Tema 6. Microfilaments PDF

BLOC III - CITOESQUELET Tema 6. Microfilaments 1. Introducció al citoesquelet 2. Estructura, composició i funcions dels microfilaments 3. Tipus de microfilaments 4. Polimerització de l’actina 4.1. Polimerització de l’actina in vitro...

BLOC III - CITOESQUELET Tema 6. Microfilaments 1. Introducció al citoesquelet 2. Estructura, composició i funcions dels microfilaments 3. Tipus de microfilaments 4. Polimerització de l’actina 4.1. Polimerització de l’actina in vitro 4.2. Polimerització de l’actina in vivo: Proteïnes d’unió a l’actina 4.3. Inhibidors de la polimerització i despolimerització de l’actina 5. Proteïnes motores de l’actina i moviments cel·lulars 5.1. Contracció muscular 5.2. Transport de vesícules 5.3. Locomoció cel·lular 5.3.1. Desplaçament de fibroblasts 5.3.2. Moviment ameboide Imatges adaptades de: Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell. Garland Science. New York. Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J, Bertoni GP. The World of the Cell. Pearson. San Francisco. Cooper GM, Hausman RE. The Cell: A Molecular Approach. Sunderland (MA) Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Bretscher A, Ploegh H, Matsudaira P. Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company. New York. Biologia Cel·lular  Microfilaments 2 1. INTRODUCCIÓ AL CITOESQUELET Microfilaments (MF)  Eucariotes Característiques comuns: Microtúbuls (MT)  Eucariotes - Prot. conservades Filaments intermedis (FI)  Eucariotes pluricel. - Polímers lineals - Dinàmics (unions no covalents entre subunitats) [Procariotes contenten prot. similars a actina - Prot. accessòries (MreB) i tubulina (FtsZ) però formen filaments morfològicament molt diferents] Funcions principals: - Forma i suport estructural - Locomoció - Distribució i transport vesícules/orgànuls - Segregació cromosòmica i citocinesi - Contracció muscular Microfilaments 3  Microfilaments 4 2. ESTRUCTURA, COMPOSICIÓ I FUNCIONS DELS MICROFILAMENTS Funcions: -proporcionen forma (cel. animals) -participen en unions (Bandes d’adhesió, Contactes focals) -permeten contracció cèl. musculars -intervenen en transport intracel. de vesícules -participen en citocinesi (cèl. animals) -formació estructures necessàries per locomoció: lamelipodis, micropúes, fil·lopodis, pseudòpodes -processos de fagocitosis (pseudòpodes) i macropinocitosis (protrusió membrana) -modificació de la superfície cel·lular: microvellositats (↑ superfície absorció) Citocinesi Estructures locomoció  Microfilaments 5 Actina G Protofilament d’actina Actina F Extrem + 6,7 nm 4,4 nm 43 kD lloc d’unió ATP Extrem - 7-9 nm 3. TIPUS DE MICROFILAMENTS SARCÒMERS Microfilaments estables: -cèl. musculars sarcòmers (contracció) -cèl. no musculars microvellositats (superfície) bandes d’adhesió (suport teixit) Microfilaments no estables: -polimerització/despolimerització constant còrtex cel. (forma) -polimerització puntual anell contràctil (divisió) lamelipodis (moviment) pseudòpodes (fagocitosi)...  Microfilaments 6 4. POLIMERITZACIÓ DE L’ACTINA 4.1. Polimerització de l’actina in vitro ATP, Na+, Ca2+, Mg2+, K+ actina G-ADP actina G-ATP  Afinitat per polimeritzar  Afinitat per polimeritzar Conformació necessària (no suficient) per despolimeritzar Velocitat polimerització  depèn d’[actina(G)] Velocitat despolimerització  no depèn d’[actina(G)]  constant 1) Fase de nucleació (lenta) Formació dímers, trímers (estables)  centres nucleació 2) Fase de creixement (ràpida) Addició actina(G)-ATP (2 extrems)  Polimerització>Despolimerització 3) Fase d’equilibri dinàmic Reducció [actina(G)]  velocitat polimerització = vel. despolimerització  Concentració crítica [actina(G)] < Cc  DESPOLIMERITZACIÓ [actina(G)] = Cc  EQUILIBRI DINÀMIC [actina(G)] > Cc  POLIMERITZACIÓ  Microfilaments 7 Polaritat estructural: Velocitat polimerització és 10 vegades superior a Pol+ que Pol- Actina(G)-ADP actina G-ATP actina G-ADP Casquet d’ATP Velocitat hidròlisi ATP < Velocitat incorporació Cc- > Cc+ [actina(G)] < Cc+  ESCURÇAMENT (despolimerització 2 pols) [actina(G)] > Cc-  ALLARGAMENT (polimerització 2 pols) Cc+ < [actina(G)] < Cc-  Equilibri dinàmic: INTERCANVI ROTATORI (polimerització + / despolimerització -) Intercanvi rotatori = Treadmilling (flux net de subunitats) addició neta pèrdua neta Cc+ Cc-  Microfilaments 8 4.2. Polimerització de l’actina in vivo: Proteïnes d’unió a l’actina [actina(G)] citosol > Cc- Prot. reguladores: -polimerització (segrestadores, nucleadores...) -longitud microfilaments (estabilitzadores, fragmentadores...) -organització (formació de xarxes/feixos) -unió a altres estructures (membranes) 4.2.1. Proteïnes de nucleació Complex ARP = Actin Related Proteins Centres de nucleació en filaments existents (ex: lamelipodis) (molècules senyal intracel.) Pol -  Microfilaments 9 Formina Nucleen nous filaments Augmenten afinitat Actina(G)-ATP a pol+ Impedeix unió prot. d’encaputxament a pol+ (però no estabilitza pol-) 4.2.2. Proteïnes d’unió als monòmers d’actina Timosina  Segresta Actina(G)-ATP Profilina  Reverteix efecte timosina a) Inactivada Timosina Actina(G)-ATP PIP2 b) Activada Senyal extracel  Microfilaments 10 4.2.3. Proteïnes fragmentadores o desestabilitzadores de microfilaments Cofilina o Factor de despolimerització de l’actina - S’uneix a Pol- (actina-ADP) i lliure Pol- + Pol+ Gelsolina Pol+ Unió i fragmentació microfilaments (Pol +) Despolimerització Pol- Creació nous fragments Pol+ Depenent de Ca2+ ↑[Ca2+] Pol- Pol- Pol- 4.2.4. Proteïnes estabilitzadores de microfilaments - Prot. encaputxament Cap Z (Pol+) Tropomodulina (Pol-) - Prot. recobriment  Tropomiosina (dímer: cadena helicoidal) Adaptat de Orzechowski et al 2014  Microfilaments 11 4.2.5. Proteïnes d’unió a la membrana plasmàtica Proteïnes família ERM: (Ezrin, Radixin, Moesin) (N-ter) Connecten microfilaments a prot. de MP ERM (C-ter) (C-ter) Miosina I: prot. motora Miosina I (N-ter) ATPasa Espectrina (eritròcits): αβαβ MP Distròfia muscular de Duchenne (cr. X) Fodrina (no eritròcits): αβαβ ↓estabilització contracció Debilitat muscular, degeneració múscul esquelètic (3-5 anys) Distrofina (cèl. musculars): αα Mort per aturada respiratòria (adolescència) 4.2.6. Proteïnes d’entrecreuament mida, flexibilitat  Xarxes/feixos 2 llocs d’unió a actina α-actinina Fimbrina Filamina  Microfilaments 12 Filamina Còrtex cel. Homodímers flexibles Xarxes laxes Lamelipodis Fimbrina Mateixa polaritat Monòmer curt i rígid Feixos paral·lels rígids Microvellositats Actina 1μm Miosina I Fimbrina Filopodis Fodrina Pol- 1000/cèl.  Microfilaments 13 Polaritat oposada -actinina Homodímer rígid Feixos antiparal·lels contràctils (miosina II intercalada) Bandes Anell contràctil d’adhesió Fibres d’estrés Contactes focals -actinina Vinculina Talina Integrina Mendes Pinto et al. 2012  Microfilaments 14 4.3. Inhibidors de la polimerització i despolimerització de l’actina Toxines naturals  Bloquegen funcions cel·lulars bàsiques: moviments, fagocitosi, divisió... (mecanisme defensa) Citocalasines (fongs): unió Pol+  inhibició polimerització (↑ despolimerització Pol-) Latrunculina (esponges): unió actina(G)  inhibició polimerització (↑ despolimerització) Fal·loïdines (Amanita phalloides): unió al llarg microfilaments  Estabilització (inhibició polimerització/despolimerització) Inici simptomatologia: 6-24h post-ingesta Fase gastrointestinal (12-24h): mal de panxa, nàusees, diarrees  rentat gàstric, sèrum fisiològic... Fase de millora aparent (24-48h) Fase hepato-renal (2-4 dies post-ingesta): insuficiència hepàtica  transplantament de fetge  Microfilaments 15 5. PROTEÏNES MOTORES DE L’ACTINA I MOVIMENTS CEL·LULARS E química (ATP)  E mecànica Direcció Pol+ (excepció: miosina VI) Moviment de microfilaments, orgànuls, vesícules... ESTRUCTURA: 1-2 cadenes pesades Cap (N-ter) = MOTOR (ATPasa): uneixen MF Cua (C-ter) = CÀRREGA: uneixen MP/vesícules/miosines Cadenes lleugeres Regulen activitat Naydenov et al 2021  Microfilaments 16 Miosina I (Minimiosina): unió microfilaments o membranes  lliscament microfilaments  desplaçament vesícules i orgànuls  desplaçament microfilaments al llarg de membrana Miosina II: unió a altres cues (filaments bipolars) -cèl. no musculars (1% prot) Feixos prims (7nm) bipolars (15-20 miosines) Interaccions estables (bandes d’adhesió) Interaccions transitòries (anell contràctil, fibres d'estrès) -cèl. musculars (35% prot.) Feixos gruixuts (13nm) bipolars (~300 miosines) Interaccions estables amb MF (sarcòmers)  Microfilaments 17 5.1. Contracció muscular Múscul esquelètic Feix cèl. musculars Miofibra = Fibra muscular Z disk Z disk Multinucleada, allargada Citoplasma conté miofibril·les Miofibril·la (+) (+) (-) (-) (+) (+) Feixos actina+miosina II (aparença estriada) Sarcòmer (unitat contràctil) [1/2 banda I] + [banda A] + [1/2 banda I]  Microfilaments 18 α-actinina Pol+ tropomiosina Pol- Actina Actina (+) (+) Contracció muscular:  longitud sarcòmer (banda I)  Microfilaments 19 UNIÓ: Múscul en fase de Rigor (fase curta excepte si manca ATP) Miosina II ALLIBERAMENT: Unió ATP-miosina (disminució afinitat per actina) 5 nm MOVIMENT: Hidròlisi ATP  canvi conformació (5 nm cap a Pol+) Re-UNIÓ i COP DE FORÇA (alliberament de P+ADP) UNIÓ: Miosina queda unida a actina (Rigor)  Microfilaments 20 Múscul esquelètic (ràpid) Múscul llis (lent) Cèl. no musculars (lent) MLCK= quinasa de la cadena lleugera de la miosina Tropomiosina Troponina complex Actina Llocs d’unió a miosina exposats Llocs d’unió Miosina II a miosina INTERACCIÓ  Microfilaments 21 5.2. Transport de vesícules En regions riques en MF (córtex cel.) les vesícules són conduïdes per Miosina I (+), Miosina V (+), Miosina VI (-) 5.3. Locomoció cel·lular Desenvolupament embrionari, creixement axons, sistema immune, osteoclasts, fibroblasts, queratinòcits,... Unidireccional Senyals extracel.  Ca2+ intracel. Pol+ Pol+ Signal  Microfilaments 22 5.3.1. Desplaçament de fibroblasts (+ quedatinòcits, cèl. cancerígenes, cèl. embrionàries...) Mecanisme lent: protusió, adhesió, tracció, desadhesió Lamelipodis, filopodis, micropúes Filopodis (50 m) Lamelipodis Micropúes (5-10 m) 1) Protusió: extensió lamelipodi -nucleació nous filaments (ARP) -polimerització Pol+ (Profilina, Formina) -despol. Pol- (Cofilina, Gelsolina) Miosina I -estabilització MF (Filamina, Fimbrina) -unió a MP (Miosina I) -vesícules cap a front d'avanç (Miosina I) 2) Adhesió al substrat dels lamelipodis Formin ARP -contactes focals (integrines)  ancoratge -formació fibres d'estrès (α-actinina) 3) Tracció del cos cel·lular -fibres d’estrès  tensió al córtex -contracció citoesquelet d’actina (Miosina II) DETACHMENT 4) Desadhesió -inactivació integrines contactes focals posteriors  Microfilaments 23 5.3.2. Moviment ameboide (leucòcits, amebes) Mecanisme ràpid i vigorós: - Generació corrents citoplasmàtics - Provoca extensió de lamelipodis (xarxa 2D) i pseudopodes (xarxa 3D) Endoplasma: consistència fluïda Ectoplasma: consistència gelatinosa (↑viscosa, ↑ densitat microfilaments) Filamina -Actinina Canvis viscositat Endoplasma Ectoplasma (xarxa laxa microfilaments) Corrents (xarxa densa microfilaments) citoplasmàtics Gelsolina Cofilina