o cuantitativa. Las principales, que estudiaremos a continuación, son las siguientes: Doble difusión o reacción de Ouchterlony: Los dos componentes de la reacción (antígeno y anticuerpo) difunden libremente por el gel. La reacción más sencilla consiste en disponer solución de agarosa en caliente sobre un portaobjetos, extenderla y dejar que se enfríe. A continuación se excavan dos pocillos con un sacabocados, uno en cada extremo del portaobjetos, se dispensa la solución antigénica en uno de ellos y el suero en el que buscamos anticuerpos específicos en el otro. A medida que los dos componentes de la reacción van difundiendo libremente por el agar, se irá formando un gradiente de concentraciones. En el espacio entre los dos pocillos habrá una determinada zona en la que los reactivos se encuentren en su relación de equivalencia, y es ahí donde se formará un precipitado que sobre el gel se detectará como una banda blanca visible a simple vista. Aunque se trata de una técnica cualitativa, la distancia a la que se forman las bandas de precipitación nos permite deducir la estructura o la concentración relativa de los componentes de la reacción, ya que la banda se formará más próxima al pocillo que contenga el componente menos concentrado y/o de mayor tamaño molecular. Por esta razón, si enfrentamos un antígeno a diferentes diluciones de un suero que contiene anticuerpos específicos, la distancia a la que se forman las bandas de precipitación va variando en función de la concentración de anticuerpos. Es fácil efectuar la demostración experimental, con una pequeña placa de Petri cubierta con el gel de agarosa. Se excava un pocillo central, donde se coloca la solución antigénica y varios pocillos en círculo, alrededor del central, con seis diluciones crecientes del suero. El hexágono que tienden a formar las bandas resultantes de la precipitación aparece desplazado, respecto del pocillo central, hacia los pocillos que contienen la menor concentración de anticuerpos, es decir hacia las diluciones más altas. Cuanto menor sea la concentración de la proteína (anticuerpo) que difunde por el gel, menor será la distancia que tiene que recorrer hasta encontrar la concentración equivalente (punto de equivalencia) del antígeno. Entre las aplicaciones de la doble difusión en gel están los estudios de identidad entre antígenos. Se puede determinar la existencia o no de determinantes comunes entre antígenos estudiando las bandas de precipitación formadas: La reacción de identidad total (I), corresponde a los antígenos que comparten todos los determinantes antigénicos las bandas de precipitación se fusionan. En la reacción de no identidad (II), ningún determinante es compartido y por lo tanto son antígenos distintos. En la reacción de identidad parcial (III), hay algunos determinantes comunes y otros diferentes, siendo estos últimos los responsables de que se forme un espolón dirigido hacia el pocillo con menos determinantes reactivos. Inmunodifusión radial o técnica de Mancini: Se basa en la difusión libre de uno de los componentes de la reacción (antígenos o anticuerpos) por un gel que lleva incorporado el otro componente (anticuerpos o antígenos). En este caso, la formación de los complejos da lugar a la formación de un anillo de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración del componente que difunde por el gel. Si en los pocillos excavados en un gel con anticuerpo incorporado se dispensa una serie de diluciones de un antígeno, se puede establecer una recta patrón, representando gráficamente el diámetro de los anillos de precipitación frente a la concentración de antígeno en cada pocillo. Este procedimiento permite conseguir una determinación cuantitativa de un antígeno en una muestra problema, dibujando la curva patrón a partir de unos controles que se ponen a difundir en el gel, paralelamente a las muestras problema, e interpolando en la curva el valor de los diámetros medidos de las muestras problema. Inmunoelectroforesis: Combina la separación proteica por electroforesis y la inmunodifusión. Los componentes de la mezcla se separan primero aplicando una corriente eléctrica; a continuación se lleva a cabo una difusión libre en gel de las fracciones obtenidas. Es una técnica cualitativa, cuya principal ventaja es la especificidad, puesto que la separación previa permite la obtención de arcos o bandas de precipitación exclusivamente frente a una determinada fracción antigénica. Está en desuso. Inmunofijación: Es una variante de la anterior y se utiliza en el laboratorio para evaluar las proteínas del mieloma múltiple. Contrainmunoelectroforesis (CIEF): Esta técnica consiste en una doble difusión forzada mediante la aplicación de un campo eléctrico. Tiene la ventaja de que permite disminuir el tiempo de incubación y aumentar considerablemente la sensibilidad de la técnica, ya que la totalidad de los componentes dispuestos en el pocillo migran en sentidos opuestos, sin «perderse» hacia los extremos del portaobjeto o placa, donde no se encuentra el componente complementario. Es una técnica cualitativa. Se practica en geles de agar, eligiendo el pH de forma que los anticuerpos tengan carga positiva o neutra y el antígeno, carga negativa. Aplicando un voltaje a través del gel, el antígeno y el anticuerpo se mueven uno hacia el otro (los anticuerpos hacia el cátodo, y los antígenos hacia el ánodo) hasta que se encuentran en el punto de equivalencia, donde se forman los complejos inmunes y por tanto las líneas de precipitación. Electroinmunodifusión (EID) Electroforesis “en cohete”: Se trata de una inmunodifusión radial forzada por aplicación de corriente eléctrica, lo que, al igual que en el caso anterior, hace a la técnica más rápida y más sensible. A esta técnica se la conoce también como electroforesis «en cohete» (rocket). Los antígenos son sometidos a electroforesis en un gel que lleva incorporado el anticuerpo o suero. El pH del gel se elige en el punto isoeléctrico de los anticuerpos, con lo que tendrán carga neta 0, y no migrarán bajo la acción del campo eléctrico. Por tanto, solamente migrarán los antígenos. Se forman precipitados en forma de cohetes, que tienen una altura proporcional a la concentración de antígeno presente en al pocillo, de forma que los valores desconocidos se determinan por interpolación en una curva patrón, al igual que se ha descrito para la inmunodifusión radial. Es por tanto una técnica cuantitativa. 9.4 TÉCNICAS DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO Estas técnicas proporcionan una medida indirecta de anticuerpos que no dan reacciones visibles. Se basan en que la formación de inmunocomplejos activa el sistema del complemento y produce complejos que lesionan las membranas de eritrocitos y otras células. EL SISTEMA DE COMPLEMENTO Está constituido por un conjunto de proteínas plasmáticas que, ante ciertos estímulos, se activan en forma de cascada. Es parte de la inmunidad innata, aunque uno de sus mecanismos de activación (la vía clásica) requiere la participación de anticuerpos y, por tanto, supone que se ha puesto en marcha la respuesta específica. REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO La lisis de membranas celulares por el complemento es una de las consecuencias de su activación. La vía clásica comienza con la unión de antígenos de membrana a anticuerpos específicos, a los que se une el complemento y termina con la formación de numerosos poros en esa membrana y la consecuente lisis de esa célula. Esta reacción se puede utilizar para medir niveles de anticuerpos en el suero. El fundamento es la utilización como «sistema revelador» de eritrocitos y anticuerpos frente a esos eritrocitos (hemolisinas). La fijación de complemento es una técnica que se aplica a la detección de anticuerpos en un suero, utilizando el correspondiente antígeno, como reactivo «conocido» de la reacción. El procedimiento básico es el siguiente: Se inactiva el complemento del suero problema calentándolo a 56 ºC durante 30 min. Se añade una cantidad conocida del suero a una cantidad de antígeno conocida. Si hay anticuerpos, se formarán los correspondientes inmunocomplejos. Se añade complemento. En caso de que haya inmunocomplejos, estos fijarán el complemento y lo agotarán. Hay que utilizar la cantidad exacta de complemento necesaria para lisar los eritrocitos, cuando no se hayan «gastado» en la incubación anterior; por eso es importante descomplementar el suero problema. Añadir un sistema indicador que serán eritrocitos con anticuerpos (hemolisinas) en su superficie, que forman complejos antígeno-anticuerpo. Interpretación de los resultados: Se observa la lisis de los eritrocitos: negativo. Significa que hay complemento libre que no se fijó en la primera reacción y, por tanto, que no hay anticuerpos en el suero. No se observa la lisis de los eritrocitos: positivo. Significa que el complemento se ha agotado en la reacción anterior debido a la presencia de anticuerpos específicos en el suero problema.