Tema 3- Microscopía.docx

Tema 4. Técnicas de observación microscópica Para producir una imagen se requieren dos elementos: Primero, el objeto en estudio, sobre el cual debe incidir algún tipo de radiación electromagnética que permita “iluminarlo” por decirlo de alguna manera y segundo, un medio de formación de la imagen, o...

Tema 4. Técnicas de observación microscópica Para producir una imagen se requieren dos elementos: Primero, el objeto en estudio, sobre el cual debe incidir algún tipo de radiación electromagnética que permita “iluminarlo” por decirlo de alguna manera y segundo, un medio de formación de la imagen, o sistema óptico, que permitirá finalmente producir la imagen. El tamaño de la imagen formada puede ser más pequeño, igual o mayor que el tamaño del objeto a partir del cual se produjo. La lente, en los sistemas ópticos, es el instrumento principal para la formación de imágenes y como ejemplo de sistemas ópticos podemos citar el ojo humano, la cámara fotográfica, la lupa magnificadora, el proyector de imágenes, el microscopio y el telescopio. A pesar de todo el progreso técnico logrado, el ojo, conjuntamente con el cerebro, es el sistema procesador de imágenes más eficiente disponible hasta la fecha. Todas las posibilidades proporcionadas por la tecnología no son equiparables con el ojo en lo que concierne a velocidad y resolución. sin embargo, los objetos de muy pequeño tamaño no pueden ser percibidos. Una solución a esta limitación ha sido empleada por siglos, la lupa o lente magnificador, que cuando se coloca entre el ojo y el objeto, éste último aparece más grande. No obstante, este método tiene sus limitaciones, la ampliación que se logra no es más que de ocho a 10 veces. La lupa también se denomina microscopio simple, puesto que está conformada por una sola lente. Para ver más detalles se debe utilizar el microscopio compuesto. Este instrumento permite obtener una imagen considerablemente aumentada. Como una lente (lupa) no es suficiente, varias de ellas se pueden disponer de manera alineada. Sobre la base de las consideraciones anteriores se ha definido la microscopía como la técnica que permite observar objetos con un microscopio (simple o compuesto) para obtener una imagen aumentada y en relación a esta técnica, es necesario considerar tres elementos: El objeto a estudiar (preparado histológico por ejemplo), una fuente de iluminación y un sistema óptico. Los términos aumento y resolución deben ser bien conocidos por todo usuario del microscopio y el mecanismo mediante el cual se produce este fenómeno ha sido estudiado por siglos y se explica mediante leyes de la física. El aumento solo no es suficiente para sacar el mejor partido del microscopio, pues la resolución determina lo que se verá (12). El poder de aumento de una lente está determinado por varios factores (13) y la resolución es la capacidad que tiene un sistema óptico de separar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro (14). La riqueza de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la habilidad del instrumento para hacer que puntos muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. El poder de resolución de un microscopio depende de ciertos factores inherentes a las lentes y a la iluminación empleada (13) y el haber podido lograr manipular estas variables ha permitido el diseño de instrumentos con mayor capacidad de aumento y de contraste, tales como el microscopio electrónico y otros tipos de microscopios especializados. Pero aun los microscopios más eficientes presentan limitaciones que interfieren con la formación de imágenes de calidad, encontrándose una variedad de defectos denominados aberraciones (15). Estos errores producen distorsión de las imágenes y son producidos mediante varios mecanismos, ya sea por el comportamiento de la luz al incidir sobre el objeto en estudio o ya sea por defectos propios de las lentes, los cuales pueden ser corregidos (16). El microscopio compuesto de uso común también se conoce con el nombre microscopio óptico o fotónico, en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes ópticas y de luz visible. Está constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados para garantizar su funcionamiento: Un sistema mecánico o conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y demás elementos; un sistema de iluminación que produce las radiaciones (luz visible o no) y transmite, refleja y regula tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a incidir sobre el espécimen; un sistema óptico o conjunto de lentes responsables del poder de aumento y la resolución y por último, los accesorios, que son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento (cámaras fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros) (18). Desde el año 1878 se conocía que el poder de resolución del microscopio óptico estaba limitado, en parte por la longitud de onda de la luz utilizada y que dicho poder podía ser mejorado mediante objetivos de inmersión o el empleo de luz ultravioleta (19). La posibilidad de lograr un mayor poder de resolución no se vislumbró hasta que se realizaron dos descubrimientos científicos que fueron decisivos (20): El descubrimiento de las propiedades de los electrones libres en 1924 y el hallazgo de la analogía entre el efecto de una resistencia magnética o electroimán sobre un haz de electrones libres y el efecto de las lentes convergentes sobre un rayo de luz, en 1926. A partir del hecho que la longitud de onda de los electrones en movimiento es menor que la longitud de onda de la luz visible, se concibió la idea que las partículas más pequeñas (como por ejemplo la ultraestructura de las células y tejidos) podrían ser observadas con un haz de electrones enfocado con lentes electromagnéticas, naciendo así el microscopio electrónico. El microscopio electrónico de transmisión está conformado básicamente por una cámara al vacío, una columna donde se genera el haz de electrones, un sistema óptico (conformado por lentes electromagnéticas) que proyecta una imagen en una pantalla fluorescente o en una placa fotográfica y un circuito electrónico estabilizador de voltaje (14, 23). Las lentes electromagnéticas también son susceptibles de sufrir aberraciones (14). Sobre la base de las ideas planteadas anteriormente, se deben considerar las siguientes afirmaciones: • La luz es una forma de energía electromagnética. • La energía luminosa se transmite a través de partículas: Los “fotones”. • La energía luminosa se transmite a través de ondas. • La mecánica cuántica concilia los dos puntos de vista a través de la confirmación de la “dualidad partícula-onda”. • Muchos aspectos sobre la naturaleza de la luz aún se desconocen. El rango del espectro de las radiaciones solares corresponde al intervalo de longitudes de onda que ve el ojo. Las fuentes de luz hechas por el hombre tales como la bombilla eléctrica incandescente, irradian y tienen un espectro de emisión amplio; otras fuentes emiten únicamente una luz de determinada longitud de onda. Al considerar la luz como una onda que se transmite de forma sinusoidal y periódica, que describe ciclos repetitivos, la longitud de una onda es la distancia entre dos crestas consecutivas El término lente es el nombre asignado a una pieza de vidrio, plástico u otro material transparente, generalmente de diámetro circular, que posee dos superficies pulidas y diseñadas de una manera específica para producir la convergencia o divergencia de los rayos luminosos que la atraviesan. La acción de una lente depende de los principios de refracción y reflexión, los cuales pueden entenderse mediante unas sencillas reglas de geometría que rigen el paso y trayecto de la luz a través de la lente. Estos conceptos son materia de estudio de la Óptica Geométrica y permiten comprender el proceso de magnificación, las propiedades de las imágenes real y virtual, así como también los defectos (aberraciones) de las lentes (11, 41). La palabra lente proviene del latín "lentis" que significa "lenteja" por lo que a las lentes ópticas se les llama así por su semejanza con la forma de la legumbre (42). Las lentes son instrumentos ópticos que concentran o dispersan los rayos de luz. Sus dos superficies pueden ser curvas (biconvexas, bicóncavas o cóncavo-convexas) o una de ellas puede ser plana (plano-convexas, plano-cóncavas) (fig 2-7). Las lentes de superficies convexas se denominan positivas, convergentes, recolectoras o de aumento. Las lentes de superficies cóncavas son conocidas como negativas, divergentes, de dispersión y producen una imagen reducida (11) La luz se propaga con una trayectoria rectilínea y con una velocidad constante en cada medio. Cuando incide en un objeto, el rayo luminoso se comporta de diversas maneras, produciéndose: Refracción, Reflexión, Difracción, Absorción-Transmisión, Interferencia y Polarización. Describiremos someramente la refracción y la reflexión por su utilidad en la formación de las imágenes aumentadas por las lentes. Si dividimos la velocidad de la luz en el vacío entre la que tiene en un medio transparente, obtenemos un valor que llamamos índice de refracción de ese medio y es el cociente entre velocidad de la luz en el vacío y la velocidad de la luz en el medio que se estudia: n: índice de refracción c: velocidad de la luz en el vacío v: velocidad de la luz en el medio material transparente   El índice de refracción de un medio es una medida para saber cuánto se reduce la velocidad de la luz dentro del medio transparente en estudio. Si el índice de refracción del agua es n= 1,33, quiere decir que la luz es 1,33 veces más rápida en el vacío que en el agua y es un valor que tiene que ver con las propiedades de las lentes (5) (Tabla 2-1). En las lentes convexas la refracción se produce de acuerdo a las mismas leyes. El estudio resumido de esos fenómenos es indispensable para comprender las propiedades de las lentes y la formación de las imágenes. Se tomará primero como ejemplo una lente plano-convexa. Obsérvense tres rayos a, b, y c, cuya incidencia es normal (perpendicular) en relación a la cara plana de la lente. Al inicio, estos rayos no serán refractados; atravesarán la lente, llegaran a la cara convexa en donde si se refractan y su destino será diferente (fig 2-11). Figura 2-11. Refracción en una lente plano-convexa. a, b, c rayos incidentes paralelos. a’ y c’ rayos refractados. f foco de la lente. Modificado a partir de Langueron (11). El rayo bn coincide con el eje de la lente y no se refracta: se comporta como si al salir lo hiciera de una cara paralela a la cara de entrada. Los rayos a y c son por el contrario, oblicuos en relación a la cara curva de la lente. Ellos serán refractados porque pasan del vidrio al aire y se aproximan al eje de la lente, cortando el rayo bn en el punto f. Dos leyes resultan de estas consideraciones: 1. Todo rayo que pasa por el centro de la lente NO es refractado. 2. Todo rayo que no pasa por el centro de la lente ES refractado. Mientras más lejos del centro, la desviación será mayor. Los rayos refractados convergen todos en un punto que es el foco o punto focal de la lente. El punto focal es el punto en donde confluyen los rayos luminosos refractados, después de atravesar la lente. Se puede apreciar, por ejemplo, cuando al recibir los rayos solares sobre una lupa planoconvexa o biconvexa, se forma un punto muy luminoso y muy caliente. Los rayos caloríferos siguen el mismo trayecto que los luminosos. La distancia focal es la distancia que separa el punto focal del centro óptico de la lente (11, 48) Se verá ahora la refracción en las lentes biconvexas (fig. 2-12). Los fenómenos de refracción que se acaban de estudiar permitirán explicar cómo las lentes pueden formar las imágenes. Figura 2-12.-Refracción en una lente biconvexa. a, b, c rayos incidentes paralelos. a’ y c’ primera refracción. e’ y e’’ segunda refracción. f foco de la lente. Modificado de Langueron (11). La lente es el instrumento principal para la formación de imágenes y los sistemas ópticos están constituidos a partir de lentes, combinadas o no, que permiten obtener imágenes de los objetos en estudio. Los instrumentos para el enfoque (lentes) son necesarios porque la luz que incide sobre un objeto es irradiada y dispersada por este último, de allí que la lente es imprescindible para deshacer este efecto de dispersión y en consecuencia lograr el enfoque de los rayos luminosos provenientes de cada punto del objeto. El microscopio compuesto es un instrumento óptico que permite ver objetos que por su pequeño tamaño son invisibles a simple vista. Permite obtener a partir de esos objetos una imagen considerablemente aumentada. Es una combinación del proyector de imágenes y una lupa. Si una lente (lupa) no es suficiente, varias lentes se pueden disponer de manera alineada. El efecto de magnificación se multiplica así, permitiendo ampliaciones hasta de 2000 veces. El microscopio compuesto magnifica en dos pasos puesto que tiene dos juegos de lentes. El primer juego, denominado objetivo (funciona como el proyector de imágenes) produce una imagen aumentada del objeto y el segundo, denominado ocular magnifica la imagen producida por el objetivo, de la misma manera que lo haría una lupa. La trans-iluminación ha sido indudablemente el primer método de iluminación en la larga historia de la microscopía. El rayo electromagnético (luz visible por ejemplo) debe atravesar el objeto, La trans-iluminación permite obtener un campo de visión con una cantidad de luz importante, resaltando la estructura observada sobre un fondo muy iluminado. El microscopio compuesto clásico emplea este tipo de iluminación y por ello también se denomina de campo claro. La microscopía electrónica de transmisión (14) y la mayoría de microscopios especiales también se fundamentan en este principio. Con esta técnica de iluminación el rayo de luz incide de manera oblicua sobre la muestra (fig. 3-2). La iluminación puede abarcar simultáneamente todo el campo de visión o por el contrario, focalizarse en un punto determinado del objeto. Las muestras pueden observarse sin necesidad de realizar cortes finos y en muchos casos tampoco se emplean colorantes. La transparencia del objeto no es imprescindible. Como efecto de la epi-iluminación es posible obtener imágenes tridimensionales, complementando de esta manera lo observado con la microscopía por trans-iluminación. Varios tipos de microscopios emplean este método y como ejemplo podemos citar microscopios binoculares estereoscópicos para microdisecciones, y los microscopios de epi-fluorescencia, el confocal y el electrónico de barrido. El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la distancia focal y mayor será el aumento. Se ha enunciado anteriormente que el microscopio compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola lente no es suficiente se deben colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular (11). Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con la letra x, así que 10x significa que la imagen está aumentada 10 veces. Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen se aplica la siguiente fórmula: AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular El poder de aumento de un sistema óptico tiene sus límites y el aumentar las imágenes acarrea pérdida de información o detalles del objeto estudiado. Esto puede ser resuelto mediante otro principio: La resolución. Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro (14). La riqueza de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más finos serán los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como Límite de Resolución, el cual es también referido como el Poder de Resolución y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento del microscopio. Límites de Resolución aproximados de algunos sistemas ópticos: • Ojo humano: 0,2 mm. • Microscopio Fotónico: 0,2 µm. • Microscopio electrónico: 0,2 nm.