Temas 6 y 7. Métodos invasivos de investigación fisiológica y Tecnicas de investigación basica en el laboratorio.pptx

Psicofisiología Módulo II: Métodos de estudio del Sistema Nervioso Tema 6: Métodos lesivos de investigación fisiológica y Tema 7. Métodos de investigación farmacológica y de ingeniería 1 Índice 1. Técnicas de supresión de actividad 2. Técnicas de estimulación 2 Cirugía ESTEREOTÁXICA • Estereo...

Psicofisiología Módulo II: Métodos de estudio del Sistema Nervioso Tema 6: Métodos lesivos de investigación fisiológica y Tema 7. Métodos de investigación farmacológica y de ingeniería 1 Índice 1. Técnicas de supresión de actividad 2. Técnicas de estimulación 2 Cirugía ESTEREOTÁXICA • Estereotáxico: – Dispositivo mecánico que inmoviliza totalmente la cabeza de un animal anestesiado, permitiendo manipular con gran precisión, hasta décimas de mm., cualquier punto del S.N.C. • Atlas estereotáxico: – Mapa tridimensional del cerebro. 3 4 1. Técnicas de Supresión de Actividad • Inactivación, temporal o permanente, de una zona del cerebro. • Observación de los déficits comportamentales que aparecen. • A partir de éstos se infiere la función de la estructura lesionada. 5 Técnicas de Supresión de Actividad – Lesiones por corriente eléctrica – Lesiones mecánicas – Lesiones químicas – Lesiones mediante enfriamiento 6 Lesiones por corriente eléctrica • Pueden ser de dos tipos: L. electrolíticas, producidas por el paso de una corriente continua, o L. por radiofrecuencia debidas al paso de una corriente alterna de muy alta frecuencia a través de un electrodo implantado estereotáxicamente. El paso de la corriente a través del cerebro genera calor y destruye los tejidos próximos al extremo del electrodo. • Ambos tipos de lesiones presentan los mismos inconvenientes: – Destruye cuerpos y fibras celulares – Mayor lesión de la deseada. 7 Lesiones Mecánicas • Electrocauterizac ión • Aspiración • Ablación • Sección: – Central – Periférica. 8 Lesiones Químicas • Administración, a través de una cánula implantada en el cerebro, de sustancias neurotóxicas que dañan el tejido cerebral. • Ventajas: – Pueden ser selectivas: lesionar sólo cuerpos neuronales o bien fibras nerviosas – Pueden ser reversibles o no. 9 Lesiones por Enfriamiento • Exposición de una zona cerebral a una temperatura inferior a 25º C. • Se produce una inhibición temporal de la función neuronal. 10 2. Técnicas de Estimulación • Pretende reproducir la función de la región estimulada activando específicamente dicha región anatómica. • Técnicas de estimulación: – E. eléctrica – E. química 11 Estimulación Eléctrica • Equipo de estimulación: – Generador de estímulos (fuente de energía y manipulador). – Osciloscopio o monitor. • Parámetros de la estimulación: – Duración del pulso: generalmente 0,1 ms. – Frecuencia: 60-100 c.p.s. – Voltaje. – Forma del pulso: corriente continua. • Forma de aplicación: – Crónica (produce tolerancia). – Intermitente (produce sensibilización). 12 Estimulación Eléctrica • Ventajas: – Colocación precisa del electrodo. – Permite manipular los parámetro de la corriente. – Puede usarse control remoto. • Inconvenientes: – Despolarización indiscriminada de un amplio conjunto de células. 13 Estimulación Química • Administración de sustancias neuroactivas. • Vías de Administración – Intracerebral: • Intraventricular • Sobre tejido nervioso cerebral – Periféricamente: • Oral • Intravisceral • Intravenosa • Intraperitoneal • Intramuscular • Subcutánea • ... 14 Estimulación Química • Ventajas: – Estimulación selectiva. – Efectos reversibles. • Inconvenientes: – Imposibilidad de conexión/desconexión repetida. – Menor control de la duración del estímulo. • Se tiene que conocer: – Concentración del fármaco (mg/c.c.). – Dosis (mg/ Kg de peso). 15 Tema 7. Métodos de investigación farmacológica y de ingeniería genética Investigación en laboratorio principalmente con sujetos animales 16 1. Métodos de investigación farmacológica 1.1. Medida de la actividad química del encéfalo - Técnica de 2-desoxiglucosa + Autorradiografía - Diálisis cerebral 1.2. Conectividad: Trazado de conexiones neurales 1.3. Localización de neurotransmisores y receptores en el encéfalo - Inmunocitoquímica - Hibridación in situ 2. Ingeniería genética 2.1. Técnicas de supresión de genes 2.2. Técnicas de sustitución de genes 17 1.1. Medida de la actividad química del encéfalo: Técnica de 2-desoxiglucosa + Autorradiografía •Situar a un animal al que se le ha inyectado 2-DG radioactiva en una situación experimental en la cual se dedica a la conducta que interesa estudiar •Después se le sacrifica y se extrae y secciona su encéfalo. Las secciones son sometidas entonces a una Autorradiografía. 18 1.1. Medida de la actividad química del encéfalo: Diálisis cerebral Cráne o Cemen to dental Cerebro Tubo de diálisis 19 1.2. Conectividad Trazado de conexiones neurales: – Vías que se originan en una estructura cerebral (transporte anterógrado): autorradiografía de aminoácido – Vías que van a una estructura cerebral (transporte retrógrado): técnica de la peroxidasa de rábano 20 AUTORRADIOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS Estructura A 2. El a.a. es captado e incorporado a las nuevas proteínas de síntesis 3. Las proteínas radiactivas son transportadas por flujo axoplasmático Estructura B 1. Se inyecta a.a. radiactivo 4. Las proteínas radiactivas entran en los botones terminales 21 TÉCNICA DE LA PEROXIDASA DEL RÁBANO (HRP) Estructura A 3. La HRP es transportada por transporte axoplásmico retrógrado. 2. La HRP es captada por los botones terminales Estructura B 4. Un tinte muestra el destino de la HRP 1. Se inyecta (HRP) peroxidasa de rábano 22 1.3. Localización de neurotransmisores y receptores en el encéfalo: Inmunocitoquímica • • Los neuroquímicos han fabricado reservas de anticuerpos frente a la mayoría de los péptidos neurotransmisores y receptores cerebrales. La Inmunocitoquímica es un procedimiento para localizar determinadas neuroproteínas en el encéfalo, marcando sus anticuerpos con una tinción o radioactivamente y exponiendo luego las secciones cerebrales a esos anticuerpos marcados. Las regiones cerebrales donde se acumulen señala la localización de la neuroproteína que se está estudiando. Detección de la molécula tirosina hidroxilasa mediante inmunocitoquímica 23 1.3. Localización de neurotransmisores y receptores en el encéfalo: Hibridación in situ • • • También sirve para localizar moléculas peptídicas en el encéfalo, pero en este caso se aprovecha de que todos los péptidos y proteínas se traducen a partir de sus ARNm. Se han generado artificialmente hebras híbridas de ARNm con la secuencia complementaria de bases y se han marcado con un tinte o un elemento radioactivo. Se exponen las secciones cerebrales a las hebras de ARNm híbrido marcado y éstas se unen a las hebras de ARNm complementarias, señalando la localización de las neuronas que liberan la neuroproteína 24 investigada 2. Ingeniería genética • 2.1. Técnicas de supresión de genes Son procedimientos para crear organismos que carezcan de un determinado gen, que es el que queremos investigar. Una vez que se han creado los sujetos knockout, se intenta identificar y luego investigar cualquier anomalía neural o comportamental observable que puedan presentar. • 2.2. Técnicas de sustitución de genes En la actualidad se puede sustituir un gen por otro en ratones, dando interesantes posibilidades para la investigación. Por ejemplo: - Extraer genes patológicos de células humanas e implantarlos en ratones (transgénicos) - Sustituir un gen por otro que sea idéntico excepto por la adición de unas cuantas bases que puedan actuar de interruptor, activándolo o desactivándolo (en un momento determinado del desarrollo o en una estructura cerebral determinada) en respuesta a determinadas sustancias químicas. 25