Toxicologie - Chapitre 3a PDF

Plan du cours Chapitre 1 : Introduction & Concepts clés Chapitre 2 : Toxicocinétique Chapitre 3 : Toxicologie moléculaire & cellulaire Chapitre 4 : Organotoxicologie Chapitre 5 : Toxicologie développementale Chapitre 6 : Toxicologie du cancer Chapitre 7 : Evaluation du risque Chapi...

Plan du cours Chapitre 1 : Introduction & Concepts clés Chapitre 2 : Toxicocinétique Chapitre 3 : Toxicologie moléculaire & cellulaire Chapitre 4 : Organotoxicologie Chapitre 5 : Toxicologie développementale Chapitre 6 : Toxicologie du cancer Chapitre 7 : Evaluation du risque Chapitre 8 : Toxicogénomique 1 Champs d’application de la toxicologie Toxicologie chimique : caractérisation des aspects mécanistiques du phénomène toxicologique. Vise à décrire la réaction de composés chimiques réactifs avec des macromolécules telles que les protéines, les lipides et l’ADN, menant ainsi à la formation de composés anormaux à l’origine d’une réponse pathologique. Inclut la toxicologie moléculaire et cellulaire (chapitre 3). Organotoxicologie : caractérisation de l’effet de composés nocifs sur des organes en particulier tels que le foie, le cerveau ou les poumons (chapitre 4). Toxicologie intégrative ou « systems toxicologie » Toxicologie des populations. Inclut la toxicologie occupationnelle et la toxicologie environnementale. risque lié au travail (ex : dans l’industrie du textile) 2  Toxicologie spéciale chapitre 5 chapitre 6 http://www.creative-animodel.com/ 3  WFARM2139 - Chapitre 3 Toxicologie moléculaire & cellulaire A. Mécanismes de toxicité B. Systèmes de défense et d’adaptation séparé en deux parties !! Ces mécanismes se font de manière parallèles : on va pas avoir l’un ou l’autre : chaque toxique à un mécanisme et l’hôte (ex : corps humain) va avoir une réponse face à ce toxique ! On explique ce type de réponse par le phénomène d’évolution ! 4  Plan du chapitre 3 / section A Action direct ou indirecte : importance de la bioactivation. Toxicité via une liaison à un récepteur ou modification d’une macromolécule Déterminants de la toxicité d’un métabolite Mécanismes de toxicité cellulaire 5  Acquis d’apprentissage A la fin de cette unité d’enseignement, l’étudiant est capable de : d’expliquer les mécanismes moléculaires menant à une réponse toxique. de résumer les procédures d’évaluation du risque. de justifier sur base d’arguments scientifiques étayés la toxicité de certains composés pour un organe cible. de construire un plan d’expérience valide pour évaluer la toxicité et les mécanismes de toxicité d’un composé. d’exercer un regard critique sur un protocole d’expérience d’analyse toxicologique. de rédiger des conclusions argumentées sur base d’un tableau présentant des résultats d’analyses toxicologiques. 6 Toxicologie moléculaire et cellulaire définition de la toxicité moléculaire et cellulaire Approche mécanistique Etudie la réponse biochimique et la réponse en termes de signalisation cellulaire lors d’un dommage chimique aux macromolécules cellulaires. 7 3  Mécanismes de toxicité Directe : action directe du composé. se lit direct à la cible Indirecte : via une conversion enzymatique vers un métabolite électrophile qui va réagir avec les macromolécules cellulaires (bioactivation). Importance dans ce cas du métabolisme dans la prédiction de la toxicité. d’abord métabolisé avant de faire son action Un seul composé peut avoir les deux types de toxicité. Il peut être toxique tel qu'il est et ensuite l'être lorsqu'il est métabolisé. Tout le monde a un degré de métabolisa on hépa que différent. Si c'est un métabolite toxique ; la personne produisant le plus de métabolites sera celle qui subira le plus d'effet toxiques. 8 3  Bioactivation La bioactivation est la transformation d’un composé chimique peu réactif ou quasi inerte en un métabolite intermédiaire très réactif. beaucoup des composé (70-75%) peuvent devenir toxique par bioactivation !! cela nous permet d’anticiper qui est le plus suceptible davoir une toxicité ! On a tous des capacité de métabolisation qui sont différentes et donc on a des capacités de bioactivation différentes et donc ça mène à des produits toxiques différetns !! 9 3  Bioactivation Idéalement, le métabolite devrait être moins réactionnel que le composé de départ mais ce n’est pas toujours le cas. moins réactionnel et donc éliminé ces étapes permettent d’augmenter la polarité des composés et donc sa MM mais quad meme chargé - Phase I = phase de bioactivation → oxyde la molécule afin qu’elle devienne un nucléophile ou un électrophile Phase II = phase de détoxification → composé nucléophile est pris en charge par des enzymes. Étape de protection qui permet de plus facilement éliminer la molécule du système afin de limiter sa liaison à des protéines ou l’ADN. → liaison à une protéine: risque de changer son affinité, son temps de demi-vie,... → liaison à ADN: l’accumulation de mutations peut induire des cancers Le métabolisme d’une substance dépend de la phase I et II. après phase 1 molécule réactive : molécule réactive qui peut réagire avec ADN (génotoxicité qui va engendrer cancer. C’est la première étape vers un cancer) et prot (perte de la fonction de la protéine et donc ça mène aussi perte de l’organeex : hépatite fulgurante) ceci mène à une toxicité Bock, Biochem Pharmacol 2003 10 3  Bioactivation Exemple du parathion peut être toxique pour l’homme par bioactivation riche en O2 et e- Liaison et inactivation de l’acetylcholinestérase, menant à une stimulation neurale, des convulsions et métabolite actif ! la mort. dégrade acétyl choline rôle Ach impliqué dans la stimulation neuronale et musculaire et donc mène à des pb tels que cité si dessus toxicité par formation d’aduits dans les molécule faire attention aux motifs chimiques !! ce qui est commun entre les molécule Adapté de Misik et al, Toxicol Meca & Meth, 2012. 11 3  Mécanismes de toxicité toxicité peut se faire de ces 2 manières Via une liaison à un « récepteur » et transduction d’un signal (agent toxique, métabolites actifs). Ce récepteur ( = cible : molécule activé de façon souvent irréversible) mène à cascade qui est la cause de la toxicité Via une modification d’une macromolécule (formation d’adduits aux protéines et/ou à l’ADN) (métabolites actifs). souvent le cas des métabolites actifs 12 3  Liaison à un récepteur ≠ Interactions médicaments-récepteurs. Notion de récepteur, plutôt une cible Liaison souvent irréversible Effets souvent tardifs car modification d’expression des gènes 13 3  Action directe d’agents toxiques sur un récepteur pas de bioactivation ici An Introduction to Toxicology, Burcham 2014. 14  Action directe d’agents toxiques sur un récepteur FT qui sera lié par des composés qui ont certaines caractéristiques : plane et hydrophobe : tous ce qui contient plusieurs sites benzoïques Ou TCDD Contaminant de l’Agent Orange Guerre du Vietnam herbicide pendant la guerre An Introduction to Toxicology, Burcham 2014. 15  Plan du chapitre 3 / section A Action direct ou indirecte : importance de la bioactivation Toxicité via une liaison à un récepteur ou modification d’une macromolécule Déterminants de la toxicité d’un métabolite : stabilité et propriété electronique Mécanismes de toxicité cellulaire 16 Déterminants de la toxicité d’un métabolite 1. Stabilité 2. Propriétés électroniques, conférant une préférence pour certaines macromolécules 17 3 Déterminants de la toxicité d’un métabolite 1. Stabilité : importance du temps de demi- vie intracellulaire (T1/2). Le temps pour que la concentration intracellulaire diminue de 50%. plus le temps de demi vie est long, plus l’agent toxique va pouvoir aller loin ! Détermine le rayon d’action du métabolite avant de réagir avec une macromolécule, une enzyme de détoxification ou de se dégrader spontanément. 18 3  Déterminants de la toxicité d’un métabolite Les cytochromes P450 (CYP450) sont une grande famille d'enzymes qui jouent un rôle crucial dans le métabolisme de nombreux composés. Burcham, An Introduction to Toxicology 2014. 19 3 Déterminants de la toxicité d’un métabolite Dihydralazine (rare) Vinyl chloride Dérivés de la fumée du tabac Burcham, An Introduction to Toxicology 2014. 20 3  Exemple de l’halothane exemple de toxicité du scénario 1 : molécule 1 caractérisé par Cl et Br (très réactif) activé par un cyochrome et on se retrouve avec un molécule réactive qui a toxicité directe ou (sc1) elle va donc réagir avec l’enzyme (amine) et formé un adduit. Elle forme un épitope du non soi qui mène à une réponse immune (autoanticorps) On bloque l'enzyme et on forme une molécule qui n'est pas reconnue par l'organisme ce qui va engendrer la formation d'Ac. Figure 4 Biotransformation de l’halothane. L’halothane est métabolisé par le CYP2E1 en un radical trifluoroacétyle qui se fixe de façon covalente sur le résidu lysine de plusieurs protéines dont le CYP2E1 lui-même. La modification de ces protéines conduit à la réponse immune associée à l’hépatite à l’halothane. Robin, Hépato-Gastro & Oncol Dig, JLE, 2005 (www.jle.com) 21 3  Exemple du 4-ABP exemple du sc 4 : 4-aminobiphenyl peut être le substrat d’une bioactivation, on obtient métabolite stable (produit) qui peut se déplacer dans le corps et arriver à la vessie ! dans la vessie : pH acide et donc on peut avoir catalysation du réactif : arylnitrenium donne la molécule toxique ! On considère que c’est bioactivé dans le foie (c’est pour ça qu’on dit sc4) phase 1 phase 2 Burcham, An Introduction to Toxicology 2014. 22 3 Déterminants de la toxicité d’un métabolite 2. Propriétés électroniques – Souvent des électrophiles en recherche de nucléophiles. – Hétéroatomes nucléophiles dans l’ADN et les protéines. – Théorie HSAB pour expliquer les préférences ADN vs protéines. 23 3 Hétéroatomes nucléophiles Les composés toxiques sont électrophiles, càd qu’ils réagissent avec une base nucléophile, par exemple les dans l’ADN et les protéines hétéroatomes nucléophiles au niveau des protéines ou de l’ADN. 24 3  Théorie HSAB Hard and Soft Acid and Bases Introduit par Ralph Pearson en 1965 Acide : électrophile (accepte l’électron) ← Agent toxique Base : nucléophile (donne l’électron) ← Cible Hard : charge électronique forte, peu polarisable. ← Mésomérie Soft : charge électronique faible, hautement polarisable. molécule hard réagissent Hard on hard / soft on soft avec molécule hard et ↑ Moment dipolaire molécule soft avec soft 25 3  Soft vs hard on peut représenter charge electronique pas de moment dipolaire ! elles sont plus en mésomérie! réagissent avec Adn (memotechnique) hArd Soft Réagissent avec protéines Hard Moment dipolaire Mésomérie Hautement polarisable Peu polarisable 26 3  Métabolites électrophiles soft Ex, paracétamol Figure 2 Métabolisme du paracétamol. Le paracétamol peut être transformé en un métabolite réactif, la N-acétyl-p- benzoquinoneimine qui se fixe de façon covalente sur les protéines. Il existe au cours de ce métabolisme plusieurs voies de détoxication qui sont figurées en vert. NAPQI : molécule toxique et considéré comme soft et va pouvoir se lier avec d’autre soft et donc fixation covalente aux protéines N-acetylcystéine La façon de détoxifier le NAPQI on donne le N-acetylcystéine qui prend la place des thiol des protéines par son thiol Robin, Hépato-Gastro & Oncol Dig, JLE, 2005 (www.jle.com) 27 3  Métabolites électrophiles hard Ex, hydrocarbones polycycliques aromatiques Fumée de cigarette deuxième Fumée de voiture bioactivation Première bioactivation Plus stable que le premier pas polarisable. epoxide et donc va réagir avec Subit deux cycles de la même ADN bioactivations façon dont elle réagit avec ADN Eleska, Wikipedia 2010. Pradhan et al, Biochemistry 2001 28 3 A DNA adduct (at center) of benzo-α-pyrene, the major mutagen in tobacco smoke. structure polaire qui va former un adduit ! un adduit est un complexe formé lorsque des substances chimiques réactives (souvent toxiques) se lient de manière covalente à des biomolécules comme l'ADN, les protéines, ou les lipides. Found on Wikipedia Created by Zephyris using PDB 1JDG Structure reported by Pradhan et al, Biochemistry 2001. 29 Déterminants de la toxicité d’un métabolite Cette sélectivité pour certaines macromolécules se traduit par des conséquences pathologiques qui divergent. – ADN : risque de cancer, malformations embryoniques. (ex, p53, K-Ras) – Protéines : dysfonction d’un organe cible, réaction toxique allergique. 30 3 Théorie HSAB appliqué à la toxicologie Métabolites électrophiles soft Métabolites électrophiles hard Réaction avec les Réaction avec les nucléophiles soft des nucléophiles hard de l’ADN protéines (groupe thiol du (O et N dans les cycles glutathion et AA cystéine) purines et pyrimidines) et des protéines (N dans les Toxicité limitée à un organe AA lysine, histidine et Ex: métabolite du arginine) paracétamol Plutôt ADN  cancer (hépatotoxicité, Ex: métabolites diol néphrotoxicité) époxides des hydrocarbones polycycliques aromatiques (cancer). 31 3  Plan du chapitre 3 / section A Action direct ou indirecte : importance de la bioactivation Toxicité via une liaison à un récepteur ou modification d’une macromolécule Déterminants de la toxicité d’un métabolite Mécanismes de toxicité cellulaire 32  Mécanismes de toxicité cellulaire Plusieurs mécanismes possibles Très souvent une combinaison 1. Liaisons covalentes 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique 3. Production de radicaux libres 4. Peroxydation lipidique 5. Apoptose 6. Voies signalétiques de réponse au stress (MAPK) 33 3  Mécanismes de toxicité cellulaire Plusieurs mécanismes possibles Très souvent une combinaison 1. Liaisons covalentes 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique 3. Production de radicaux libres 4. Peroxydation lipidique 5. Apoptose 6. Voies signalétiques de réponse au stress (MAPK) 34 3  1. Liaisons covalentes Formation d’un adduit à l’ADN ou un adduit protéique lors de la réaction d’un métabolite électrophile avec une macromolécule cellulaire riche en nucléophiles (ADN ou protéines) 35 3  1. Liaisons covalentes Ex, hydrocarbones polycycliques aromatiques Fumée de cigarette, voiture Eleska, Wikipedia 2010. Pradhan et al, Biochemistry 2001 36 3  1. Liaisons covalentes La formation d’un adduit ne signifie pas automatiquement la mort cellulaire. Dépend aussi de l’importance de la cible protéique ou ADN. Ex, paracétamol et 3-hydroxyacétanilide 37 3  1. Liaisons covalentes Mort cellulaire Toxicité hépatique 2 cas : - paracétamol dans des cellules hépathiques se transformera en NAPQI (système est accroché au ER mais se fait dans le cytolplasme) temps de demi vie long permet de diffuser jusque mitochondrie où il causera de dommages ce qui mènera à la mort cellulaire. - Il y a 3-OH…. lorsqu’il est métabolisé le produit est très réactif, il ne va pas migrer et il va réagir directement avec le ER : pas de mort cellulaire car les atteintes sont réparables (comparé à la mitochondire) 2 molécules très proches structurellement : l’une induit la mort cellulaire et pas l’autre et cela dépend de leur demi vie. Ca ressemble beaucoup au scénario 1 Pas de mort cellulaire Pas de toxicité hépatique 3-hydroxy acetanilide La position de l'hydroxyle par rapport à la partie N-acétylée est différente. Burcham, An Introduction to Toxicology 2014. 38 3  Détection des adduits à l’ADN Initialement, détection par administration d’un agent toxique radio-marqué et mesure de la radioactivité dans la fraction ADN. A permis de montrer le côté irréversible de la réaction. est ce que la molécule forme un lien covalent à l’ADN ? si cet ADN est radioactif c’est qu’il y a un lien covalent ==> on montre aussi le côté irreversible de la réaction ! DNA extraction Radioactivity detection 39 3  Détection des adduits à l’ADN Actuellement d’autres techniques (DNA adductomics) – 32P-postlabeling assay – Techniques basées sur la spectrométrie de masse (DNA adductomics) 40 3  32P-postlabeling assay Brin d’ADN qui va avoir des adduits (représenté par X et Y et p est le PO4 qui lit chacun des oligonucléotides). Si on veut savoir il y a adduit qui est formé, on peut dirigé ces bases, on va extraire ces bases marquées. Comme il y a phosphate on va lié P32 et on va faire migrer sur gel et on va pouvoir voir pattern. Comme P32 est radioactif on peut mesurer la radioactivité ! Gupta, Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, 1996. 41 3  32P-postlabeling assay - FYI The 32P-postlabeling is comprised of several steps (Fig. 4.1). Step I involves degradation of DNA to 3'-monophosphates of normal deoxynucleosides (Np) and adducts (Xp). Adducts resulting from aromatic and/or lipophilic carcinogens (Xp) are enriched by removal of Np by either selective extraction of Xp in I-butanol (Gupta, 1985), by conversion of Np to N selectively by hydrolysis of the digest with nuclease PI (Reddy and Randerath, 1986), or by Cl8 reverse phase HPLC (Dunn and San, 1988) or TLC (Spencer and Gupta, 1992) (Step 11). The enriched adducts are 5' -32P-labeled by T4 polynucleotide kinase-catalyzed phosphorylation in the presence of ["{-32P]-ATP (Step III). The resultant labeled adducts ([5'_32P]pXp) are separated by multidirectional, anion exchange polyethyleneimine (PEI)- cellulose TLC (Step IV). The presence of extra spot(s) in the treated as compared to untreated DNA processed in parallel shows the presence of adduct(s), as detected by autoradiography and quantitated by measurement of the adduct radioactivity (Step V) Gupta, Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, 1996. 42 3  DNA adductomics The principle of the MS-based methodologies for global detection of DNA adducts. basé sur SM : SM en tandem : 2 masse peuvent être détectée. on va regarder les réactions qui font perdre le ribose (on connait sa masse : 116,0473, et donc on peut détecter les pertes de riboses. On détécte si il y a des adduits sans utilisation de radioactivité Cao & Zhang, Biomolecules 2024 43 3  DNA adductomics - FYI The principle of the LC-MS-based methodologies for global detection of DNA adducts is rooted in a universal observation: in MS/MS, the ions of 2′-deoxynucleosides readily lose a neutral fragment of dR (mass 116, or 116.0473 in HRMS) when subjected to collision-induced dissociation (CID), generating the product ions [M + H − 116]+ or [M + H − 116.0473]+. Therefore, DNA adducts are detected through monitoring the ion transitions [M + H]+ → [M + H − 116]+ or [M + H − 116.0473]+. Further fragmentation of the product ions in MS3 can lead to neutral loss of either nucleobases or the chemical modification moieties, generating the ions of the chemical modification moieties or nucleobases and thus providing more robust evidence for the identities of DNA adducts. Cao & Zhang, Biomolecules 2024 44 3  Mécanismes de toxicité cellulaire Plusieurs mécanismes possibles Très souvent une combinaison 1. Liaisons covalentes 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique 3. Production de radicaux libres 4. Peroxydation lipidique 5. Apoptose 6. Voies signalétiques de réponse au stress (MAPK) 45 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique Taux de Ca2+ libres dans le cytosol très bas ~ 100nM Contrôlé par des canaux ioniques, pompes ioniques et protéines de capture Régit de nombreuses fonctions cellulaires Ex, une concentration élevée en Ca2+ active des calpains, des nucléases et des lipases. 46 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique Ces transporteurs permettent de garder le taux cytosolique de calcium bas ! Carafoli, Nat Rev Mol Cell Biol 2003 47 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique On voit qu’il y a des récepteurs qui peuvent être stimulé par des agoniste et de ce fait activé des enzymes par la PLC qui transforme le phosphatidylinositol2P en IP3(module de pompe calcium du ER et libérer du calcium dans le cytosol) et en DAG En toxico on a des molécules qui peuvent induire cette cascade là : on est dans le cas de toxicité par fixation à un récepteur ! Carafoli, Nat Rev Mol Cell Biol 2003 48 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique Altération des taux de Ca2+ par un agent toxique - Direct, par liaison à des RTK ou des GPCR  ↑[I3P], qui induit la libération du Ca2+ depuis le RE vers le cytosol. Plus souvent formation d’adduits qui peut se faire par des protéines ou de l’ADN - Indirect, via la bioactivation. Ex, paracétamol : les métabolites altèrent les pompes calciques. en formant des adduits à la protéine de la pompe calcium 49 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique sc 2 je crois altération pompe forme adduit au Résultait calcium augmente dans le pompe calcium cytosol car ne peut plus être stocké dans ER et ne peux plus sortir par la PMCA Burcham, An Introduction to Toxicology 2014. 50 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique intéressant ! différentes étapes mis qui finissent par mener à la même chose Figure 1 Lésions moléculaires induites par les métabolites réactifs électrophiles. Ex, paracetamol. Robin, Hépato-Gastro & Oncol Dig, JLE, 2005 (www.jle.com) 51 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique Surtout pertinent pour le SNC. Parfois pour le foie et les reins. 52 3 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique ça devient problématique quand agent toxique mène à une surstimulation à ce récepteur au glutamate ! agent toxique ! /BMAA Lorsqu'il y a suractivation du transporteur il y augmentation de la concentration calcique dans le cytosol qui va activer certaines enzymes qui vont mener à l'altératuon de certains systèmes. Ceux-ci pourront entrainer la mort cellulaire de façon directe ou indirecte via la peroxydation des lipides. On est dans un neurone, GluR : récepteur au glutamate qui lorsqu’il est activé par le glutamate augmente taux de calcium intracellulaire: conséquence : active protéase, lipase … qui induise stress oxydant et autre chose mais jsp Jakaria et al, Front Mol Neurosci, 2018 53 3  Mécanismes de toxicité cellulaire Plusieurs mécanismes possibles Très souvent une combinaison 1. Liaisons covalentes 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique 3. Production de radicaux libres 4. Peroxydation lipidique 5. Apoptose 6. Voies signalétiques de réponse au stress (MAPK) 54 3  3. Production de radicaux libres stress oxydant : présence excessive de radicaux libre qui mène à fonction déletaire. En tant normal il y a tjrs des RL mais qd y en trop c’est problématique Radical libre : espèce atomique ou moléculaire qui possède, sur son orbitale externe, un électron non apparié. – Neutre (R∙) – Anionique (R∙-) La charge de la molécule n’est – Cationique (R∙+) pas lié à son caractère radicalaire !!! 55 3  3. Production de radicaux libres La présence d’un électron libre donne des propriétés remarquables : Réactivité Elle veut prendre un e- ailleurs Instabilité  Réaction en chaine (propagation) prend e- à la molécule d’à côté et cette molécule devient radicalaire et va faire pareil : réaction en chaîne. La réaction s’arrête grâce à un antioxydant ! 56 3  3. Production de radicaux libres Antioxydant : agent qui empêche ou ralentit l'oxydation en neutralisant des radicaux libres. Donne e- de sa couche externe sans devenir radicalaire et devoir aller chercher un e- ailleurs. Les antioxydant sont à usages limités : pour chaque radicaux libre il faut une molécule d’antioxydant : il va falloir les regénerer ou bien les trouver dans l’alimentation ! « Radical scavenger » 57 3  3. Production de radicaux libres phénomène continue normal et sain, ça devient un pb lorsque il y en a trop : réduction des réaction de mort cellulaire. molécules d’O2 par Les 3 ROS l’entré d’e- : réaction spontanée ROS Reactive oxygen species Stress oxydatif Principal forme des RL sont les ROS (rose) : celle qui vont induire le stress oxydatif ! C’est ces 3 molécules en roses là Superoxyde dismutase (SOD) Catalase enzyme qui transforme un ROS en un autre Glutathion peroxydase ROS ==> H2O2 est très toxique mais c’est utils psq il existe énormément d’enzyme qui Peroxyredoxin sont capables de transformer H2O2 en H2O … Les enzymes en qst qui peuvent transformer H2O2 en H2O Bartz & Piantadosi, Crit Care 2010. 58 3  3. Production de radicaux libres Catalase H2O2 → H2O + ½ O2 Glutathion peroxydase utilise cofacteur glutathion : nécessite à chaque fois la regénération du glut H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS-SG Peroxyrédoxine Prx(réduit) + H2O2 → Prx(oxydé) + 2 H2O 59 3  Structure de Lewis des ROS e- e- O2  O2 ∙ -  H2O2 2H+ _ e- e- O ∙ ∙O  O ∙O H–O–O–H 2H+ _ ∙∙ ∙∙ e- ∙∙ ∙∙ e- ∙∙ ∙∙ ∙O∙∙O∙  :O∙∙O∙ H∙∙O∙∙O∙∙H 2H+ ∙∙ ∙∙ ∙∙ ∙∙ ∙∙ ∙∙ Oxygène anion peroxyde triplet superoxyde d’hydrogène 60  3. Production de radicaux libres Peroxynitrite résultat d’une réaction entre NO et Effet bénéfique du NO O Trop de NO Ronson et al, Cardiovasc Res 1999 61 3  3. Production de radicaux libres Radical libre neutre (R∙) Autre source de RL www.quora.com, www.atdbio.com, Boots et al, Eur J Pharmacol 2008 62 3  3. Production de radicaux libres Radical libre anionique (R∙-) elle induit un stress oxydant : molécule sous forme de quinone qui va pouvoir capter un e- et être transformer en semi-quinone (= 1’O qui complète l’octet et qui est chargé - et un autre O2 qui sera radicalaire : réaction en chaîne Schlattner et al, J Mol Cell Cardiol 2006c 63 3  3. Production de radicaux libres les deux façons de produire des RL ? Radical hydroxyl (∙OH) : T1/2 de quelques ns. Très difficile à capturer. réagit avec qqch juste à côté et donc détoxification compliqué car il est très réactif Production en continu (mitochondries et autres processus redox), sous contrôle des enzymes protectrices. SOD, catalase,.. (voir la réaction ROS) 64 3  The general scheme of electron flow in the POR/P450 system is: NADPH → FAD → FMN → P450 → O2 P450 = CYP450 c'est une source supplémentaire de radicaux libre en plus des enzyme et du radical OH NADPH Donne e- qui va pouvoir etre transférer au noyaux p450 par l’intermédiare de 2 cofacteurs : FAD, FMN ! P D’où peuvent venir ces e- : système oxydase à fonction mix système constitué d’un lipide oxydase reductase et transfère e- à l’atome de Fer +sieurs cofacteurs : FAD, FMN et CYP450 Tant qu’il y a du NADPH ça va fonctionner Burcham, an introduction to Toxicology 2014 65  3. Production de radicaux libres Le cycle rédox du système oxydase à fonction mixte substrat = RH complexe qui permettra d’oxyder le substrat 66 3  3. Production de radicaux libres En cas d’apport insuffisant en électrons, c’est la porte ouverte au « stress oxydatif ». Si y a pas suffisemment d’e- un anion superoxyde est libéré et on retourne à la réaction de départ : pas assez de NADPH O2-· cette étape sera pas possible ! 67 3  3. Production de radicaux libres CONS2QUENCE DE CES ROS Altérations à l’ADN en continu, réparées par la machinerie cellulaire Altération de l’ADN se fait en continu : Est ce que ce sera réparé ? si ça ne l’est pas c’est ça qui induit mutation dans l’ADN radical superoxyde clivage FAPy-guanine www.atdbio.com 68 3  3. Production de radicaux libres Altérations aux protéines en continu, dirigé vers la dégradation (ex, protéasome). différent a.a qui peuvent être facilment hydroxylée. Les protéines sont régulierement oxydé : si cette oxydation est plus rapide que le renouvellemnt des protéines alors on a toxicité ! personnes agés : enzymes contre stress oxydatif moins productif et moins abondantes Verrastro et al, Biomolecules 2015 69 3  3. Production de radicaux libres De nombreux agents toxiques induisent un stress oxydatif par différent mécanismes. – Ex1: réaction de Fenton e- donné par ion de Fe ou du Cu ou d’autres métaux Rentre en compétiton avec la catalase qui transforme H2O2 en H2O alors que réaction Fenton transforme H2O2 en OH radical e- 70 3  3. Production de radicaux libres De nombreux agents toxiques induisent un stress oxydatif par différent mécanismes. – Ex1: réaction de Fenton e- , 2H+ (SOD) Adapted from Bogdanova & Nikinmaa, J Gen Physiol 2001 71 3  3. Production de radicaux libres De nombreux agents toxiques induisent un stress oxydatif par différents mécanismes. – Ex2: cycle rédox Pas écouter Schlattner et al, J Mol Cell Cardiol 2006 72 3  3. Production de radicaux libres De nombreux agents toxiques induisent un stress oxydatif par différent mécanismes. – Ex3: via l’activation du système immunitaire réactions sucides ==> adduits au protéines ==> activation anticorps Métabolites électrophiles Adduits aux protéines voir ex plus haut ex halothane ! Production de radicaux hydroxyl par la NADPH oxydase Activation des macrophages chacune de ces et des lymphocytes molécules immunitaires peuvent induire stress Recrutement de neutrophiles oxydant par des Production de HOCl enzymes spécifiques! par la myéloperoxydase Production de ONOO- RNS 73 3  3. Production de radicaux libres NADPH oxydase (phagosomes des neutrophiles) NADPH donne e- qui est transférer à l’oxygène et on a anion superoxyde Myeloperoxydase (neutrophiles) PQ les neutrophiles ont ce système là ? alors que c’est hyper toxique. De base c’est un mécanisme de défense contre les pathogènes (voir immuno) Phagosome qui va etre rempli de réactif dérivés de l’oxygène et on mène à production HOCl (eau de HOCl + H2O2 → O2 + H+ + H2O + Cl- javel),pour se débarasser de ces bactéries HOCl + O2 · - → ∙OH + O2 + Cl- HOCl + Fe2+ → ∙OH + Fe3+ + Cl- Ray & Shah, Clin Sci 2005 74 3  3. Production de radicaux libres DeCoursey, Physiology 2010 75 3  3. Production de radicaux libres Resume production des radicaux libre réaction Fenton 2+ Couleur indique le degré de toxicité ! David Lambeth, Nat Rev Immunol 2004 76 3  Mécanismes de toxicité cellulaire Plusieurs mécanismes possibles Très souvent une combinaison 1. Liaisons covalentes 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique 3. Production de radicaux libres 4. Peroxydation lipidique 5. Apoptose 6. Voies signalétiques de réponse au stress (MAPK) 77 3  4. Peroxydation lipidique Les phospholipides sont essentiels à la fluidité des membranes. Liens doubles très sensibles au stress oxydatif. double lien sensible au stress oxydant et ces doubles lien sont essentiels à la fluidité de la mb. Les ag polyinsaturés sont ceux qui sont le plus sensibles au stress oxydant ! Day, UC Davis, www.physwiki.ucdavis.edu 78 3  4. Peroxydation lipidique Structure des phospholipides www.sofibio.com 79 3  4. Peroxydation lipidique Structure des phospholipides En général composé d’un ag saturé et d’un autre insaturés ! 80 3  4. Peroxydation lipidique Structure des phospholipides Foobar, Wikipedia. 81 3  4. Peroxydation lipidique Autocatalyse  toxicité importante au Dans le lipides insatures. niveau des membranes cellulaires. Le lipide représenté est bien attaché au glycerol et à la mb (même si sur le schéma c’est pas le cas) ! L’autocatalyse induit une toxicité importante au niveau des membranes cellulaires. Les doubles liaisons sont particulièrement sensibles au stress oxydatif. Le radical OH peut voler un p+ et un e- du lipide ce qui va induire la formation d’un radicalaire. Puisqu’on se retrouve dans la membrane, ce lipide radicalaire peut aller voler un p+ et un e- du lipide voisin. Ceci peut se répéter 10 à 100x. Ex: acide arachidonique 10-100x Comme y a plein d’ag insaturés à coté et donc on va avoir une réaction en chaine localisé dans cette mb lipidique peroxydation des lipides : altération lipide peroxydée radicalaire c’est pour ça qu’on conserve l’huile à l’ombre Tim Vickers, after Young IS, McEneny J (2001). "Lipoprotein oxidation and atherosclerosis". Biochem Soc Trans 29 (Pt 2): 358–62. PMID 11356183. Vectorized by F Vasconcellos. Wikimedia. 82 3  4. Peroxydation lipidique Activation par Fenton ! La réaction de Fenton peut aboutir à la (Fe donne e-) formation d’un lipide radicalaire. La perte de la double liaison induit une perte de la flexibilité et fluidité de la membrane. LOO = radical peroxide lipidique Devasagayam et al, Ind J Biochem Biophysics 2003 83 3  4. Peroxydation lipidique Les lipides polyinsaturés sont plus sensibles à la peroxydation que les lipides saturés car la forme radicalaire est plus stable. Forme radicalaire des lipide polyinsaturé est plus stable (mésomérie) Boots et al, Eur J Pharmacol 2008 84 3  4. Peroxydation lipidique En réalité on a perturbation dans la structure des lipides Phospholipides Certains ne sont pas toxiques Ex: les isoprostanes libéré dans le sang Premier stade de peroxydation Production de produits de grosse taille Certains forment des adduits aux protéines et à l’ADN Deuxième stade de peroxydation Ex: acroléine, HNE, MDA Production de produits de petite taille lipide tellement peroxydé que ça donne des grosses molécules peroxydé qui vont en libérer des plus petites La production de produits de grosse taille est un bon reflet du statut rédox du patient. De plus ceux-ci ne sont pas toxiques et sont utilisés comme biomarqueurs de la peroxydation lipidique. L’acroléine, HNE et MDA sont des molécules très connues parce qu’elles forment des adduits à l’ADN et sont donc toxiques (les connaitre). 85 3  4. Peroxydation lipidique Isoprostanes : biomarqueurs de la peroxydation lipidique, mesurables par SM dans le sang. radical lipidiques peut oxydé un autre lipides ou faire une réaction intramoléculaire : autre réaction d’oxydation sur même lipide : on forme un cycle On les utilise comme biomarqueurs : reflet du niveau d’oxydation Isoprostanes http://lipidlibrary.aocs.org/ 86 3  4. Peroxydation lipidique Acroléine, HNE, MDA : petits produits toxiques de la peroxydation lipidique Réaction avec des cibles nucléophiles Diffusion cellulaire molécule réactive et pourra former adduit ! Rôle potentiel dans les maladies dégénératives Pizzimenti et al, Front Physiol 2013 87 3  4. Peroxydation lipidique 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) Skorokhod et al, Oxid Med Cell Longevity 2015 88 3  4. Peroxydation lipidique 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) ces 4 voies sont des voies de detoxification Texte réaction toxique HNE va pouvoir réagir avec des protéines : toxicité aigue Mano et al, Plant Cell Physiol 2002 89 3  4. Peroxydation lipidique pas toxic et donc utilisé comme biomarqueur Le CCl4 formera un radicalaire suite à la bioactivation dans le foie. Celui-ci va initier la peroxydation lipidique et aboutira à la libération de plusieurs composés. Certains d’entre eux ne sont pas toxiques et sont utilisés comme biomarqueurs du stress oxydatif. Les autres vont réagir avec de protéines ou l’ADN MB lipidique : peroxydation des lipides, celle ci peut se former par une réaction de phase 1 en une molécule radicalaire (système (CYP450) tjrs ancré dans la mb : donc la molécule radicalaire qui en sort va réagir très vite avec le lipides. Ca mène à des prot de grosse taille et d’autre de peitite taille Burcham, An Introduction to Toxicology 2014 90 3  4. Peroxydation lipidique comprendre que c’est tout une cascad qui s’enchaîne quinone qui donne la capacité de detoxifié le H2O2 Junsquwadee, Cardiovasc Regen Med 2016 91 3  ROS & Peroxydation lipidique Pizzimenti et al, Cancers 2010 92 3  Mécanismes de toxicité cellulaire Plusieurs mécanismes possibles Très souvent une combinaison 1. Liaisons covalentes 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique 3. Production de radicaux libres 4. Peroxydation lipidique 5. Apoptose 6. Voies signalétiques de réponse au stress (MAPK) 93 3  5. Apoptose = mort cellulaire programmée volume cellulaire diminue et mène vers des corps apoptotique : mb cellulaire est ≠ nécrose elle n’est pas programmée impérméable et reste intact. Ces corps apoptotique pourront être phagocyté par d’autres cellules intérêt : pas d’inflammation dans le tissu car il n y a pas libération du contenu cellulaire  Mort cellulaire, gonflement de la cellule, perte de l’intégrité de la mb et libération de ces entre nécrose et composants dans la matrice extracellulaire apoptose Kumar et al, Robbins Basic Pathology 8th edition 94 3  swelling =: volume qui augmente conservation du pattern d’ADN pas de fragment d’ADN ou alors des fragments non contrôlé de taille différente clivage coordonné certain seront phagocyté et d’autere seront pas phagocyté et finiront par un nécrose changement du pattern d’ADN nucléaire 95  96 Scarabelli et al, Curr Prob Cardiol 2006  Mort cellulaire Apoptose Nécrose Diminution de la taille de la Augmentation de la taille de cellule la cellule Peu ou pas d’inflammation Inflammation dû a la libération des composants cellulaires Mort programmée, suicide Mort incontrôlée Corps apoptotiques Mitochondries intactes autre slide qu’elle a rajouté : autre mort cellulaire que ces deux mort là. - Autose : excès d’autophagie qui mène à mort cellulaire et ça peut se finir par apopotse ou necroptose - necroptose : activation de récepteur lié à l’inflammation (TLR) -Pyroptose : mort cellulaire lié à l’immunité et l’inflammation : l’inflamazome (structure qui permet d’activer certaint type de cytokine (exIL18), lorsqu’elle est activé elle va cliver des procytokine). Joue un rôle important dans cette mort cellulaire - Necrose drivé par perte de perméabilité de la membrane : dans l’apoptose on peut avoir une perte de la perméabilité de la mb des mitochondries et donc ça mène vert un mort cellulaire incontrôlé Ferroptose : excès de peroxydation des lipides qui vont atteindre les lipides de la mb (ils sont clivé) la cellule meurt car elles s’ouvre. Dans ce contexte il y a rôle clé du Fer (réaction de FEnton : peroxyde les lipides qui induit un désordre des mb perte d’intégrité de la mb et mort cellulaire) : Fenton produit de ROS ==> lipides peroxydé mais aussi MD4 et 4-HNE ==> perte intégrité membrannaire. La ferroptose est également caractérisé par un defaut de voies de défense qui permettait de prévenir cette oxydation des lipides ! (chaine à droite avec le glutathion) 97 3  Mort cellulaire Nikoletopoulou et al, BBA – Mol Cel Res 2013 98 3 Autophagy – Nobel Prize 2016 https://www.youtube.com/watch?v=Ws0mOmfC9EU 99 3  Processus ou on va avoir un ph d’autodigestion de la Autophagy cellule à l’intérieur de la cellule. caractérisé par des phagosomes, ce sont des vésicules qui ont pour fonctions de dégrader des vieux organelles : la cellule digère ses propres organites. Ce phénomène permet d’eviter peut protéger la cellule mais si la cellule est trop l’accumulation de particules trop vieille pour fonctionner abimée elle peut induire la mort cellulaire à force de correctement et donc permet la survie de la cellule ! tout digérer ! Nombreuses fonctions physiologiques Degradation et le recyclage des composants cellulaires Production de substrats énergétiques et de substrats pour le renouvellement des composants cellulaires Essentiel pour la réponse à la deprivation et le stress Elimination des bactéries intracellulaires et des virus Dévelopement de l’embryon et differentiation cellulaire Elimination des protéines et organelles endommagées (essentiel lors du vieillissement) 100 3  Autophagy Altérations de l’autophagie donne des maladies : accumulations de protéines/ structures anormal – Maladie de Parkinson – Diabètes de type 2 – Vieillissement – Cancer 101 3  Mort cellulaire cancer : mutatin dans gène impliqué dans l’apoptose : la cellule continue à proliférer KEY MESSAGES Apoptose et nécrose considérés auparavant comme des stades mutuellement exclusifs. Coopération entre nécrose et apoptose. L’apoptose est un type de mort programmée. L’autophagie joue un rôle complexe, qui peut être pro-survie ou pro-mort cellulaire selon les contextes. quand on mesure l’autophagie on sait pas trop dans quel cas on est dcp 102 3  5. Apoptose https://podcast.uclouvain.be/RnESfusLi5 103 3  5. Apoptose Activée en cas de stress ou de dommage cellulaire Utile à la morphogenèse Pérez-Garijo &Steller, Development 2015 104 3  5. Apoptose Voies moléculaire par lequelle peut avoir lieu l’apoptose : mène a activation p53 qui mène a formation adduits production de Bax qui pourront bioactivation former un pore dans la mitochondrie) permettra libération cyt C qui arrive dans le cytosol et se complexera à Apaf-1 : formation du ce la roue de la mort qui cliveront casp9 en pro caspase et pourront digérer et cliver des protéines An Introduction to Toxicology, Burcham 2014. 105 3  5. Apoptose On commence par 2 : perte intégrité mb mitochondrie Identification de protéines clés (Bcl-2 family members) 4 domaines BH1 – BH2 – BH3 – BH4 caractérisé par 4 domaines pour les anti apoptotiques Ex : Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-XL. type de protéines qu’on retrouve, peuvent être proapoptotique (3 domaines (Bax et Bak) et anti-apoptotique 4 domaine (BCl2 et BCl XL ) Contrôlent la perméabilité des membranes mitochondriales et la Bax et Bak peuvent s’homodimérisé et former un pore pour libération du cytochrome c et de SMAC/Diablo. libérer Cyt C SMAC/Diablo. tandis que Bcl2. et Bcl XL pourront inhiber la formation de ce pore : phénomène de compétiton La survie cellulaire dépend de la balance entre les protéines Bax/Bak et Bcl-2/Bcl-XL. 106 3  5. Apoptose Identification de protéines clés (Bcl-2 family members) 1. Bax et Bak induisent l’apoptose par formation d’homo-dimères qui servent de pores membranaires (essentiellement domaines BH1, BH2 et BH3). 2. Bcl-2 et Bcl-XL inhibent l’apoptose par des mécanismes encore à l’étude. Ils bloqueraient la formation des dimères par compétition (les 4 domaines). 3. Bid, Bad, Bim, PUMA et NOXA sont des régulateurs de Bax/Bak et Bcl- 2/Bcl-XL (uniquement domaine BH3). Ils induisent en général l’apoptose. stimuléonly Bax et Bak ou inhiber Bcl2 ou Bcl XL BH3 psq elles ont que le domaine BH3 107 3  Bcl-2 family proteins regulate the mitochondrial pathway of apoptosis. ou Bak/ Bak ces pores induisent la perte d’intégrité membranaire Harmeet Malhi et al. Physiol Rev 2010;90:1165-1194 ©2010 by American Physiological Society  109 Bogner et al, Curr Opin Cell Biol 2010  5. Apoptose - FYI important c’est comprendre les 3 classes This model suggests that competition between Bax/Bak and Bcl-2/Bcl-XL are key interactions for regulation of pore formation. Bax/Bak are soluble proteins that are usually in the cytosol but can translocate to the outer mitochondrial membrane. The translocation of Bax/Bak is not enough to form oligomers, and the role of some BH3-only members (like truncated Bid or tBid) is to serve as activators of Bax/Bak to oligomerization. The role of Bcl-2/Bcl-XL is to competitively inhibit the binding of tBid with Bax/Bak. Bcl-2/Bcl-XL can both interact with tBid or Bax/Bak. In doing so, it renders these proteins incapable to binding to each other and forming activated complexes that can oligomerize. Other BH3-only proteins on the other hand interacts strongly with Bcl-2/Bcl- XL thus releasing Bax/Bak or tBid from it. The free tBid and Bax/Bak are then able to interact and activate oligomerization and consequently MOMP (mitochondrial outer membrane permeability). 110 3  5. Apoptose Pq le Cyt C va induire la mort cellulaire à la base Cytochrome c Transporteur d’électrons indispensable à la respiration mitochondriale Facilite l’assemblage d’un complexe protéique, l’apoptosome (Apaf1), qui recrute la caspase 9, une caspase essentielle à l’apoptose. CASPASES ? Une famille de protéases qui induisent la désagrégation cellulaire qui accompagne l’apoptose. c’est pour ça qu’on dit caspase mère La caspase 9 active par clivage protéolytique les caspases 3, 6 et 7, qui elles digèrent les composants cellulaires essentiels tels que les protéines du cytoskelette (ex, actine). 111 3  5. Apoptose roue de la mort La roue de la mort Krammer et al, Nat Rev Immunol 2007 112 3  5. Apoptose 3D structure of the human apoptosome-CARD complex (Yuan et al. 2010, Structure of an apoptosome-procaspase-9 CARD complex). roue de la mort : apoptosome Unité Apaf1 113 3  5. Apoptose Smac/DIABLO Libéré lors de l’augmentation de la perméabilité mitochondriale Facilite la formation de l’apoptosome via la neutralisation de l’activité antiapoptotic des IAPs (inhibitor of apoptosis proteins). 114 3  5. Apoptose Comment un métabolite bioactivé d’un agent toxique induit-il l’apoptose? Mécanismes encore à l’étude Exemple de p53 Module les protéine BH3 only p53? Facteur de transcription qui prévient la conversion d’une cellule saine en une cellule tumorale. Il décide si l’apoptose doit être déclenchée ou non et si la cellule peut entrer en processus de division. Blocage de la dégradation de p53 lors de la détection de dommages à l’ADN, suite à différents stress (radiation ionisante, radicaux libres, métabolites bioactivés). P53 promeut la transcription de gènes codant pour des protéines PRO apoptotiques telles que Bax. 115 3 Figure 1. A number of cellular stresses, including DNA damage, hypoxia and hyperproliferative signals, activate p53 to stimulate target gene expression. p53 induces genes encoding p21 and some other proteins to implement a G1 arrest response and genes encoding Bax, Puma, P53 : FT dont la dégradation est bloqué si il y Noxa and Perp to activate the a des dommage cellulaire et induira la transcription de certain gène ! : présence = apoptotic pathway. The particular dégradation ADN downstream pathway activated by p53 is influenced by cellular context, and both pathways contribute to tumor suppression.  Rôle clé en cancérogenèse. c’est grâce à ces deux roles qu’on dit que p53 est un gène suppresseur de tumeur ! interfère avec le cycle cellulaire : on empêche la cellule de tue les cellules qui proliférer ont un potentiels tumorales Attardi & DePinho, Nat Genetics 2004 116  5. Apoptose Voie intrinsèque formation d’adduit détecté par p 53 An Introduction to Toxicology, Burcham 2014. 117 3  5. Apoptose étape de bioactivation peut se faire à distance ! Voies intrinsèque & voie extrinsèque Toutes deux peuvent médier des syndromes toxicologiques. Voie intrinsèque : libération d’inducteurs intracellulaires de l’apoptose (ex, cytochrome c, Smac/DIABLO). Voie extrinsèque : issue de l’interaction de ligands mort induit via molécule extracellulaire extracellulaires proapoptotiques (ex, Fas-L, TNFα) avec des « récepteurs de la mort » membranaires (ex, FAS, TNF-R1). – Induit l’apoptose via l’activation d’endonucléases et de caspases (ex, caspase 8). – p53 peut favoriser la voie extrinsèque en stimulant l’expression des « récepteurs de la mort ». Cela suffit dans certains cas pour induire la mort cellulaire. 118 3  réceprteure de la mort TRAIL-R qui lorsqu’il est lié au ligand active porcaspase 8 et induit apoptose (la caspase 8 peut activé BID et donc activer la voie intrainsèque) On interfère avec la voie intrinsèque ! 119 Hersey & Zhang, Nat Rev Cancer 2001  5. Apoptose https://podcast.uclouvain.be/xyM1pcafh8 bien faite 120 3  5. Apoptose Techniques de détection Fragmentation de l’ADN (DNA ladder) ADN fragmenter de taille définié >< nécrose WB de Smac/DIABLO et du cytochrome C au niveau des sous-fractions cellulaires Clivage des caspases Clivage de la PARP Marquage à l’annexin V et à l’iodure de propidium 121 3  5. Apoptose Dans l’apoptose il y a activation d’endonucléase qui cliveront l’ADN à des endroits clé. Fragmentation régulière de l’ADN. Si après chaque histone : 180 ou sinon on peut avoir 2 unités, 3 unités ect : on a des fragments de 180 pb à chaque fois - + Scarabelli et al, Curr Prob Cardiol 2006 122 3  5. Apoptose Fragmentation régulière de l’ADN. marqueur valide la migration Fragmentation de l’ADN analysé par électrophorèse sur gel d’agarose structure en échelle pour l’apoptose alors qu’en nécrose l’ADN est intact et pas fragmenté en pattern Mizuta et al, Plos ONE 2013 123 3  5. Apoptose Libération mitochondriale de Smac/DIABLO et du cytochrome C. type de mort induit par STS ? on traite 2, 4, 6, 8 H WB contre Smac DIABLO et CytC contrôle négatif fait avec le véhicule : Pour designer des expériences il faut mettre le solvant qui a été utiliser pour dissoudre le compoé d’intéret et pas de l’eau : ça permet de s‘assurer que nos résultat ne sont pas dû au solvant. même condition d’expérimentation dans le contrôle négatif que dans les échantillons testés (on met le solvant seul ! ) Au cours du temps on a un transfert de smac Diablo et du cytC depuis les mitochondries vers le cytosol. On peut déduire cela du au faut qu’on observe une diminution dans les mitoch et augmentation dans le cytosol. On peut dire que STS induit apoptose Rehm et al, J Cell Biol 2003. STS, staurosporine. Pellet, pellet-containing mitochondria. Western Blot. 124 3  5. Apoptose Libération mitochondriale de Smac/DIABLO. dans mitochondrie ! Smac/DIABLO Actin dans cytosol On est dans la mêmes lames ! cellules incubés avec ac qui reconnait Smac Diablo (rouge) et acctin (vert). On peut avec le logiciel supperposé les images. On observe que le smac diablo est ponctué (point roge intense) comme c’est pas diffus on peut poser l’hypothèse que SMmac Diablo est bien dans les mitochondries ! Nuclei www.abcam.com 125 3  5. Apoptose Libération mitochondriale de Cytochrome C. consitituant de le paroi mitochondriale On voit que le rouge et le vert sont colacalisé ! plus de superposition entre contrôle positif ; induit cox IV et cuto C mort cellulaire; on voit que cytochrome C et plus diffus et donc on a mort cellulaire et contrôle + : contient l’agent libération de cytoC toxique, ici un proapoptotique connue : on s’assure que la manip a fonctionner ! Lobo et al, Development 2012 126 3  5. Apoptose autre test Clivage des caspases Smac/DIABLO release from mitochondria is a general feature of apoptosis. qu’est ce qu’on conclu ? B. Une fois qu’il y a un traitement la Caspase 3 disparait. On peu conclure que STS, Act.D, Dauna sont des Jurkat cells, either untreated or treated composés proaptotique car ils ont menés au clivage de la procaspase 3 (disparition with 250 nM staurosporine (STS), 10 μM de la procaspase 3 donc surment transformer en capsase 3). actinomycin D (Act. D) or 10 μM c’est pas un design correct car ça aurait dû être traité par le vehicule daunorubicin (Dauno), were harvested at the indicated timepoints. (B) Cells (107) were subjected to a digitonin‐based subcellular fractionation procedure. Cytosolic fractions (∼50 μg per lane) were subjected to SDS–PAGE, followed by immunoblotting with the indicated antibodies. (C) Cytosolic and pellet fractions prepared On observe que dans le from the same cells were subjected to contrôle le cytC est dans les mitochondrie. Alors SDS–PAGE, followed by probing with qu’en présence de ces composé le cyt C n’est pas cytochrome c and Smac/DIABLO‐specific présent dans les mitochondrie mais est présent dans le cytosol ce antibodies, as indicated. qui est caractéristique de l’apoptose Adrain et al, EMBO J 2001 127 3  5. Apoptose Time course analysis of Bcl‐2‐regulated Clivage des caspases Smac/DIABLO release. CEM.vector and CEM.Bcl‐2 cells (cells overexpressing Bcl-2) were UVB‐irradiated for 90 s and harvested at the indicated time points. (B) Cytosolic and pellet subcellular fractions were subjected to SDS–PAGE and immunoblotted with the indicated antibodies. Cytosolic fractions were also probed with an antibody that recognizes only the active form of caspase‐9. Adrain et al, EMBO J 2001 128 3  5. Apoptose PARP enzyme qui est un substrat des caspase qui est impliqué dans la réparation d’un type de dégat de l’ADN, ceci est PARP = poly-ADP-ribose polymerase intéréessant si on veut garder la cellule. Si on est dans le cas de l’apoptose cette molécule sera clivé car c’est inutile de réparer l’ADN si la cellule sera détruite Un substrat de caspases Rôle dans la détection et la réparation des ruptures simple brin de l’ADN Inactivée par clivage via les caspases 129 3  5. Apoptose Clivage de la PARP Clivage de la PARP analysé par Western Blot 8 échantillon : échanitllon 3 et 4 en apoptos car clivage de la PARP Mizuta et al, Plos ONE 2013 130 3  5. Apoptose Annexin V / iodure de propidium Test pour déterminer le type de mort cellulaire : on est en apopotse ou en nécrose ? On utilise 2 colorants - annexin 5 qui se lit sur PS : dans cellule saine elles sont à l’int alors qu’ en apoptose elle sont transférer sur la mb : lorsqu’elles osnt a l’ext elle pourront être détecter par annexin : Nécrose et apoptose seront marqués tandis que les cellules saine non Iodure de propidium peut entrer dans la,cellule que si la mb est abimée et donc perméable (perte de l’intégrité de la mb) donc que dans les cellule en nécrose et d’apoptose tardive (psq à la fin en apoptose elle peut rentrer en apoptose tardive : seront marquées en vert et en rouge http://ezcast.uclouvain.be/ezplayer/index.php?ac tion=view_asset_details&album=WFARM2139- pub&asset=2019_10_12_12h28_58s&asset_toke n=FYQUWMAF BD Biosciences 131 3  5. Apoptose Annexin V / iodure de propidium necrose apoptose saine BD Biosciences 132 3  5. Apoptose Annexin V / iodure de propidium cadrant plus rempli que toute à l’heure : des cellules sont rentrés en apoptose lorsqu’elles sont traités BD Biosciences 133 3  5. Apoptose https://podcast.uclouvain.be/seiI7pJDum 134 3  Mécanismes de toxicité cellulaire Plusieurs mécanismes possibles Très souvent une combinaison 1. Liaisons covalentes 2. Perte du contrôle de l’homéostasie calcique 3. Production de radicaux libres 4. Peroxydation lipidique 5. Apoptose 6. Voies signalétiques de réponse au stress (MAPK) 135 3 6. Voies de réponse au stress (MAPK) 3 classes de MAPK (mitogen-activated protein kinases) ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1 and 2)  prolifération et différentiation cellulaire JNK (c-Jun N-terminal kinase)  module l’apoptose P38 MAPK  module l’apoptose 3 voies principales dépendantes des MAPK - ERK1/2 - JNK - P38 MAPK 136 3 6. Voies de réponse au stress (MAPK) Dialogue important entre ces 3 voies  difficile de généraliser. Leur activation par un agent toxique ~ concentration, type cellulaire et modèle expérimental. Il y a un dialogue important entre ces 3 voies ces voies sont activé par des cytokines ,.. et ces vo