Tema 8 Organización del genoma en eucariotas III PDF

Tema 8 TEMA 8: ORGANIZACIÓN DEL GENOMA EN EUCARIOTAS (III) Secuencias repetidas en tándem DNA satélite: características, localización y función DNA minisatélite: características, aplicaciones DNA microsatélite: características, aplicaciones DNA telomérico: estructura, mecanismos de mantenimie...

Tema 8 TEMA 8: ORGANIZACIÓN DEL GENOMA EN EUCARIOTAS (III) Secuencias repetidas en tándem DNA satélite: características, localización y función DNA minisatélite: características, aplicaciones DNA microsatélite: características, aplicaciones DNA telomérico: estructura, mecanismos de mantenimiento de los telómeros 1  Tema 8 1. Secuencias repetidas en tándem - Secuencias repetidas simples localizadas generalmente en regiones no codificantes - Tres clases: DNA satélite, minisatélite y microsatélite - Presentan gran variabilidad en cuanto a: - el tamaño y la secuencia de la unidad de repetición - el número de repeticiones - la localización cromosómica Regiones teloméricas y subteloméricas Dispersas por el genoma Regiones centroméricas y pericentroméricas El DNA repetido en tándem se ha considerado tradicionalmente DNA no funcional (la mayoría forma parte de la heterocromatina constitutiva), pero: - El DNA satélite se localiza en los centrómeros y se transcribe - Una familia de DNA minisatélite se localiza en los telómeros y también se transcribe - Las secuencias repetidas en tándem son fuente de variabilidad genética (puntos calientes de recombinación) 2  Tema 8 1. Secuencias repetidas en tándem Secuencias repetidas en tándem en el genoma humano * ɣ (gamma) * Satélite gamma 220 regiones pericentroméricas de los crom. 8, X e Y (GC-rich) 3  Tema 8 2. DNA satélite CARACTERÍSTICAS − Tamaño variable de la unidad de repetición (tabla anterior) − Número de repeticiones: miles de veces (pueden ocupar varias Mb) − Identificación: centrifugación en gradiente de densidad (satélites 1, 2 y 3 en humanos) u otros métodos (p.e. familia Sau3A) − Localización cromosómica: regiones centroméricas y pericentroméricas humanos − Secuencias poco conservadas entre especies * ratón: Major and Minor satellites * artrópodos (p.e. Drosophila virilis): secuencias con escasa complejidad muy repetidas 4  Tema 8 2. DNA satélite Centrómeros humanos: Compuestos fundamentalmente por satélite α  secuencias de 171 pb HOR (high-order repeats) Organización del satélite α en centrómeros humanos (HOR: high order repeats, αM: α satellite monomers, SS: simple sequence satellite DNAs) Estructura repetitiva del DNA centromérico del cromosoma 8 humano 5  Tema 8 2. DNA satélite FUNCIÓN DEL DNA SATÉLITE Centrómero: Región implicada en la segregación cromosómica  ensamblaje del cinetocoro − Compuesto por satélite α en humanos (171 pb) − Esta secuencia contiene sitios de unión para CENP-B (CENP-B box, 17 pb) − CENP-B recluta a CENP-A, variante de la histona H3 (específica del centrómero) − Chaperona HJURP − Interacción con CENP-C Fachinetti et al. 2015 Model of CENP-B centromere function through its interaction with CENP-C. Centromere function is supported by a dual mechanism for CENP-C recruitment and subsequent CENP-C-dependent nucleation of kinetochore assembly, mediated both by CENP-A and by CENP-B. 6  Tema 8 2. DNA satélite * Existen grandes diferencias en la organización de los centrómeros en eucariotas 7  Tema 8 2. DNA satélite Se han detectado transcritos procedentes de secuencias pericentroméricas y centroméricas en diferentes contextos celulares y en múltiples organismos * Poco abundantes (suceso raro o transcritos inestables) * Producidos por la RNApol II * Posibles funciones de los transcritos centroméricos (cRNAs): 1. cRNAs may bind to (or originate from) boundary elements to ensure that different chromatin states can coexist adjacent to each other by maintaining different chromatin identities. Different functional chromatin domains may be maintained this way. 2. cRNAs may bind centromere-associated proteins and guide them to or stabilize them at centromeres. The guidance may occur in cis on the chromosome of origin of the RNA or in trans on centromeres that do not encode for the cRNAs. 3. cRNAs may be part of a higher order chromatin structure that utilizes RNA as a scaffold to maintain a 3D structure crucial for centromere biology. Depicted is a previously suggested hypothetical structure of mitotic centromeres that folds CENP- C-containing domains into an outer platform for kinetochore components. This structure may be established, stabilized or maintained by cRNAs. Rošić y Erhardt 2016 8  Tema 8 2. DNA satélite * Expresión en condiciones fisiológicas y patológicas Saksouk et al. 2015 Enrichment of H3K9me3 at standard physiological conditions characterizes human satellite repeats. Additionally, H3K9me3 level in satellite DNA repeats is enriched upon heat stress, while in cancer cells the H3K9me3 level is decreased relative to normal cells. Blue arrows indicate satellite DNA monomers (ENCODE data). Ugarković et al. 2022 9  Tema 8 3. DNA minisatélite DNA minisatélite (VNTRs, variable number of tandem repeats) Unidad de repetición (UR) de tamaño moderado ( 60 pb) Número variable de repeticiones (5-50) Secuencias ricas en GC Frecuentes y altamente polimórficos (en cuanto al nº de repeticiones) Localización: Distribuidas por el genoma (regiones subteloméricas) Familia telomérica (apartado 5 del tema) 10  Tema 8 3. DNA minisatélite CARACTERÍSTICAS − Son loci multialélicos (cada alelo con un número ≠ de repeticiones de la UR) − Se heredan mendelianamente − Útiles para estudios de identidad genética  huella genética o perfil de DNA (características aplicables al DNA microsatélite) DNA fingerprinting Técnica que permite identificar individuos particulares en base a las características específicas de su material genético (A. Jeffreys, 1984). Se basa en que: − Los perfiles para un VNTR en individuos no relacionados son habitualmente diferentes (según frecuencia alélica) − Si se estudian varios VNTRs, cada individuo tendrá un patrón único de bandas En algunos casos hay que recurrir al cálculo de probabilidades para analizar los resultados Aplicaciones: Pruebas de paternidad y parentesco, análisis de ligamiento, medicina forense (violaciones, asesinatos, identificación de restos humanos, etc.), análisis de la estructura de poblaciones (detección de diversidad genética, flujo genético), etc. 11  Tema 8 3. DNA minisatélite ANÁLISIS DE MINISATÉLITES Detección de los polimorfismos o genotipado (Southern blot): - extracción DNA - digestión con enzima de restricción que no corta en la UR - electroforesis en gel de agarosa - transferencia a filtro - hibridación con la sonda específica (repetición) También se pueden analizar por PCR si la región que contiene las repeticiones no es muy grande (prácticas TAG) 12  Tema 8 3. DNA minisatélite Sondas monolocus − Detectan una sola secuencia minisatélite o locus VNTR − Permiten hacer análisis mendeliano y conocer el genotipo de un individuo porque detectan los dos alelos de cada locus (herencia codominante) − En DNA fingerprinting, la utilización de sondas monolocus puede ser poco informativa (según las frecuencias alélicas) − Se pueden usar varias sondas monolocus* (se analizan los polimorfismos para varios loci) una sonda monolocus varias sondas monolocus* Minisatellite fingerprinting to demonstrate kinship 13  Tema 8 3. DNA minisatélite Sondas multilocus − Detectan loci minisatélites con la misma UR o con URs de secuencia similar localizados en diferentes puntos del genoma − Se detectan múltiples bandas por individuo en un rango variado de tamaño − 10-25% de bandas pueden ser compartidas por azar entre dos individuos − Las más utilizadas Probe: 33.15 Probe: 33.6 X M B U U U M B U U U The first application of DNA fingerprinting, an immigration case (multilocus, 1985) Multilocus fingerprinting to match trace evidence from a crime with suspects Jeffreys 2005 Limitaciones de esta técnica (VNTRs) * Se requiere una gran cantidad de DNA no degradado (0.5-5 g) * Las bandas no se pueden asignar a loci específicos al usar sondas multilocus * Los perfiles se han de comparar uno a uno (no hay bases de datos con los perfiles de DNA) 14  Tema 8 4. DNA microsatélite DNA microsatélite (STRs, short tandem repeats; SSR, simple sequence repeats) Repeticiones en tándem de secuencias muy simples (2-6 pb,