Teoría Micro. PDF

Juana R. Alonso Loitey 2º Odontología 2022 - 2023 1 TEMA 1: Introducción a la microbiología, historia y actualidad. Los microorganismos son seres vivos muy pequeños invisibles a ojo. La característica más importante para considerar un ser vivo com...

Juana R. Alonso Loitey 2º Odontología 2022 - 2023 1 TEMA 1: Introducción a la microbiología, historia y actualidad. Los microorganismos son seres vivos muy pequeños invisibles a ojo. La característica más importante para considerar un ser vivo como un microoganismo es su tamaño. La microbiología es el estudio de los organismos microscópicos, y se extiende al estudio de organismos que, a lo largo de toda su vida o parte de ella, son visibles solo con técnicas microscópicas:  Bacterias (bacteriología): o Legionella o Yersinia o Salmonella o Listeria o Clostridium botulinum o (Corresponde a la característica de generos)  Virus (virología): o Viruela del mono o Poliomelitis o Coronavirus: sars cov 2 / mers o Gripe aviar o Fiebre amarilla o Norwalk (gastronteritis) o Virus del Nilo (mosquito) o Sarampion o Arbovirus: zika, dengue, chikungunya  Hongos (micología): o Candida (Candida auris es el hongo muy resistente)  Parásitos (parasitología): o Malaria /paludismo  Protozoos (protozoología), helmintos (helmintología) y algas microscópicas. MICROBIOLOGÍA Y CAVIDAD ORAL La boca es el segundo sitio con más cantidad de microorganismos de todo el cuerpo, después del colon.  Caries.  Infección periodontal.  Preiimplantitis.  Infección endodóntica.  Infección por cándida.  Herpes: es factor desencadenado 2 HISTORIA DE LA MICROBIOLOGÍA La momia Ramses V padeció por viruela, ya que en su rostro y cabeza quedaron registros de la enfermedad. También había evidencias de polio en el Antiguo Egipto, ya que se podían observar algunas personas con pie equino en grabados en tumbas egipcias. La Vara de Esculapio, el símbolo de la profesión médica, tiene su origen en la extracción de los gusanos de Guinea del tejido subcutáneo enroscándolos en un palillo. INVESTIGADORES IMPORTANTES Robert Hooke (1635 – 1703) realizó estudios de fisiología y biología celular. Constató que los seres vivos están compuestos por células (1665). Antoine van Leeuwenhoek (1632 – 1723) es el padre de la microbiología. Es el primer diseñador de un microscopio manual: se dedicó a limar vidrios para provocar lentes convexos para estudiar el agua y su propia placa dental, de manera que fue el primero en observar microorganismos (1673). Ignaz Semmelwise (1840s) fue el que propuso el lavado de manos del personal sanitario para prevenir la fiebre puerperal, ya que los estudiantes asistían el parto de las mujeres después de haber hecho otras intervenciones y estas acababan enfermando. Redujo esta fiebre en un 80% solo con agua y jabón. Louis Pasteur (1861) demostró que los microbios se encuentran en el aire y refutó la teoría de la generación espontánea mediante la presencia de material particulado en un filtrado de aire en algodón, que podía desarrollar crecimiento bacteriano. También desarrolló métodos de esterilización como la pasteurización. Edward Jenner (1749 – 1823) fue el pionero en la creación del concepto de vacuna, consiguiendo crear la vacuna de la viruela, la primera del mundo y la única que ayudo a erradicar una enfermedad en 1980. Robert Koch (1842 – 1910) estudió el ántrax o carbunble y puso a los microorganismos como causa de las enfermedades infecciosas. Postulados de Koch:  El microorganismo causante de la enfermedad tiene que estar en todos los animales enfermos, pero ausente en aquellos sanos.  El microorganismo tiene que poder crecer en un cultivo puro fuera del cuerpo del animal.  La inoculación de células del cultivo puro a un animal tiene que causar los síntomas típicos de la enfermedad.  A partir del segundo individuo enfermo, tiene que ser posible volver a aislar el microorganismo causante de la enfermedad. 3 Lord Joseph Lister (1827 – 1912) era un cirujano que trabajaba con heridas e impulsó la aplicación de técnicas de asepsia en el acto quirúrgico: fenolización. Paul Elrich (1894) diseñó the magic bullet, el salvarsán, un fármaco derivado del arsénico que es utilizado como quimioterápico para combatir la sífilis. Desarrolló los principios de la quimioterapia. Alexander Fleming (1929) descubrió la penicilina, un fármaco derivado del penicilium, una sustancia liberada por hongos que inhibía el crecimiento de una bacteria que había introducido en un medio de cultivo. Fue el primer antibiótico descubierto.  Quimioterápico: origen químico.  Antibiótico: producido por un organismo. Waksman descubrió la estreptomicina (antibiótico). Carl Woese (1977) descubrió el dominio de archaea. En el año 2000 se suponía que se tendría que haber erradicado la poliomielitis. EL HOMBRE Y LOS MICROBIOS Hay muchos más microorganismos beneficiosos que perjudiciales: A. Placa de petri con Agar, una sustancia que hace que los medios de cultivo sean sólidos. Podemos ver diferentes colonias de bacterias. B. En la elaboración de vino, pan o queso interviene la fermentación de levaduras (hongos). C. Aguas residuales: en las depuradoras se utilizan microorganismos para la purificación del agua. D. Fondo marino. Hay un nombre reducido de microorganismos con acción perjudicial (microbiología clínica). La mayoría de microbios tienen una acción benéfica, ya que intervienen en ciclos como el del carbono, nitrógeno, en la industria alimentaria, etc. Es importante conocer los microbios porque nos permite prevenir la descomposición de los alimentos y enfermedades infecciosas. MICROBIOLOGÍA COMO CIENCIA DINÁMICA La microbiología tiene un papel fundamental en formas vivas de la tierra. Es una ciencia dinámica porque tiene una parte ciencia biológica básica, donde aporta herramientas a otras especialidades para el estudio de procesos vitales (bioquímica y genética); y una parte ciencia biológica aplicada a la medicina, odontología, agricultura, industria y biotecnología. Ejemplos:  Cianobacterias: primeros fotótrofos responsables de la aparición del oxígeno atmosférico.  Reciclaje de nutrientes: ciclo del nitrógeno.  Degradación de la materia orgánica: muchos productos orgánicos pueden ser procesados por las bacterias. Facilita la eliminación de residuos. 4 MICROORGANISMOS Los microorganismos viven en asociación, en poblaciones que se relacionan unas con las otras formando comunidades. El crecimiento planctónico se da cuando las comunidades están en forma de células libres, es un crecimiento más artificial. Las comunidades también pueden formar biofilms en soportes vivos o inertes, es el crecimiento natural de los microorganismos. En la superficie de la lengua humana hay varios tipos de agregados bacterianos como parte de la microflora normal. En la agricultura intervienen en:  Fijación del nitrógeno.  Digestión de herbívoros.  Reciclado de nutrientes (Carbono, Nitrógeno, Sufre).  Enfermedades. En el medio ambiente:  Descomposición de la materia orgánica.  Fotosíntesis.  Biorremediación: detoxificación de aguas residuales (hidrocarburs, mercuri).  Insectos biológicos (Bacillus thuringiensis, está ayudando con la plaga de mosquitos tigre eliminando sus larvas).  Producción de metano: se puede utilizar en muchas plantas de eliminación de “basura”. Aplicaciones industriales:  Industria química: producción de celulosa, alcohol, acetona.  Industria sanitaria / farmacéutica: producción de fármacos como la insulina.  Industria alimentaria: producción de vinagre, vino, cerveza, etc.  Ingeniería genética: bacterias y hongos pueden producir vacunas, enzimas, etc. Con la terapia génica se está estudiando la reposición en células humanas de genes defectuosos o inexistentes, mediante el uso de virus. DISTRIBUCIÓN DE LA VIDA EN EL PLANETA Los microorganismos se pueden encontrar en ambientes extremos (extremófilos) y pueden ser muy peligrosos (virus Ébola, sin cura y altamente contagioso). El segundo órgano del cuerpo con más carga bacteriana es la boca. Los microorganismos anaeróbicos son menos abundantes y más difíciles de cuantificar. 5 MODELOS DE ORGANIZACIÓN DE LOS SERES VIVOS El Árbol de Haeckel está basado en el pensamiento evolutivo Darwiniano y constaba de 3reinos: plantas, animales y protistas. Whittaker (1959) creó el árbol de 5 reinos: plantas, hongos, animales, moneras y protistas(surgieron cuando apareció el oxígeno atmosférico). El árbol filogenético molecular de Carl Woese (1990) contiene 3 grupos evolutivos (dominios):  Bacteria – eubacteria.  Archaea – archaebacteria.  Eukarya – eukaryotic nuclear / cytoplasmic lineage. CLASIFICACIÓN ACTUAL DE MICROORGANISMOS  Bacterias: procariotas con una pared celular con peptidoglicano, se reproducen mediante fisión binaria y obtienen energía de sustratos orgánicos, inorgánicos o fotosíntesis.  Archaea: son procariotas, no tienen peptidoglicano en su pared, pueden vivir en ambientes extremos e incluyen: o Metanógenos. o Halófilos extremos. o Termófilos extremos.  Eukarya: o Hongos: eucariotas, tienen quitina en su pared celular, obtienen energía de sustratos orgánicos. El moho y las setas son hongos multicelulares (micelios, hifas), mientras que las levaduras son unicelulares. o Protozoos: eucariotas, absorben o ingieren sustratos orgánicos y pueden ser móviles, ya que pueden tener pseudópodos, cilios o flagelos. Protistas. o Parásitos multicelulares: eucariotas, tienen estadios microscópicos en ciclo evolutivo. Helmintos planos (céstodos y tremátodos) o redondos (nemátodos). o Algas: pueden ser uni o multicelulares. Protistas. Los priones y los virus no se pueden considerar seres vivos, son agentes infecciosos que para vivir dependen de un huésped. Son formas acelulares.  Virus: acelulares. Compuestos de DNA o RNA. El Core tiene una cubierta proteica (cápsida). Pueden tener una envoltura lipídica. Se replican solos intracelularmente en una célula huésped. 6 NIVELES, NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS 1. Dominio. El sistema de nomenclatura científica es 2. Reino. Linnaeus establi, un sistema binomial (2 3. Filo. palabras) donde se menciona el género y el 4. Clase. epíteto de especie. 5. Orden. El nombre del género suele abreviarse con una 6. Familia. sola letra, pero el de la especie no. 7. Género. Se escriben en latín, en cursiva y el género con 8. Especie (bacteriana, fúngica). mayúscula: Escherichia coli / E. coli / E. coli. Staphylococcus aureus / S. aureus / S. aureus 7 TEMA 2: Microscopía. CONCEPTOS BÁSICOS Poder de resolución (PR): está relacionado con la calidad de las lentes del objetivo. Es la capacidad que tiene una lente de distinguir, a una determinada distancia, dos puntos separadamente.  PR = 0,4 µm, capacidad de distinguir 2 puntos como separados si están a 0,4 µm o más el uno del otro.  A menor longitud de onda de la luz utilizada en el instrumento óptico (rango azul del espectro visible), mayor poder de resolución (luz blanca, MO de relativamente larga longitud de onda, PR máximo 0,2 µm): 0,5 · 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒 𝑜𝑛𝑑𝑎 (λ) 𝑑= 𝑁·𝐴  En cambio, en el ME (la λ de los electrones es muy corta), PR máximo 2 nm. La apertura numérica está relacionada con el poder de resolución, ya que a medida que aumentamos el aumento de los objetivos, también aumenta la apertura numérica. Con las tinciones se aumenta el contraste de los microorganismos con el medio que les rodea. Modificando el índice de refracción se obtienen imágenes claras. El objetivo 100x’ requiere el uso del aceite de inmersión con el mismo índice de refracción del vidrio = 1,5. Los objetivos que no necesitan el aceite se denominan objetivos en seco. MICROSCOPIOS  Tamaño real: lo que mida más de 200 µm se pueden ver sin microscopio. Garrapatas.  Microscopio óptico (MO): 200 nm – 10 mm. Eritrocitos. Hay varios tipos dependiendo de la fuente de luz: campo claro (luz visible), campo oscuro (para estructuras muy finas), contraste de fases (observar células vivas sin necesidad de tinción), fluorescencia (luz ultravioleta). 8  Utiliza mucho para estudiar el biofilm 9   Microscopio electrónico de barrido (MEB): 10 nm – 1 mm. E. coli (bacterias). No atraviesa el objeto sino que dispersa y proyecto en la pantalla.  Microscopio electrónico de transmisión (MET): 10 pm – 100 µm. Emite haces de electrones que atraviesan la muestra, de manera que se pueden ver las cosas a más aumentos. Bacteriófagos (virus que infectan bacterias).  Microscopio de fuerza atómica (FAM): 0,1 nm – 10 nm. Interacción entre partículas de nuestra muestra, y cuando la punta se acerca lo suficiente provoca una repulsión de átomos para obtener la imagen. Doble hélice del ADN. TINCIONES PARA LA PREPARACIÓN DE MUESTRAS EN MICROCOPIO ÓPTICO 1. Fijación en el portaobjetos: puede ser con calor o alcohol. 2. Tinción simple: un solo colorante. Nos sirve para analizar muestras y ver si hay pus. 3. Tinción diferencial: tinción de Gram y de Ziehl Neelsen (BK). Se utiliza un colorante primario (como el cristal violeta), iodo (mordiente), decoloración con alcohol y aplicación de un colorante de contraste (como la safranina). a. En la tinción de Gram, las bacterias que se tiñen de violeta son grampositivas, mientras que las que se tiñen de rosa son gramnegativas. b. Por ácido alcohol resistencia: Mycobacterium tuberculosis. 4. Tinción especial: es una tinción negativa que proporciona un fondo de contraste. Para la tinción de cápsulas, endosporas o flagelos. Klebsiella pneumoniae. 10 PREPARACIÓN DE MUESTRAS EN MICROCOPIO ELECTRÓNICO 1. Fijación con gluteraldehido, tetraóxido de osmio e inclusión en resina epoxi. 2. Deshidratación y secado de punto crítico. 3. Vacío. 4. Cortes finos con ultramicrótomos o criostato (MET). 5. Tinción (MET: ácido ósmico, permanganato, sales de uranio, lanta o plomo, SEM sales de oro). NUEVAS MICROSCOPÍAS  Confocal (CLSM): es un microscopio de fluorescencia con un láser integrado (de fotón único). Permite reconstruir imágenes tridimensionales, acceder a diversos planos de enfoque y ver si hay vacuolas contráctiles de Paramecium tetraurelia. Se pueden observar comunidades microbianas en biofilm. o Células vivas en verde, muertas en rojo. UNIDADES DE LONGITUD  Milímetros (mm): algunos parásitos y ectoparásitos.  Micrómetros (µ): 10-6.  Nanómetros (nm): 10-9. Virus.  Picómetros (pm): 10-12.  Femtogramos (fg): 10-15. Medida de volumen utilizada en análisis de laboratorio. CULTIVOS  Tipos: o Líquidos: caldos. o Sólidos: el Agar a temperatura ambiente es sólido. Permite el aislamiento de cultivos puros. 11 TEMA 3: Técnicas diagnósticas de las enfermedades infecciosas. El laboratorio de microbiología se trabaja con seres vivos y agentes potenciales que pueden causar daños. Existen 4 niveles de seguridad biológica (BSL, biosecurity level):  Nivel 1: acceso limitado, barreras de protección básicas como batas y guantes, laboratorios de docencia donde se trabaja con patógenos conocidos (Bacillus subtilis).  Nivel 2: acceso limitado, se debe utilizar barreras de protección y cuando una manipulación puede generar aerosoles se debe utilizar una cabina de seguridad biológica, se trabaja patógenos de riesgo moderado (Streptococcus pyogenes).  Nivel 3: acceso limitado y separado de la circulación general, se deben utilizar barreras de protección, el laboratorio debe tener una presión negativa (para que no salga el aire) y estar equipado con filtros para evitar el escape de patógenos, las manipulaciones deben llevarse a cabo en cabinas de seguridad biológica y se trabaja con patógenos emergentes y de alto riesgo (Mycobacterium tuberculosis, VIH, SARS CoV 2).  Nivel 4: acceso limitado y separado de la circulación general, se deben utilizar barreras de protección, las manipulaciones se deben realizar en una cabina de seguridadbiológica sellada, el personal debe llevar trajes de presión positiva (para que no les entreaire) con un suministro de aire y el resto de los requisitos del BSL – 3. Se trabaja con patógenos emergentes, de alto riesgo (especialmente los que se pueden transmitir por aerosoles) o con aquellos para los que no existe ningún tratamiento, curación o vacuna (virus del Ébola, Mycobacterium tuberculosis resistentes a antibióticos). NIVELES DE CONTENCIÓN Existen 3 clases de cabinas de contención biológica (CSB):  Clase I: cabina de flujo laminar. El aire entra por un lado y sale por el fondo de la cabina, provocando un flujo que protege el producto, aunque al trabajador no tanto.  Clase IIA: hay un flujo laminar horizontal y vertical. El trabajador está más protegido. El aire recircula en un 70%, por lo que tienen una protección media.  Clase IIB: sólo recircula un 30% del aire, por lo que el otro 70% se expulsa al exterior después de pasar por un filtro, protegiendo más al trabajador.  Clase III: sólo la tienen los laboratorios de BSL – 4. Está totalmente sellado (estanca) y contiene unos guantes de goma para no entrar en contacto con lo que haya dentro de la cabina. 12 DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS La detección directa de patógenos se realiza mediante técnicas de microscopía con exámenes en fresco, tinciones simples, diferenciales o tinciones negativas. Con un aislamiento también podemos detectar los microorganismos, ya que se puede dejar que crezcan en un cultivo en medio sólido (después de haber estado en uno líquido) y exclusivo de una sola colonia, para poder identificar el microorganismo y estudiar su sensibilidad a los antimicrobianos.  Observación directa y cultivo: o Frotis nasofaríngeo. o Saliva. o Puntas de papel en la bolsa periodontal. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DEPENDIENTES DEL CULTIVO  Medio diferencial: se pueden observar dos bacterias diferentes.  Selectivos: un solo tipo de colonia.  En tubo: los microbios pueden cambiar su coloración, expulsar aerosoles, etc. MEDIOS CROMOGÉNICOS Sirven para identificar Candida y Pseudomonas. Contienen diferentes enzimas y cromógenos. ANÁLISIS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS FÁRMACOS Técnica de difusión con agar: poner discos con antibióticos después de haber inoculado la bacteria en el cultivo, de manera que 24 horas después se pueda ver una sensibilidad por parte de la bacteria si alrededor del disco no hay rastro de bacterias porque no hay crecimiento. Se requiere un aislamiento en un cultivo puro para determinar la sensibilidad a antimicrobianos. Técnicas de dilución con caldo: se basan en la concentración de antibiótico que se aplica para ver en qué momentos empieza a crecer la bacteria. 13 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS NO DEPENDIENTES DE CULTIVO  Detección de antígenos: trozos del microorganismo. o Aglutinación:  Staphylococcus aureus.  Listeria monocytogenes.  Neisseria meningitidis (A, B, C...).  Haemophilus influenzae (b).  Estreptococos beta hemoliticos (A, B...).  Salmonella ( O y H).  Shigella  Serología: detectar anticuerpos mediante: o Aglutinación. o Inmunofluorescencia:  Directa: antígeno.  Indirecta: anticuerpo.  Patógenos respiratorios.  ETS.  Parasitología.  Utiliza antígenos figurados o insolubles. o Enzimoinmunoensayo (ELISA):  Directa: antígeno (doble sandwich).  Indirecta: anticuerpo.  Uso de antígenos solubles. o Quimioluminiscencia (CLIA):  Utiliza sustratos luminiscentes (éster de acridino), en vez de cromogénicos como el EIA.  Mide emisión de luz.  Es ultrasensible (la más sensible de todas), ya que detecta la orden de 1 pg/ml (EIA 500 pg/ml).  Las reacciones de quimioluminiscencia CLIA se utilizan para la detección de anticuerpos. o Conceptos importantes:  Especificidad: capacidad de detección de una sola patología.  Sensibilidad: capacidad de detectar cantidades muy pequeñas.  VPP: probabilidad de que un individuo que de positivo tenga la enfermedad.  VPN: probabilidad de que un individuo que de negativo esté realmente sano. 14  o Después de la infección hay un período de incubación del virus, y cuando se asientan los síntomas el antígeno es detectado. A los 7 días, las IgM son las primeras inmunoglobulinas en aparecer (que acaban negativizando rápidamente), y después aparecen las IgG que no negativizan.  Pruebas cutáneas: estudio de la inmunidad celular.  Amplificación de ácidos nucleicos: PCR cualitativa o cuantitativa, y transcripción inversa. o En una PCR cuantitativa en suero, cuanto más largo sea el Ct (número de ciclos en que da positivo la fluorescencia), menos ADN hay en la muestra.  Nuevos métodos: o Proteómica: MALDI – TOF – MS. o Genómica: detección de 16s RNAr o técnicas de secuenciación (mediante una PCR del ADN de los microorganismos para obtener las secuencias de nucleótidos y estudiarlas). 15 TEMA 4: Vacunas y sueros. Las vacunas son sustancias biológicas que producen una respuesta inmunológica en la persona que las recibe con el objetivo de evitar una infección o disminuir su gravedad, compuestas de Ag o mezcla de Ag.  1796: Edward Jenner inyecta intradérmicamente pústulas de vaca con viruela vacuna y protege humanos.  100 años más tarde, Pasteur crea el terme vacunación y describe que se puede proteger mediante inoculación de microbios atenúate.  1885: primera vacunación contra la rabia. Los productos utilizados para inmunizar son sueros (que contienen anticuerpos de origen humano o animal), toxoides (vacuna con microbios activos) o vacunas. Un suero inmune es una preparación farmacéutica que contiene anticuerpos monoclonales de origen animal o humano contra el agente infeccioso frente al que queremos proteger. Se trata de productos para utilizar en situaciones de emergencia, es decir cuando existen indicios razonables de que un individuo no protegido ha podido contraer la enfermedad. Antes se inmunizaban animales para obtener su suero (ej. suero tetánico, caballos), pero podía provocar reacciones alérgicas a las proteínas séricas de caballo (no pasa con el uso de Ac monoclonales). INMUNIZACIÓN Una vacuna es un producto biológico que contiene antígenos y que se administra a un huésped para adquirir una inmunización activa y específica frente a un agente infeccioso esto se produce mediante la generación de una inmunidad humoral o celular por parte de la persona vacunada. Los antígenos pueden ser virus, bacterias, parásitos, pólenes, alimentos vegetales o sustancias inorgánicas, pero para las vacunas utilizaremos antígenos de agentes infecciosos. La respuesta inmunológica humoral o celular puede ser:  T dependiente: necesita la cooperación de los linfocitos T para generar anticuerpos. La mayoría de los antígenos utilizados en vacunación infantil suelen estar conjugados con proteínas que activan la respuesta de los linfocitos T por lo que son efectivas a edades inferiores a los dos años.  T independiente: genera anticuerpos en ausencia de linfocitos T. Suelen ser antígenos no conjugados y no son inmunógenos en menores de 18 o 24 meses tampoco generan memoria inmunológica. Los recién nacidos adquieren inmunidad pasiva natural a partir de los anticuerpos maternos transferidos a través de la placenta o de la leche materna. Como consecuencia, son inmunes a muchas enfermedades infecciosas comunes durante los primeros 6 meses de vida. No obstante, deben ser vacunados precozmente para que su propia inmunidad activa reemplace la inmunidad pasiva de origen materno cuando esta disminuye. 16 Una sola exposición a un antígeno no conduce a un título elevado de anticuerpos. Tras la inmunización inicial, se da una serie de reinmunizaciones (refuerzos) para producir una respuesta secundaria y un título elevado de anticuerpos. La introducción de vacunas eficaces en la población ha reducido la incidencia de enfermedades infantiles anteriormente epidémicas, como el sarampión, las paperas y la rubeola y ha eliminado por completo la viruela. La inmunidad colectiva se basa en el concepto de que las infecciones se propagan poco en poblaciones con una gran proporción de individuos inmunes. Por tanto, la vacunación es una herramienta importante en los programas de control de las enfermedades infecciosas. BASE DE LA RESPUESTA INMUNITARIA A LAS VACUNAS La inmunidad protectora inmediata es la respuesta a un antígeno vacunal y consiste en la producción rápida de anticuerpos que evitan o abortan la enfermedad y van disminuyendo con el tiempo. Paralelamente se estimula la infección con la producción de linfocitos memoria que persisten en el sistema inmunitario durante largos períodos de tiempo y que se activarán produciendo nuevos anticuerpos que evitarán la enfermedad si entramos de nuevo encontacto con el patógeno. COMPONENTES DE LAS VACUNAS ANTÍGENO Los antígenos pueden ser el propio virus o bacteria inactivado (microorganismo muerto) o atenuado (microorganismo vivo); o un componente purificado de los mismos. 17 En los últimos años se han desarrollado vacunas que utilizan material genético (ARN mensajero o ADN) que generan que las células produzcan un antígeno para inducir a la respuesta inmune. Finalmente, existen vacunas que utilizan vectores virales que no pueden producir la enfermedad y que transportan antígenos o material genético a las células humanas. ADYUVANTE Un adyuvante es cualquier sustancia que incrementa la respuesta inmunitaria frente a un antígeno al que se une, no forma uniones estables con el antígeno y son necesarios mmh. En la inmunización inicial actúan de 3 formas: 1. Formando un depósito con el antígeno en el lugar de la aplicación para liberarlo lentamente. 2. Presentando el antígeno a las células del sistema inmune. 3. Induciendo la secreción de citoquinas. Existen cuatro tipos de adyuvantes: 1. Sales de aluminio son las más utilizadas (fosfatos de aluminio e hidróxido de aluminio). 2. Adyuvantes tensoactivos saponinas inducen respuesta mediante linfocitos T. 3. Derivados de bacterias (principalmente bacterias gram negativas). 4. Liposomas esferas sintéticas de membrana lipídica. OTROS  Las proteínas transportadoras se unen a un antígeno no inmunógeno hapteno para convertirlo en inmunógeno.  Los excipientes se utilizan para conservar o estabilizar las vacunas, y pueden ser conservantes o estabilizantes.  Antibióticos: se utilizan para atenuar algunas vacunas como la neomicina o polimixina b para la vacuna de la gripe y la vacuna inactivada de polio; y estreptomicina para la vacuna inactivada de polio triple vírica y gripe. ANTICUERPOS MONOCLONALES Los anticuerpos monoclonales se basan en la utilización de la metodología diseñada por Köhler y Milstein (1975) basada en la fusión celular. Si se fusionan una célula de mieloma (que se multiplica sin control y es prácticamente inmortal) con un linfocito determinado (productor de un anticuerpo determinado) se obtienen células binucleadas que heredan las propiedades ambas células fusionadas, multiplicándose sin control, son inmortales y secretan anticuerpos monoclonales. Se usan células híbridas de bazo de rata. El uso de Ac monoclonales permite purificar Ag de una manera más fiable y efectiva. 18 TIPOS DE VACUNAS Las vacunas tienen que estar disponibles en cantidades suficientes, tienen que ser eficades a lo largo del tiempo de conservación y uso, y se tienen que administrar a al menos un 85 – 90% de los individuos en riesgo de contraer la enfermedad. Todavía no existe la vacuna de la hepatitis C.  Vacunas clásicas: tradicionalmente se habla de vacunas vivas y vacunas muertas. o Vacunas de agentes vivos atenuados (vacunas vivas):  Contienen microorganismos (agentes infecciosos) viabls en su composición, los cuales deben estar inactivados. Esta activación se consigue por pases sucesivos de cepas virulentas en condiciones de laboratorio.  Vacunas neumocócicas: antígenos de cápsulas de cepas patógenas de neumococo.  La inmunización con células o virus vivos suele ser más eficaz que material muerto o desactivado.  Las cepas atenuadas son aquellas en las que la cepa mutante de un patógeno ha perdido su virulencia pero conserva los Ag inmunizantes.  Muy efectivas, inmunizan durante largos períodos de tiempo, dosis única, conservación en frío. o Vacunas de agentes inactivados (vacunas muertas):  Se basan en preparados que incluyen o bien microbios completos muertos por agentes químicos, como fenol o formaldehído, o por agentes físicos, como el calor.  Inocuas, inmunizan durante periodos cortos de tiempo, multidosis generalmente, más caras, muy estables, no conservación en frío. o Productos modificados del agente  Vacunas modernas: reducen la composición de la vacuna de manera que solo incorpora los elementos estrictamente necesarios para la inducción de la inmunidad protectiva eficaz. Se basan en: o Ingeniería genética: permite clonar un gen, obtener un número ilimitado de copias y una cantidad prácticamente ilimitada de proteína (Ag). o Química de proteínas: síntesis de oligopéptidos artificiales de manera que por ingeniería genética podemos tener un Ag en grandes cantidades. o Hibridoma: línea celular híbrida obtenida mediante la fusión de un linfocito B productor del anticuerpo específico de interés, con una línea celular de mieloma que no produce una inmunoglobulina propia: cultivo celular y anticuerpos monoclonales. Con este tipo de vacunas se consigue mejorar la atenuación, reducir la posibilidad de reversión a virulencia y se pueden fundir antígenos produciendo vacunas homólogas o heterólogas dependiendo de si son de diferentes patógenos o no.  Vacunas de ADN: son plásmidos bacterianos que contienen DNA clonado con el gen del antígeno de interés y que normalmente se inyectan por vía intramuscular en el animal hospedador. Una vez que el plásmido es absorbido por las células del hospedador, el DNA se transcribe y traduce para producir proteínas inmunógenas que desencadenan una respuesta inmunitaria convencional, con células Tc, células Th1 y anticuerpos frente a la proteína codificada por el DNA clonado. No hay posibilidad de infección.  De toxoides. 19 No está dentro del calendario de vacunación VACUNAS DE TOXOIDES Muchas exotoxinas pueden modificarse químicamente para que mantengan su antigenicidad y no sean tóxicas: toxoide. Algunos toxoides, como los derivados de la exotoxina de C. tetani pueden administrarse con seguridad e inducen inmunidad protectora a largo plazo contra la exotoxina. La mayoría de las vacunas bacterianas se suministran como antígenos desactivados, como los toxoides que protegen contra el tétanos y la difteria. Inducen una protección mediada por anticuerpos sin exponer al riesgo de infección, pero las respuestas primaria y secundaria son un poco variables con cada vacuna e individuo, por lo que se requiere la revacunación periódica para establecer y mantener la inmunidad. Una vacuna acelular actual contra Bordetella pertussis (tosferina) se compone de la toxina pertussis (PT) desactivada y de la hemaglutinina filamentosa (FHA, del inglés filamentous hemagglutinin) de esta bacteria. EVOLUCIÓN DE LAS ENFERMEDADES PREVENIBLES Las inmunizaciones son el instrumento más clásico de la medicina preventiva para prevenir y controlar las enfermedades transmisibles. Las vacunas suponen junto con la potabilización del agua y los sistemas de saneamiento de residuos uno de los avances más importantes en la historia de la humanidad para mejorar nuestra salud y esperanza de vida Se estima que gracias a la vacunación sistémica se evitan cada año más de cuatro millones de muertes, se ahorra la pérdida de más de 400 millones de años de vida y se evitan más de 750000 casos de complicaciones médicas en niños. A pesar de estos datos en el siglo XXI mueren todavía 3 millones de niños cada año, la mayoría de ellos en países de renta baja, por enfermedades que en el resto del mundo se previenen fácilmente con vacunas. 20 CALENDARIO DE VACUNACIÓN POLIO – SARAMPIÓN – RUBEOLA 21 COVID – 19 Las vacunas virales se producen con virus que crecen en cultivos celulares, en embriones de aves, seres humanos y animales. NO medios artificiales. La vacunación suele ser el único método para controlar enfermedades causadas por virus.  ARNm: o Para codificar proteína S, se destruye en el citoplasma. o Comirnaty (Pfizer/BioNTech). o Spikevax (Moderna).  Vector viral: o El material genético que codifica para la proteína S se inocula en un virus inofensivo modificado, Vaxzevria. (AstraZeneca). o Vaccine Janssen. o Vacuna Ebola.  Vacunas recombinantes: o El material genético que codifica para la proteína S se inocula en un cultivo bacteriano, una levadura o un cultivo celular, se purifica y se combina con sustancias que aumentan su inmunogenicidad. o Novavax (Nuvaxovid). o Vacuna del Papiloma humano. 22 TEMA 5: La célula procariota y eucariota. Estructura y función. ESTRUCTURA CELULAR  Membrana citoplasmática: separa el exterior del interior celular. Contiene el citoplasma.  Pared celular: capa rígida por encima de la membrana citopasmática, aportando protección y rigidez. Es el esqueleto de la célula procariota.  Citoplasma: complicada mezcla de estructuras y sustancias. Aunque bioquímica y metabólicamente las células procariotas y eucariotas se parecen, presentan diferencias: Las células procariotas no tienen Glicocálix: permite el biofilm. ni membrana nuclear ni nucleolo, al contrario que las eucariotas. S: unidad de sedimentación. 23 MORFOLOGÍA DE LAS BACTERIAS TAMAÑO Foto con MEB – bacilos en una aguja: 24 FORMA  Esférica: cocos.  Allargada: o Bacilos: pueden tener esporas o no, lo que influye en su forma (bolas). o Espiral: vibriones, espirilas (rígidos) o espiroquetas (flexibles). En la boca podemos encontrar hifas (hongos unicelulares), miceli (hongos pluricelulares). DISPOSICIÓN  División de los cocos: se agrupan dependiendo de los planos de la fisíón binaria. o Diplococo: solo se divide en un plano. 2 células. o Estreptococos: continuación de diplococos. Agrupación en cadena. o Tetradas: se dividen en 2 planos. 4 células. o Sarcinas: se dividen en 3 planos. 8 células. o Racimos (estafilococos): crecimiento irregular de sarcinas. ESTRUCTURA DE LA PARED DE LAS BACTERIAS Alrededor de la bacteria se puede ver un halo transparente que no se tiñe de ningún color: cápsula. 25 CÉLULAS EN MICROSCOPÍA 26 ESTRUCTURA DE LA ORGANIZACIÓN PROCARIOTA 27 TEMA 6: Hongos. La micología es la rama de la microbiología que estudia los Hongos. Los hongos representan un papel importante en la degradación y reciclado de la materia orgánica muerta. La panificación o la fabricación de cerveza y vino son procesos basados en la acción de los hongos. Se conocen menos de 100 especies patógenas primarias humanas. La mayoría tienen un reservorio natural en el medio ambiente y la infección al hombre es un accidente, ya que acaba con su ciclo. Candida albicans es uno de los hongos patógenos más frecuentes. ESTRUCTURA DE LOS HONGOS Tienen membrana celular y pueden ser unicelulares o pluricelulares, al igual que los parásitos. PARED CELULAR Los hongos, en general, tienen una pared celular que es diferente al de las bacterias y las células vegetales. Es multilaminar, rígida y gruesa. Entre un 80 – 90% está compuesta de polisacáridos:  Quitina: es un polímero de N – acetilglucosamina (aminoazúcar). Se encuentra por encima de la membrana celular.  Celulosa: los patógenos generalmente no la contienen. Polímeros de beta – glc.  Glucanos: polímeros de glucosa.  Mananos: polímeros de manosa. Entre un 10 – 20% está compuesta de proteínas estructurales:  Manoproteínas: determinantes antigénicos. La composición química de la pared varía dependiendo de la especie, edad, o de factores externos como el pH o la temperatura del medio. Lo más constante es su estructura en capas, la presencia de quitina y la capacidad antigénica de los mananos. MEMBRANA CELULAR La membrana celular de los hongos es parecida a la membrana citoplasmática de las células eucariotas (glicoproteínas y fosfolípidos), solo que en vez de colesterol, contiene ergoesterol como principal esterol, lo que hace que sea una diana para muchos tratamientos con fármacos antifúngicos. Es una bicapa lipídica con el ergoesterol estabilizando la membrana.  Candida albicans.  Aspergillus fumigatus: hondo filamentoso.  Cryptococcus neoformans: levadura. 28 Estas membranas son siempre iguales, solo que con distinta distribución y algunas más laxas. OTRAS FORMACIONES Estructura típica de la célula eucariota, el citoplasma (protoplasma) contiene un núcleo (la mayoría de células fúngicas son multinucleadas), orgánulos celulares como RE, mitocondrias, AG, etc, y citoesqueleto. No tienen estructuras asociadas a la locomoción, es decir, ni flagelos ni cilios. Algunas especies presentan cápsula: cryptococcus neoformans. Con tinta china (tinción negativa afirmativa) se puede saber si el hongo tiene cápsula, ya que aparece un halo que no se tiñe. MORFOLOGÍA DE LOS HONGOS CUERPO El cuerpo de un hongo es lo que vemos en un cultivo macroscópicamente. El cuerpo también se puede denominar talo o micelio. El micelio es un conjunto de células que puede ser:  Vegetativo: sumergido en el medio de cultivo y es el encargado de lanutrición y crecimiento penetrando en los sustratos nutritivos. Puede ser unicelular, filamentoso o pseudofilamentoso.  De fructificación: en la superficie, aéreo, encargado de reproducción y propagación a distancia. Los hongos cuando infectan a un organismo no se pueden reproducir sexualmente, sino que lo hacen de manera asexual. Cuando están en el medio ambiente se pueden diferenciar sexualmente. 29 Los micelios vegetativos pueden ser:  Unicelulares: levaduras. Candida no tiene hifas verdaderas, no forman filamentos. Elavoración de vino y cerveza. Son anaerobias facultativas. Colonias mucoides. o Tienen forma ovalada, cilindrica o esférica, de medida variable (diámetro de entre 3 – 10 micras). o Tienen unos micelios pseudofilamentos / pseudohifas por gemación (unicelulares). Las células de las pseudohifas se estrehcan en los extremos. o Células blanquinosas, opacas y cremosas macroscópicamente.  Pluricelulares: filamentosos como los mohos y las setas: o Hifas: largos filamentos fúngicos constituidos por tubos cilíndricos de 0,5 – 12 micrómetros de diámetro. Pueden ser:  Aseptadas o cenocíticas (Rhizopus spp): no tienen septos, es decir, ninguna pared transversal que divida las diversas células que constituyen las hifas  Septadas (Aspergillus spp): son más comunes y presentan pared enetre las diferentes células, aunque los septos intercelulares poseen porors de abertura regulable, de manera que los citoplasmas contiguos están conectados. A partir de esporas fúngicas se produce el crecimiento de las hifas. o El micelio es el conjunto de hifas entrecruzadas y tiene un aspecto macroscópico algodonoso o polvoriento. Son masas de filamentos fúngicos. 30   Hongos dimórficos: dependiendo de la temperatura en la que vivan, pueden adoptar una forma uni o pluricelular. A 37ºC son unicelulares, mientras que cuando los tenemos en el medio ambiente o en el laboratorio, son pluricelulares. Son muy comunes en sudamérica: blastomicosis. o Tienen forma levaduriforme o filamentosa. o El dimorfismo depende de factores ambientales: temperatura, potencial redox, concentración de CO2, nutrientes. o Se adaptan morfológica y metabólicamente dependiendo del medio. o Tienen un papel importante en la patogenia. METABOLISMO DE LOS HONGOS Los hongos son quimioheterótrofos porque obtienen energía químicamente (quimio) y no son capaces de producir a partir de compuestos inorgánicos materia orgánica (hetero). El glucógeno es el material de reserva celular. Son capaces de metabolizar hidratos de carbono complejos hallados en papel de diario y madera. Los hongos son capaces de obtener carbono y nitrógeno de sustratos muy variados. Como no pueden endocitar macromoléculas, las digieren previamente mediante la liberación de exoenzimas al medio, transformándolas en pequeñas moléculas que pueden serabsorbidas. La mayor parte de los hongos crecen entre 0 – 30ºC con una temperatura óptima de crecimiento de entre 20 – 30ºC. Son organismos generalmente aerobios y a diferencia de las bacterias crecen mejor en medios ligeramente ácidos. Las levaduras son anaerobias facultativas, ya que pueden vivir tanto con oxígeno como sin oxígeno (fermentación). No necesitan la luz para crecer pero muchas especies la precisan para que sus estructuras reproductoras esporulen. Pueden ser:  Saprofitos: microorganismos que viven sobre materia orgánica muerta en descomposición.  Simbiontes: microorganismos que viven en asociación con otros organismos con ventajas mútuas.  Comensales: microorganismos que viven en asociación con otro organismo con ventajas para uno e indiferencia para el otro.  Parásitos: microorganismos que viven sobre o en el interior de un huésped, del cual obtienen ventajas. 31 REPRODUCCIÓN DE LOS HONGOS Reproducción asexual (infección): solo con mitosis, en la cual los cromosomas se dividen, repartiéndose el contenido citoplasmático y los cromosomas en cada una de las células hijas. Producción de numerosas nuevas formas, varias veces al año. Hongos imperfectos / deutericomicetos.  Fragmentación de las hifas: cada fragmento de hifa es un organismo nuevo. Artroconidias o artrosporas (desarrollo tálico, hongos filamentosos), Coccidioides immitis.  Fisión: la célula madre se divide en dos hijas por constricción y formación de pared celular. Levaduras.  Gemación: en la célula madre aparecen las yemas (células hijas) que aumentan de tamaño y se separan en blastoconidias o permanece unida formando pseudohifas (desarrollo blástico). Levaduras: Candida albicans.  Esporulación asexual: las esporas son células individualizadas que se desprenden con facilidad de las hifas especializadas que las sostienen para dispersarse aéreamente. Permite identificar los hongos: Mucor y Rhizopus ssp (esporangiosporas acumuladas en un esporangio), Penicillinum spp, Aspergillus ssp (conidiosporas). Hongos filamentosos. Las conidias son esporas externas libres de membrana. 32 Reproducción sexual (fase perfecta): con meiosis. Solo ocurre una vez al año. Hongos perfectos.  Esporulación: conidias, esporas. 33 CLASIFICACIÓN DE LOS HONGOS Según su reproducción:  Zygomicetos: hifas aseptadas, zigosporas.  Ascomicetos: hifas tabicadas, ascosporas.  Basidiomicetos: hifas tabicadas, basidiosporas.  Deuteromicetos: hongos imperfectos. PATOGENICIDAD  Micosis: superficiales (piel) o sistémica (cerebro, boca). Son enfermedades causadas por hongos.  Hipersensibilidad: rinitis, asma, dermatitis, etc.  Intoxicaciones: o Micotoxicosis: ergotismo y aflatoxinas (Aspergillus flavus). o Micetismo (Amanita phalloides). La composición antigénica de los hongos es compleja y varia según la estructura (levadura, hifa, espora) y el estado metabólico. La mayoría de los antígenos se hallan en la pared y son mananos y proteínas estructurales. En Aspergillus por ejemplo, se han identificado más de 52 fracciones antigénicas distintas mediante técnicas de precipitación. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO  Observación con el MO: utilizando tinciones con blanqueadores ópticos (blanco de calcoflúor); tinta china o plata.  Aislamiento por cultivo.  Serología: han sido muy estudiados los antígenos de Histoplasma, Coccidioides y otros.  Métodos moleculares. En el criptococo, el antígeno más estudiado es el capsular, polisacárido, cuya detección constituye un método diagnóstico de la infección. Los antígenos de los dermatofitos se utilizan en pruebas cutáneas para evaluar la respuesta celular inmune. Preparación de muestra con KOH: para disgregar las estructuras celulares y facilitar la visualización de hifas. 34 Preparación de muestra con blanco de calcoflúor: HONGOS DE INTERÉS EN ODONTOLOGÍA El hongo más frecuente en odontología es del género Candida.  Especies del género Candida: o C. albicans: da infecciones orales, genitales, cutáneas, etc. o C. guilliermondii: puede aparecer en la cavidad oral. o C. krusei: relativamente resistente. o C.parapsilosis: frecuente. o C. tropicalis: frecuente. o C. glabrata o C. lusitaneae: moco oral. o C. kefyr: interviene en la elaboración del kéfir. o C. dubliniensis: frecuente. Se encontró por primera vez en la boca de un paciente con SIDA.  Género Rhodotorula spp: sus colonias cuando crecen en un medio de cultivo crecen y producen un pigmento que microscópicamente se ve rosa. Son colonias mucosas y cuando se modifica su biología se van arrugando.  Género Geotrichum spp: poco frecuente en la boca.  Género Mucor spp: micosis.  Género Aspergillus.  Género criptococo: no se sabe si da patología oral o no. INFECCIONES ORALES PRODUCIDAS POR HONGOS  Candidiasis.  Histoplasmosis: producido por hongos dimórficos.  Blastomicosis: producido por hongos dimórficos.  Aspergilosis: Aspegillus fumigatus, hongo filamentoso. El aspergillus no es una levadura que podamos encontrar en la cavidad oral.  Peniculliosis.  Criptococosis: patología a nivel cerebral y sistémico, pero no está confirmado a nivel oral. 35 CANDIDIASIS ORAL Un 70% de los casos está causada por Candida albicans, un microorganismo oportunista. Este tipo de microorganismo está en nuestro cuerpo pero no induce patología si estás sano, solo cuando el sistema de defensa falla puede sobrecrecer y provocar la infección. Un patógeno primario es aquel que tiene suficiente poder patógeno como para inducir patología en un individuo sano. Factores predisponientes de candidiasis oral:  Locales: traumatismo, malaoclusión, tabaco.  Saliva: xerostomía, que disminuye la acción mecánica limpiadora, la química antifúngica de la lisozima y el pH.  Dieta: rica en hidratos de carbono, aumenta la adhesión y producción de ác carboxílicos, lo que causa irritación.  Infección: VIH, la manifestación más común es la oral, con casos de candidiasis oral por candida albicans: Pseudomembranosa, eritematosa o queilitis angular.  Edad: más frecuente en niños y ancianos (30% recién nacidos, 90% ancianos).  Alteraciones hormonales (diabetes) y nutricionales: alteraciones del epitelio oral.  Tomar antibióticos. La candidiasis oral puede tener diferentes formas clínicas:  Agudas: o Pseudomembranosa (muguet): forma clásica pero no la mas frecuente actualmente. Se asocia en casos de inmunosupresión avanzada y se encuentra en cualquier mucosa (lengua, paladar). Placas cremosas blancas o amarillas, algodonosas y semiadheridas (se desprenden fácilmente dejando un eritema y sangrado). La puede provocar diferentes spp. Se da principalmente en infantes. o Eritematosa (muy rojas) o atrófica: es una lesión oral en individuos con VIH + poco reconocida y también puede aparecer en casos de toma de antibióticos de amplio espectro o corticoides. Es plana, eritematosa en dorso, lengua y/opaladar (duro y blando), una depalpación (glositis romboidal) con punteado blanquecino. El síntoma principal es dolor o la quemazón. diabetes y enfermedad renal 36   Crónica: o Hiperplásica: se denomina leucoplasia candidiásica. Es una placa blanca elevada en la zona de la comisura firmemente adherida. Se puede asociar a una displasia (que representan el 15% de los casos), por lo que hay que hacer una biopsia. Si está en la lengua realizar un DD con leucoplasia biopsiando. o Atrófica: estomatitis asociada a prótesis removibles, dentaduras. No dolorosa. Biofilms bacteriofúngicos.  Tanto aguda como crónica: o Queilitis angular: no solo está provocada por cándida, sino también por bacterias (hacer diagnóstico diferencial). Se forma un eritema o fisuras con costra en la comisura labial, asociada o no a candidiasis eritematosa o pseudomembranosa. Provoca dolor, quemazón y escozor. A menudo es multifactorial, ya que puede ser una infección bacteriana y fúngica. Los factores predisponientes pueden ser déficits nutricionales de hierro, vitamina B2 o riboflavina. IMÁGENES 1. Imagen de biofilm de Candida albicans extraída de la saliva, donde se pueden ver las hifas y las formas redondas (levaduriformes). 2. Tinción de gram (GP): se ven las formas levaduriformes (blastosporas), pseudohifas (prolongaciones cortas que se estrechan en la unión a la células) e hifas verdaderas cuando candida se encuentra en los tejidos y a una concentración de oxígeno baja. 3. Coadhesión de las candidas y estreptococos orales. DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES POR CÁNDIDA 1. Coger muestra con un escobillón. 2. Tinción. La forma más efectiva de diagnosticar cándida es un oral rinse, hacer que el paciente se pase suero fisiológico por la boca con fuerza para obtener la muestra (sin haber estado en contacto con ningún colutorio). Para la candidiasis hiperplásica se necesita una biopsia. Se puede hacer análisis de sangre en glositis, forma hiperplásica y donde se sospeche que hayan déficits nutricionales. 37 IINFECCIONES FÚNGICAS POCO FRECUENTES  Aspergillosis: segunda infección fúngica más frecuente en humanos, afectando al pulmón pero se diseminan por la sangre (con trombosis e infartos), afectando a lossenos maxilares y provocando infecciones (y lesiones) en los tejidos blandos orales, dejándolos de color amarillo o negro (con necrosis). Se asocia a tratamientos con corticoides a dosis altas, trasplantes de órganos, enfermedades autoinmunes, tratamientos inmunosupresores, etc.  Cryptococcosis: afecta principalmente al pulmón y puede producir meningitis. Está provocada por Crytococcus neoformans (tiene cápsula), generalmente asociado a las deyecciones de palomas y otros pájaros. Se producen lesiones cutáneas en cara, cuello y cuero cabelludo; y las lesiones orales son raras: ulceraciones superficiales, granulomas, nódulos o lesiones ulceradas induradas (diferenciar de los carcinomas). Necrosis del huevo alveolar y palatino.  Histoplasmosis: está causada por Histoplasma capsulatum, frecuente en América. Tiene una forma pulmonar o mucocutánea (lesiones ulcerativas en lengua y mucosa bucal y palatina). Provoca lesiones orales como úlceras de larga evolución, que pueden ser dolorosas o no. Se suele confundir con úlceras neoplásicas, por lo que siempre es necesaria una biopsia.  Blastomicosis: sudamérica, causada por Blastomyces dermatitidis (dimórfico). Al inhalar las esporas se produce la infección respiratoria localizada o diseminada. Las lesiones orales son raras, aunque puede dar lesiones ulcerativas en la mucosa de la cavidad oral, que incluso pueden afectar a la piel de cara y cuello.  Mucormicosis: causada por un hongo saprofito de suelos, vegetación descompuesta, pan, etc. La afectació oral es secundaria a la de senos paranasales y cavidad nasal. Puede provocar necrosis palatina o ulceraciones y si se extiene a estructuras adyacentes causa necrosis tisular e invasión cerebral. Se da en receptores de trasplantes de órganos y diabéticos mal controlados. DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES FÚNGICAS ORALES PROFUNDAS  Biopsia.  Historia clínica: inmunosupresió.  Blastomycosis: microscopía / inmunodiagnóstico, PCR.  Criptococcosis: microscopía / tinción, serología.  Histoplasmosis: microscopía / tinción, serología, test cutáneo.  Mucormicosis: microscopia / histología / cultivo. 38 TEMA 7: Introducción a la parasitología. Un parásito es un ser vivo que pasa parte o toda su vida en interior o exterior de otro ser vivo de otra especie. Sensu latu (protozoos, helmintos, artrópodos y moluscos) / estricto. Las procariotas, virus y priones también se podrían considerar que parasitan. El parasitismo es un mecanismo de adaptación para la existencia. El parásito, menor, infecta al hospedador, habitando en su superficie o interior, obtienendo alimento y un entorno adecuado para el desarrollo y la multiplicación, causándole perjuicio (el parásito bien adaptado no destruye de forma rápida a su hospedador). Las poblaciones microbianas pueden vivir libremente o en simbiosis, la cual de da en microorganismos que viven juntos y puede tener una interacción:  Positiva: o Comensalismo: uno de los dos intervinientes obtiene un beneficio, mientras que el otro ni se perjudica y se beneficia. o Sinergismo: ambas poblaciones salen beneficiadas, son capaces de sobrevivir sin la presencia de la otra, pero juntas obtienenen ventajas mútuas. o Mutualismo: ambos salen beneficiados y mejoran su aptitud biológica (si ocurre entre miembros de la misma especie se denomina cooperación).  Negativa: o Competencia: por espacio o nutrientes. o Antagonismo: la presencia de un organismo impide la de otro, es la inhibición, deterioro o muerte de un microorganismo por acción de otro. o Predación: intervienen dos organismos, depredador y presa, y el primero caza, traga o digiere al otro. o Parasitismo: un parásito vive a expensas de otro microorganismo considerado hospedador, obteniendo de este último un beneficio y causándole daño. CONCEPTOS BÁSICOS  Inefstación: parásitos en la superficie corporal.  Protozoo: eucariota unicelular sin pared celular y que generalmente es móvil (solo 5% parásitos).  Helminto: eucariota multicelular que tiene tejidos diferenciados y órganos completos. La mayoría son de vida libre. 39 CLASIFICACIÓN DE PARÁSITOS  Endoparástios: dentro del cuerpo. Plasmodium, Giardia, tenias.  Ectoparásitos: fuera del cuerpo, pueden actuar como transmisores. Piojos, garrapatas.  Macro / microparásitos: generalmente los micro son protozoos y los macros helmintos.  Obligados: siempre tienen que parasitar y provocar enfermedad.  Facultativos.  Oportunistas: relacionados con una bajada en el sistema inmune. CICLOS  Monoxénico o directo: solo un hospedador.  Heteroxénico o indirecto: dos o más hospedadores. Los hospedadores definitivos son los que albergan los imagos (formas adultas de helmintos) o trofozoitos (formas activas de protozoos). El hospedador intermedio solo alberga formas juveniles. En el paludismo, el hospedador definitivo es el mosquito, mientras que los humanos solo somos el intermedio. RELACIONES HOSPEDADOR – PARÁSITO VÍA DE ENTRADA  Oral: quistes (formas de resistencia de los protozoos), huevos (helmintos, tenia), larvas que se encuentren en el agua o en alimentos.  Cutánea: o Activa: larvas de Ancylostoma, cercarias de Schistosoma. Son helmintos que pueden atravesar la piel intacta. o Pasiva: paludismo (un mosquito anopheles nos infecta). o Sin penetración (ectoparásitos).  Vaginal: Trichomonas. 40 MIGRACIÓN  Ingesta → luz intestinal.  Vía cutánea → sistema circulatorio o linfático (sangre o linfa) → órgano diana.  Áscaris: penetra por la pared intestinal después de ingerir los huevos → pasa a la sangre (vasos mesentéricos) → hígado → corazón → pulmón → alveolo → tráquea → esófago → estómago → intestino delgado donde se desarrolla (3 meses de proceso). ESPECIFICIDAD Y RESERVORIO  Especificidad: o Trichinella: cualquier mamífero, por lo que no es específica. o T. solium: específica de humanos.  Reservorio: es un animal que alberga la infección transmisible al hombre, siendo huésped definitivo o no. El perro puede ser reservorio de Leishmania. Dependiendo del hospedador:  Zoonosis: enfermedad que se produce en animales.  Antroponosis: enfermedad que se produce en humanos.  Antropozoonosis: enfermedad que se produce en animales y humanos. Un vector es un portador vivo (artrópodos, mosquitos) que transporta un patógeno de un hospedador infectado a otro (hembra Anopheles que transmite la malaria). PREVALENCIA MUNDIAL PARASITOSIS CLASIFICACIÓN Los protozoos son unicelulares, por lo que son protistas. Los helmintos son pluricelulares, de manera que forman parte del reino animal. Forma macroscópica Forma microscópica 41 PROTOZOOS No diferenciación sexual. a) Trypanosoma cruzi: enfermedad de Chagas. b) Toxoplasma Gondii: toxoplasmosis. HELMINTOS Algunos sí se diferencian sexualmente.  Redondos: nemátodos.  Planos: céstodos (tenia).  En forma de hoja: tremátodos. 42  TEMA 8: La cápsula bacteriana. Las bacterias se relacionan con el medio que les rodea a través de sus estructuras externas, la cápsula, la pared bacteriana y más internamente la membrana citoplasmática. La cápsula 8/10/24 también se denomina glicocáliz o llim. La cápsula es una estructura superficial prescindible, no es vital. No todas las bacterias la tienen y si la pierden pueden seguir viviendo, solo que tener (o expresar) la cápsula sí tiene consecuencias en la patogenecidad (virulencia) de la bacteria. Las capsula es una capa de aspecto gelatinoso que recubre toda la bacteria. Se encuentra inmediatamente al exterior de la capa mureïna (peptidoglucano) de las bacterias Gram+ o de la membrana externa (para sobre capa de lipolisacaridos) de bacterias Gram-. COMPOSICIÓN Mayoritariamente, las cápsulas están formadas por estructuras polisacarídicas, unos polímeros orgánicos depositados en el exterior celular. Siempre hay excepciones, como en el caso de Bacillus anthracis, que tiene una cápsula polipeptídica formada por una cadena de D – glutámico, un aminoácido en forma D (considerados no naturales). Estas estructuras polisacarídicas también se denominan exopolisacáridos (EPS), que se sintetizan a través de dos vías diferentes que responden a su diferente composición, el hecho de ser endógenas o exógenas tiene consecuencias en la composición de la cápsula:  Las cápsulas polisacarídicas de origen endógeno se sintetizan en el citosol (síntesis intracelular) y después son exportadas al exterior.  Las cápsulas polisacáridas de origen exógeno se sintetizan directamente en el exterior celular. Las bacterias solo presentan un tipo de cápsula, ya sea endógena o exógena, nunca ambas, y siempre que la presenten serán patógenas. CÁPSULAS ENDÓGENAS La cápsula endógena es heteropolisacarídica y está formada por diferentes polisacáridos como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, etc. La capacidad de sintetizar la cápsula viene determinada por la genética de la bacteria, es decir, los tipos de azúcares que se formen vienen determinados por los genes, no depende la presencia de nutrientes. Streptococcus pneumoniae: coco GP – pneumonía. La síntesis de este tipo de cápsulas tiene 2 etapas diferenciadas bioquímicamente: 1. Síntesis de los precursores que darán lugar a la futura cadena polisacarídica y la formación de la cápsula. Esta síntesis viene dada mediante procesos metabólicos de lapropia bacteria, no está influenciada por el medio y por lo tanto, no depende de tener azúcares a su disposición. 2. Los precursores son trasladados al exterior celular para ser ensamblados y formar la cápsula. CÁPSULA Y VIRULENCIA Frederick Griffith hizo las primeras observaciones sobre la virulencia de la cápsula y el fenómeno de la transformación mediante una serie de investigaciones sobre el modelo de infección de Streptococcus penumoniae. 43 La diferencia entre las cepas S y R de su experimento viene dada por la presencia de una cápsula endógena (heteropolisacarídica) de las S. Desmostró que cuando inoculaba ratones con cepas S (smooth) de Streptoccocus, estos morían por septicemia. Estas cepas son brillantes, lisas, muy mucosas y definidas. Después de que muriesen, les sacaba una muestra y resembraba continuamente en el laboratorio la misma colonia en condiciones óptimas, recuperando la cepa S. La cepa R (rough) no brilla y es rugosa, no tiene la capsula, y al inocularla en los ratones no morían. Puso en contacto cepas R con un extracto de cepas R inactivadas por calor, llevando el cultivo a ebullición y posteriormente inoculándolas en el ratón, que moría. Al recoger muestras solo habían cepas S, ya que la cepa R se transformó en la S (virulenta) por mutaciones al azar. CÁPSULAS EXÓGENAS La cápsula exógena es homopolisacarídica y está formada por la repetición de una misma molécula, ya sea glucosa, fructosa, etc. La formación de este tipo de cápsula viene determinado por la presencia o no del azúcar en el medio de crecimiento de la bacteria. Streptococcus mutans: coco CP – caries. Streptoccocus mutans: Para poder formar su cápsula necesita sacarosa en el medio de cultivo, que mediante la invertasa se hidroliza en glucosa, fructosa y energía Una vez tenemos los dos azúcares, la cápsula se puede sintetizar de dos formas según su composición:  Si la capsula está formada por glucosa, mediante la glucosil transferasa, produce la cápsula homopolisacárida,compuesta por una cadena de poli – glucosas, también conocidas como dextranos (son moléculas muy solubles, y tienen una gran estabilidad química), nombre que viene dado por el carácter dextrógiro de la glucosa. El resto restante de fructosa se puede incorporar a las vías metabólicas como nutriente para obtener energía.  También podemos tener la reacción contraria, donde el azúcar responsable de la cápsula será la fructosa, y por tanto en esta segunda opción la enzima responsable será la Fructosil transferasa. Esta enzima, de forma contraria a la primera, será el responsable de formar la cápsula homopolisacarídica de fructosas, mientras que el resto restante de glucosa se puede incorporar a las vías metabólicas como nutriente. 44 A partir de sacarosa  La fructosa se metaboliza y por fermentación acaba produciendo ácido láctico.  Cápsulas muy hidrofóbicas (muy insolubles) y se pueden utilizar como aceite lubricante.  Estas sustancias tienen una gran capacidad de adhesión a los dientes. O otras superficies como la hidroxiapatita Producción de caries: 1. Streptoccocus mutans se adhiere al sustrato, que es el diente, formando una microcolonia. 2. Con la presencia de sacarosa la bacteria forma su cápsula. 3. Aparición de caries por la producción de ácido láctico a partir de la fructosa, provocando la acidificación de la zona y por lo tanto, la eliminación o destrucción del esmalte del diente. Virulencia La cápsula es un factor de virulencia muy importante, ya que esconde los antígenos de superficie que acabarán provocando anticuerpos, de manera que las células del sistema inmune no los pueden reconocer y no se pueden generar Ac. (La cápsula evita el proceso de opsonización). Por otro lado, la cápsula es inmunógena (elemento antigénico) ya que el sistema inmunitario es capaz de generar anticuerpos en contra de cada una de las diferentes cápsulas, lo que es aprovechado por el diseño de vacunas. La prueba o reacción de Quellung es la reacción que identifica los diferentes tipos capsulares mediante la unión específica de los Ac con la cápsula. Ambos tipos capsulares son bioquímicamente distintos (endógenas / exógenas) y son un factor de virulencia muy importante. 45  OBSERVACIÓN DE LA CÁPSULA Macroscópicamente se puede ver si tienen cápsula porque se ven unas colonias más brillantes, grandes, lisas y mucosas, y por el tipo colonial se puede intuir. La cápsula es muy hidrofóbica y repele el agua, por lo que no acepta muchos colorantes. En la tinción invertida / negativa se puede observar la presencia de cápsula con un Microscopio óptico, ya que con tinta china se verá un fondo negro con puntos negros que se corresponden a las bacterias y un halo alrededor no teñido que representa la cápsula. Sin tinción Con microscopía electrónica de transmisión, que es una técnica compleja y de mayor resolución, también se pueden observar las características de la cápsula. Que como podemos ver puede tener unas dimensiones considerables respecto al total del tamaño de la bacteria ¿CUÁL ES LA COMPOSICIÓN DE LA CÁPSULA? La cápsula es generalmente polisacarídica (compuestas por azúcares), HOMOPOLISARÍDICA o HETEROPOLISARÍDICA. Existen también cápsulas polipeptídicas. ¿DÓNDE TIENE LUGAR LA SÍNTESIS DE LA CÁPSULA? La cápsula puede sintetizarse en el exterior celular (EXÓGENA) y depende de la presencia de un nutriente en el medio de cultivo o puede ser en el interior celular (ENDÓGENA) y dependerá del contenido genético. ¿QUÉ FUNCIÓN TIENE LA CÁPSULA? La cápsula tiene la función de esquivar el sistema inmune del huésped, escondiendo los antígenos de superficie de la bacteria. ¿ES UN FACTOR DE VIRULENCIA? Sí. Tal y como demostró F.Griffith, la presencia de la cápsula era letal para los ratones. ¿ES VITAL LA CÁPSULA? No, las bacterias pueden crecer sin necesidad de cápsula. ¿PODEMOS OBSERVAR LA CÁPSULA? Sí, por técnicas de microscopía óptica y una tinción negativa, o por técnicas más complejas de microscopía electrónica. 46 TEMA 9: La pared bacteriana. Tanto las células bacterianas como las células vegetales deben su forma y rigidez a la existencia de una pared celular. Existen dos modelos de pared bacteriana, la grampositiva y la gramnegativa, descritos por Christian Gram. Ambos tipos de paredes bacterianas contienen peptidoglicano y la principal diferencia entre ambas, es que la gramnegativa tiene una membrana lipídica externa y es asimétrica. La pared celular puede aislarse con relativa facilidad provocando una rotura celular por ultrasonidos o ciclos de congelación descongelación, u otro método de disrupción celular. Cuando un cultivo en el que se ha destruido la integridad celular se somete a centrifugación, aparece un sedimento blanquecino que mayoritariamente se compone de paredes celulares y materiales unidos a la pared. PEPTIDOGLICANO La forma de la bacteria depende de la pared bacteriana, exactamente del peptidoglicano, dando formas esféricas (cocos), alargadas (bacilos) y vibriones (espiroquetas y espirilas). Salton realizó en el siglo pasado una serie de experimentos para demostrar la importancia de la pared bacteriana:  Puso en contacto lágrimas con bacterias bacilares y observó una pérdida de la forma, transformándose en bacterias osmosensibles Protoplastos.  Los cambios de presión osmótica provocaban la lisis de las bacterias.  El responsable del cambio de forma es la lisozima, una enzima que actúa lisando la pared bacteriana rompiendo los puentes que unen los aminoazúcares. La pared bacteriana es la encargada de mantener y resistir la presión osmótica, y en función de si son GP o GN la capacidad de resistencia varía: cuanto más peptidoglicano más resistencia a la presión.  GramPositivo – 20 atm de presión entre el interior y el exterior.  GramNegtivo – diferencia de presiones de 2,5 – 3,5 atm. COMPOSICIÓN DE LA PARED BACTERIANA Salton realizó análisis químicos de los componentes (o presuntos componentes) de la pared celular y rápidamente observó que los componentes mayoritarios de esta estructura eran azúcares y aminoácidos, aunque también detectó la presencia de lípidos. Con estudios posteriores se fue demostrando que la pared bacteriana es una estructura altamente conservada y aunque es muy compleja, está formada por pocos componentes: 2 azúcares y 3 – 4 aa’s. 47 Al someter la bacteria a la acción de sustancias que impiden la formación de la pared (lisozima, posteriormente penicilina) se vio que estaba formada por:  N – acetilglucosamina: azúcar.  N – acetilmurámico: aminoazúcar que sólo se encuentra en la pared.  Péptidos: L – alanina, D – glutamato, L – lisina, D – alanina. Los D aminoácidos no se encuentran normalmente formando parte de las proteínas porque son aa no naturales. En algunas especies bacterianas la lisina está sustituida por un aminoácido que es característico de algunas paredes celulares denominado ácido diaminopimélico (DAP). La pared es una estructura hidrofílica, permeable (permite el intercambio de nutrientes y diversas moléculas) y no es una barrera de permeabilidad. Puede llegar a un 90% de la biomasa de la bacteria. * FUNCIONES DE LA PARED BACTERIANA  Dar y mantener la forma bacteriana.  Proteger de las diferencias de presión osmótica entre el citoplasma y el exterior.  Soporte para los apéndices responsables del movimiento.  Estructura indispensable para la bacteria, ya que sin esta estructura es más sensible a los cambios de presión y se puede hinchar / deshinchar. Porque no es bi-lipidica, sino que solo tiene una capa lipídica. La pared bacteriana es una diana para los antibióticos. SÍNTESIS DE LA PARED BACTERIANA CONSIDERACIONES GENERALES  Las paredes están constituidas por dos tipos de polímeros. Uno está formado por unidades glucídicas y el otro similar a las proteínas.  La porción glucídica consta de largas cadenas de N – acetilglucosamina y N – acetilmurámico unidas entre sí por enlaces ß (1 – 4).  La pared es insoluble en agua, es resistente a muchos enzimas particularmente a los enzimas proteolíticos como la tripsina o la pepsina. Esta resistencia a los enzimas podía ser debida a la especial configuración de los aminoácidos (formas d) o a sus enlaces, pero obviamente cumple una función de protección muy importante de las bacterias frente a estos enzimas. FASES DE SÍNTESIS DE LA PARED BACTERIANA Los trabajos de Park y Strominger utilizando Staphylococcus aureus fueron determinantes en el establecimiento de la naturaleza del peptidoglicano. Cuando S. aureus crece a concentraciones subletales de penicilina se producen distintas moléculas de las cuales la más compleja se conoce en la actualidad con el nombre de nucleótido de Park y parece ser la unidad estructural del peptidoglicano. 48 FASE CITOSÓLICA Consiste en un ensamblaje secuencial del nucleótido de Park para formar los precursores necesarios para establecer la pared. Es un proceso catalizado por enzimas citoplasmáticos. 1. A partir de una fructosa 6 – fosfato, que es un metabolito intermediario de las vías de degradación de los azúcares, se produce glucosamina 6 – fosfato al reaccionar con una glutamina que se convierte en ácido glutámico. 2. Posteriormente la glucosamina 6 – fosfato se acetila originando UDP N – acetilglucosamina – 6 – fosfato. 3. El grupo fosfato cambia de posición originándose una UDP N – acetilglucosamina – 1 – fosfato que ya se encuentra en condiciones de incorporarse al peptidoglicano. 4. Se incorpora un grupo octil a la UDP N – acetilglucosamina, de manera que se genera el UDP N – acetilmurámico. 5. El primer aa que se incorpora es la L – alanina con consumo de ATP. 6. Esta reacción de ir añadiendo aminoácidos con consumo de ATP se produce hasta 4 veces, de manera que se van uniendo el D – glutámico, la L – lisina (DAP), la L – alanina y por último dos D – alaninas. Estos 5 aa forman un pentapéptido. FASE DE LA MEMBRANA CITOPLASMÁTICA Consiste en un transporte de la subunidad formada en la etapa anterior desde el citoplasma al exterior celular, basado en una transferencia desde el UDP a un constituyente lipídico de la membrana celular. El bactoprenol es un eficiente transportador de azúcar a través de la membrana. Tiene la capacidad de desplazar el uridin difosfato (UDP). 1. Se libera un UMP y se genera el N – acetilmurámico con el pentapéptido, unido por un enlace pirofosfato con el bactoprenol. Esta es la molécula que inicia el proceso de exportación. 2. Se incorpora la N – acetilglucosamina a la molécula anterior. * En este punto, si la bacteria es grampositiva se incorporarán 5 glicinas, que le dan resistencia a la membrana para aguantar mejor la presión osmótica. Estas 5 glicinas (Gly), mediante 5RNAt, se unen a la amina libre de la Lys (DAP). 49  3. La molécula completa se puede separar del bactoprenol para poder originar un bactoprenol fosfato nuevo que vuelva a comenzar el ciclo porque es limitado y hay que recuperarlo para que continúe realizando su función. (Bactoprenol fosforila en el dentro de la membrana y el peptidoglicano sintasa ayuda a pasar a la fuera de la membrana). FASE DEL EXTERIOR CELULAR Consiste en la transferencia de la subunidad completa a la zona de crecimiento de la pared, gracias a que unas enzimas ensamblan diferentes unidades para formarla.  Transglicosilasa: forma enlaces ß (1 – 4) entre los azúcares para alargar el peptidoglicano.  La carboxipeptidasa rompe el enlace entre las dos dialaninas terminales y la transpeptidasa transfiere esta energía de enlace, de modo que la última dialanina se engancha a la última glicocola que procede de la lisina (DAP) del canal de al lado. 50 INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE LA PARED Los beta – lactámicos inhiben las transpeptidasas. La transpeptidación es la formación de los puentes interpeptídicos, de manera que estos antibióticos evitan la formación de los enlaces peptídicos. Actúan en la superficie de la célula. * Ejemplos de mecanismos de resistencia: Inactivación o hidrolisis enzimática del antibiótico. Beta-lactamasas en el caso de beta-lactámicos, en gramnegativo.  Penicilinas: amoxicilina, ampicilina. o Los productos que se acumulan bajo la influencia de la penicilina no son otros que los intermediarios en la síntesis de la pared celular o peptidoglicano. La penicilina sólo actúa sobre bacterias que se encuentran creciendo activamente y es totalmente atóxica para organismos superiores que carecen de paredes bacterianas.  Cefalosporinas: cefmetazol.  Carbapenems: imipenem.  Monobactámicos: aztreonam. Los glicopéptidos inhiben las transglicosilasas, que están implicadas en el alargamiento del peptidoglicano, de manera que evitan la formación de los enlaces ß (1 – 4) entre los azúcares. Espectro de acción reducida (G+). Actúan en la superficie de la célula.  Vancomicina.  Teicoplanina. PBP= Penicilin Binding Protein Lipoglucopéptidos:  Daptomicina.  Dalvavancina.  Oritavancina  Telavancina CLASIFICACIÓN GRAM El microbiólogo danés Christian Gram definió la Tinción de Gram el año 1884, el primer método utilizado en diagnóstico para la detección de microorganismos porque es efectiva y rápida. No cambió nada desde su descubrimiento. Es una tinción diferencial, en la que utilizamos un colorante primario y otro de contraste. Observó que diferentes bacterias se teñían de diferente manera. TINCIÓN DE GRAM 1. Fijación de bacterias en el portaobjeto. 2. Colorante primario: Añadimos cristal violeta, que se une al peptidoglicano. 3. Añadimos el Lugol, un mordiente para fijar el cristal violeta. 4. Decolorar mediante alcohol – acetona. Las bacterias GN en este momento pierden la coloración violeta porque existe una membrana externa lipídica por encima del peptidoglicano, de manera que no aceptaron el cristal violeta. 5. Añadimos el colorante de contraste, la safranina, para acabar de teñir las bacterias gramnegativas de color rojo / rosa. 51 Información que proporciona un gram:  Tipo de pared que tenemos.  Forma de las bacterias: o Bacilos gramnegativos. o Cocos grampositivos.  Disposición general de las bacterias (agrupaciones o no). MODELO DE PARED GRAMPOSITIVA La pared bacteriana de los GP mide aproximadamente 80 nm y el componente mayoritario y prácticamente único es el peptidoglicano, de manera que son considerablemente más simples que las gramnegativas. Las bacterias con este tipo de pared se tiñen de violeta por el cristal violeta.  Membrana citoplasmática: presenta mayor cantidad de proteínas porque las bacterias no tienen orgánulos internos para realizar diferentes funciones, así que todas las enzimas se encuentran en la membrana. Es una bicapa lipídica con proteínas (70%).  Peptidoglicano: componente mayoritario de la pared.  Los ácidos tecoicos son repeticiones de polialcoholes glicerol fosfato y ribitol fosfato y están unidos al peptidoglicano o directamente a la membrana citoplasmática (lipotecoicos), estos últimos con papel de fijación de la pared a la membrana y adhesión a las células eucariotas, principalmente epiteliales. Las subunidades de estos ácidos se unen a restos libres de N – acetil murámico. En ocasiones se proyectan al exterior, y como la capa del peptidoglicano con los ácidos tecoicos es hidrofílica, los nutrientes atravesarán con facilidad este nivel. Funciones: o Adhesión bacteriana en el sitio de infección. o Inmunogenicidad. o Antigenecidad. La pared de las bacterias GP no presenta ninguna barrera de permeabilidad a los antimicrobianos, es hidrofílica y permite la entrada de diferentes solutos y nutrientes. Tiene una malla muy gruesa y bien estructurada. Esta permeabilidad hace que los GP tengan tendencia a expresar factores de virulencia en forma de toxinas, sintetizadas en el interior y secretadas al exterior. Debido a esta permeabilidad “a priori” hace que las bacterias Gram positivas sean más sensibles a los antibióticos Modelo de infección de los GP:  Tétanos: neurotoxina. Toxina tetánica  Difteria: toxina difterica. 52 Como solo tiene la membrana citoplasmática y el peptidoglicano permeable, en general suelen ser más sensibles a los antibióticos, se tratan mejor, ya que no existen problemas de permeabilidad. Excepciones:  Hay un grupo especial de GP que en vez de ácidos tecoicos tienen ácidos micólicos, que hace que las paredes bacterianas sean muy hidrofóbicas y por lo tanto más impermeables, ya que forman una capa serosa. Son importantes para la taxonomía de Mycobacterium, por ejemplo. Cada una de las especies tienen un ácido micólico diferente, lo que permite clasificarlos. La única región hidrofóbica que presentan las envolturas de las bacterias GP es la membrana citoplasmática. Sin embargo, debemos tener en cuenta que las membranas citoplasmáticas por su cara interna contactan directamente con el citoplasma, por lo tanto en esta región se dispone de energía biológica, lo que facilita en gran medida que los compuestos puedan incorporarse al interior de la bacteria por procedimientos de transporte con consumo de energía (en contra de gradiente). MODELO DE PARED GRAMNEGATIVA En las paredes de los GN tenemos tres niveles: una membrana externa lipídica y asimétrica, por encima de una pequeña cantidad de peptidoglicano y de una membrana citoplasmática. Carecen de ácidos tecoicos. Membrana externa: la cara interior de la membrana está formada por fosfolípidos, que se parece a los de la membrana citoplasmática. Y en la cara exterior tiene lípidos diferentes, se llama lipopolisacárido (este formado por azúcar y lípido). Cuando ponemos la membrana externa en contacto con el alcohol, desaparece, y con ella el poco cristal violeta que se pudo haber quedado, de manera que sólo se tiñen con la safranina. El peptidoglicano es menos abundante tanto cualitativa como cuantitativamente. Los enlaces transversales no están formados por las cadenas de 5 glicinas, sino que se unen directamente algunas alaninas terminales con el DAP (diaminoácido). Los lípidos exteriores tienen incorporadas unas proteínas llamadas porinas para la entrada de nutrientes, porque como tiene MB externa y peptidoglicano, las paredes son menos permeables. La membrana citoplasmática de las bacterias GN se denomina membrana interna y es funcional y estructuralmente idéntica a la de las GP. Tiene dominio hidrofóbico (interior) pero los solutos pueden atravesarla debido a la energia asequible. Por encima de la membrana interna se encuentra el peptidoglicano, un nivel totalmente hidrofílico. 53 La membrana externa es una bicapa lipídica asimétrica formada por lipopolisacárido (un núcleo de azúcares y una cadena de lípidos (fosfolípidos)):  Tiene un dominio hidrofóbico (parte interna) pero no hay energía biológica disponible (no ATP) porque está lejos del citoplasma.  Tiene una gran cantidad de proteínas pero a diferencia de la membrana interna, su diversidad es mucho menor, es decir, hay muchas copias de la misma proteína en esta membrana.  Desde el punto de vista funcional cabe entender esta membrana como una barrera real de permeabilidad a los nutrientes, a los antibióticos y a los tóxicos en general, pero también a los productos de secreción de la propia bacteria (productos metabólicos). o Los antibióticos pueden penetrar por vía lipídica o hidrofílica (canales, porinas) y una vez en el interior, debe encontrar su punto de acción, que en el caso de los beta – lactámicos son las PBPs. La acción del antibiótico provocará la biosíntesis de peptidoglicanos deficientes que conducirán a la lisis bacteriana.  Lipopolisacáridos: se encuentran en la cara externa y confieren personalidad a la membrana. La membrana externa no presenta flip – flop de fosfolípidos. o Lípido unido a una cadena de azúcares. o Core: prescindible. La característica más sobresaliente de este fragmento es la presencia de heptosas que son muy inusuales (normalmente los azúcares son hexosas o pentosas) otro componente singular es el KDO o ácido desoxioctanoico que es exclusivo de esta estructura. De aquí se proyectan cadenas laterales de polisacáricos que constituyen el antígeno 0. o Antígeno 0: no siempre es constante. La variabilidad en el antígeno 0 provoca anticuerpos para cada uno de los antígenos. o Constituyen una endotoxina. No es tóxica cuando forma parte de la membrana externa (lípido A de la cara interna), pero cuando sale de las bacterias se vuelve tóxico, provocando un shock tóxico irreversible si llega a sangre y se encuentra en grandes cantidades. Muy toxico cuando la bacteria es lisa y se encuentra sola. o En la enfermedad periodontal el LPS de las bacterias GN que intervienen es un eficiente efector del proceso de inflamación que tiene como consecuencia el daño tisular la pérdida de masa y la edentación subsiguiente. o Reacción de Herxheimeimer: cuando trataba los pacientes con sífilis y les daba antibióticos, inicialmente el paciente empeoraba porque mataban las bacterias, dejando expuesto el lipopolisacárido. 54  Porinas: canales transmembrana que dejan pasar moléculas de forma inespecífica, es decir, sirven de puerta para sustratos con características de tamaño y carga que puedan pasar por el canal. Se encuentran en todos los GN y algunos GP (Mycobacterium). Mayormente inespecíficas: difusión de moléculas hidrofílicas. o Algunas porinas son específicas de transporte de fosfato. o Tienen alfa hélices que se proyectan hacia el exterior. Esta es la parte inmunógena. Se consideran antígenos de superficie de las bacterias. Para prevenir infecciones, se están creando vacunas en contra de los antígenos de superficie, pero presentan problemas, ya que las bacterias pueden tener cápsula y encima las bacterias se pueden volver resistentes a estas vacunas. o Permiten la difusión de moléculas hidrofílicas. o 14 segmentos transmembrana con la láminas beta en el centro (beta – barrel) que son los que realmente forman el canal; y hélices alfa en el exterior. o Proteínas triméricas, aunque existen monoméricas. o Beta lactámicos (antibióticos que actúan sobre el peptidoglicano): - El antibiótico puede atravesar la porina actuando en la diana y matando la bacteria. Para que no pase esto, las porinas que puedan dejar pasar antibióticos no se expresan, convirtiéndose en resistente. Las proteínas están implicadas en los mecanismos de resistencia de las bacterias a los antibióticos.  Proteínas de transporte: para el transporte pasivo o difusión facilitada pero nunca hay transporte activo (ATP) porque la energía se confina en el citoplasma. El consumo de energía se da en la MB interna.  Como es una membrana lipídica, aumentará la impermeabilidad.  La colistina es un péptido antimicrobiano que produce una desestructuración de la membrana porque tiene cargas positivas, mientras que la membrana negativas. Son catiónicos y su mecanismo es disrupción de membrana y formación de poros. Se forma un poro (gracias a los péptidos) para habilitar la función de otro antibiótico.  Todas las bacterias Gramnegativas tienen porinas y también algunas Grampositivas, las que presentan una fuerte hidrofobicidad en su superficie en general están presentes en las micobacterias y bacterias relacionadas como Gordonia, Tsukamurella etc. 55 ¿CUÁL ES LA COMPOSICIÓN DEL PEPTIDOGLICANO? Es una estructura propia de las bacterias. Y los componentes principales del peptidoglica: 1- N acetil-glucosamida 2- N acetil-murámico (Sólo lo encontraremos en la pared) 3- Péptidos: L-Alanina, D-glutamato, L-lysina, D-Alanina. Los D aminoácidos no se encuentran normalmente formando parte de las proteínas ¿DÓNDE TIENE LUGAR LA SÍNTESIS? La síntesis del peptidoglicano se da en tres localizaciones distintas. 1. En el citoplasma 2. En la membrana citoplasmática 3. En el exterior de la célula bacteriana ¿CUÁLES SON LAS FUNCIONES PRINCPALES? 1. Dar y mantener la forma bacteriana 2. Proteger de las diferencias de la presión osmótica entre el citoplasma y el exterior ¿ES UN FACTOR DE VIRULENCIA? NO. El peptidoglucano no es en factor de virulencia ¿ES UNA ESTRUCTURA VITAL? Sí. Sin el peptidoglucano la bacteria se vería expuesto a cambios de presión osmótica del ambiente ¿PODEMOS INHIBIR LA SÍNTESIS DEL PEPTIDOGLUCÁN? Sí, existen varios antibióticos que pueden actuar inhibiendo la síntesis del peptidoglucano a diferentes niveles Los antibióticos más importantes son el BETA-LACTAMICOS, y los GLUCOPETIDOS 56 TEMA 10: Membrana citoplasmática y citoplasma bacteriano. MEMBRANA CITOPLASMÁTICA PROCARIOTA DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS La composición de la membrana citoplasmática es muy similar, ya que ambas contienen fosfolípidos:  Los ácidos grasos de la membrana procariota son saturados o monoinsaturados (ninguno o solo un enlace doble), excepto algunas bacterias que realizan fotosíntesis. Contienen hopanoides, que realizan la misma función que el colesterol en las membranas eucariotas, estabilizar, dar equilibrio y rigidez a la membrana.  La membrana plasmática de las células eucarioras la componen ácidos grasos poliinsaturados, con más de un enlace doble. Contienen colesterol / ergoesterol. En una célula eucariota las distintas funciones residen en orgánulos distintos. En general las funciones tienen lugar sobre el soporte físico de una membrana, por lo tanto los equipos enzimáticos encargados de los distintos procesos residen en cada una de las membranas de cada uno de los orgánulos. En las bacterias sólo esta presente la membrana citoplasmática y por tanto todas esas funciones se desarrollan sobre el soporte de dicha membrana, así que todas las enzimas encargadas de funciones se encuentran en la membrana plasmática. En la membrana citoplasmática procariota hay unas proteínas que tienen un papel clave en muchos procesos bioquímicos y pueden llegar a representar un 70% de la membrana (mayor concentración de proteínas que eucariotas). En este caso la membrana juega un papel central en el metabolismo energético, ya que las cadenas de transporte de electrones se encuentran aquí. En el caso de las eucariotas, el metabolismo se realiza en las mitocondrias. Existen excepciones como el caso de los micoplasmas, que son bacterias cuya membrana contiene ergoesterol porque no tienen pared celular, de modo que lo necesitan para estabilizar la membrana. En los procariotas no existe ruta de síntesis de esteroles, por lo que son exógenos. La membrana procariota es más selectiva de permeabilidad que la membrana eucariota, ya que no pueden entrar proteínas de alto peso molecular porque no reali