Componentes básicos de un microscopio óptico PDF

TEMA 9: COMPONENTES BÁSICOS DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO 2.1.1. COMPONENTES MECÁNICOS 2.1.2. COMPONENTES ÓPTICOS 2.1.3. FUENTE LUMINOSA 3. CONCEPTOS DE ÓPTICA 3.1. PODER DE...

TEMA 9: COMPONENTES BÁSICOS DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO 2.1.1. COMPONENTES MECÁNICOS 2.1.2. COMPONENTES ÓPTICOS 2.1.3. FUENTE LUMINOSA 3. CONCEPTOS DE ÓPTICA 3.1. PODER DE RESOLUCIÓN (PR) 3.2. APERTURA NUMÉRICA (AN) 3.3. PROFUNDIDAD DE CAMPO O PODER DE PENETRACIÓN 3.4. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (n) 3.5. AUMENTOS 4. USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 4.1. MANEJO 4.1.1. CONSEJOS PRÁCTICOS 4.2. MANTENIMIENTO 1. INTRODUCCIÓN La palabra microscopio deriva del griego: (mikrós: pequeño y skopéo: observar). El microscopio es un instrumento diseñado para producir imágenes aumentadas de objetos muy pequeños para observarlos y analizar visualmente características y detalles de los mismos. Los orígenes del microscopio: Se piensa que sus descubridores fueron los fabricantes de anteojos Hans Janssen y su hijo Zacharias en Holanda entre 1590 y 1610. Tenían dos lentes de 10x cada una, una en cada ojo. Algunos autores atribuyen su invento a Galileo Galilei (1564-1642) como inventor del primer microscopio compuesto, aunque poco funcional Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) también es considerado inventor del microscopio por las mejoras que incorporó a los microscopios que él mismo construía y que le permitieron llegar hasta los 200 aumentos, lo que le permitió observar por primera vez microorganismos (protozoos) y hallazgos celulares revolucionarios para su época (descubrió los espermatozoides). Se le considera por ello, también, el padre de la biología celular y de la microbiología. Los microscopios ópticos se dividen en: SIMPLES: Tienen una única lente convergente (convexa). A principios del siglo XIX el microscopio simple ya cuenta con una serie de mejoras, como soportes ajustables, lente condensadora y tornillos de ajuste. Está constituido por una sola lente convexa o plano-convexa, una plataforma donde colocar un vidrio de reloj para la muestra y un espejo con el que dirigir la luz hacia la muestra. COMPUESTOS: Tienen dos sistemas ópticos (hecho cada uno de una o más lentes convergentes) que actúan alineados. Con estos microscopios se pueden conseguir mayores aumentos que con los simples y permite combinar los sistemas de lentes. El microscopio compuesto posee una parte mecánica, compuesta por la montura, tornillos reguladores, lámpara, condensador, platina, etc., y otra óptica compuesta por las lentes o sistemas de lentes. 2. PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO 2.1. COMPONENTES MECÁNICOS Es el conjunto de componentes que soporta la muestra, las lentes y todos los sistemas de ajuste del microscopio para la observación adecuada. Los componentes mecánicos son: PIE: Soporte sobre el cual se apoya el microscopio. BRAZO: Estructura que comunica el pie con el tubo. TUBO DE OBSERVACIÓN (CABEZAL): Estructura unida al brazo donde la luz del objetivo es enviada al ocular mediante un espejo. MECANISMOS MÓVILES: ◦ Tornillo de enfoque macrométrico: Acerca o aleja rápidamente la preparación del objetivo para efectuar un enfoque aproximado. ◦ Tornillo de enfoque micrométrico: Permite enfocar con precisión, moviendo muy lentamente el objetivo. ◦ Revólver portaobjetivos: Permite colocar en posición de trabajo los distintos objetivos con que cuenta el microscopio. ◦ Platina: Es la superficie sobre la cual se colocan los portaobjetos. Está dotada de un sistema con dos tornillos que permiten el desplazamiento preciso (horizontal y vertical) de la preparación y un orificio en su centro que permite el paso de la luz. ◦ Pinzas: Sujetan el portaobjetos sobre la platina. ◦ Tornillo del condensador: Permite subir o bajar el condensador respecto a la platina, para mejorar la iluminación. 2.2. COMPONENTES ÓPTICOS Los componentes ópticos son dos sistemas ópticos, uno corresponde al objetivo y el otro al ocular. OBJETIVO: Está compuesto por un sistema de lentes montadas en un tubo metálico que constituye el soporte del objetivo. Este sistema óptico proporciona una imagen real aumentada e invertida del objeto a observar. Se sitúan en la parte inferior del tubo y más próximas al objeto que ese va a examinar. Actualmente los objetivos de foco muy corto llevan lo que se denomina montura telescópica, que consiste en que la parte central puede deslizarse en el interior del objetivo. Esto evita el deterioro del mismo en caso de choque con las preparaciones.  El tamaño del objeto examinado es aumentado primero por la lente objetivo. La imagen aumentada se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final, por tanto, el aumento de la imagen será mayor cuantas más lentes formen parte del microscopio. Dicho aumento viene grabado en un anillo de color en la parte superior y por el signo de multiplicar (x) seguido de un número en el tubo o soporte (Ejmp: 10x: aumenta la imagen 10 veces respecto al objeto). Los objetivos llevan una marca de color indicativa de los aumentos que proporciona. Otra propiedad importante de un microscopio es su poder de resolución: la capacidad de mostrar distintos y separados puntos muy próximos. Por tanto, a mayor poder de resolución mayor definición del objeto. El poder de resolución del microscopio radica en el objetivo. OCULAR: Consta de 2 lentes o sistemas de ellas, que se encuentran montadas en los extremos de un tubo adaptado a la parte superior del microscopio. El ocular recoge la imagen suministrada por el objetivo transformándola en una imagen más aumentada. Los oculares cubre una gran gama de aumentos, entre 6-25x, si bien los más utilizados son los de 10x. Para conocer el aumento total con que se está observando, basta con multiplicar el aumento del ocular (10x) por el aumento del objetivo utilizado (4x, 10x, 40x, 100x, etc.). Si usamos un objetivo 40x, los aumentos totales serían de 400x. CONDENSADOR: Recibe la luz y la intensifica, permitiendo una mayor claridad de la imagen. DIAFRAGMA: Su función es la de graduar la cantidad de luz que recibe el objeto. 2.3. ILUMINACIÓN DE LA MUESTRA Los microscopios modernos llevan como fuente de iluminación una lámpara halógena situada en la base del microscopio que proporciona luz. Sobre esta lámpara puede haber un diafragma de campo, que al cerrarlo disminuye el área de visión de la muestra (disminuye el campo de visión). Esta luz llega al condensador, que es una combinación de lentes colocadas bajo la platina, el cual recoge y enfoca la luz de la lámpara en el objeto sobre la platina. Sobre la lente condensadora suele haber otro diafragma cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes, eliminando los rayos demasiado desviados. El diafragma consiste en una apertura regulable que deja pasar más o menos luz a través de un orificio. 3. CONCEPTOS DE ÓPTICA La luz se transmite a través de unas partículas (que también poseen comportamiento ondulatorio) llamadas fotones. Una vez que se emite, la luz puede tener muchos comportamientos cuando llega a los objetos. Los más importantes son: REFLEXIÓN: la luz es reflejada por una superficie. No atraviesa el objeto. REFRACCIÓN: la luz atraviesa el objeto y sale del mismo con distinta dirección. Podemos observar este efecto cuando observamos un lápiz sumergido en agua. Las lentes son objetos capaces de desviar la luz. Existen distintos tipos: Lentes convergentes o convexas: dirigen los rayos que las atraviesan hacia un mismo punto. Es decir, los rayos convergen en un punto. Son más gruesas por el centro que por los bordes. Formarán una visión ampliada del objeto. Lentes divergentes o cóncavas: dispersan los rayos. Forman una visión reducida del objeto. Las principales características que diferencian a un microscopio de otro son: La resolución: Nos permite observar los detalles. Depende de las lentes, de la longitud de onda de la radiación de la luz, siendo inversamente proporcional a ella, del índice de refracción del material que atraviesa la luz y del tamaño (radio) del objetivo (cuanto mayor sea, más cantidad de luz podrá captar). Los aumentos: Se refiere a la capacidad que tiene de agrandar la imagen. Depende de la forma de las lentes. 3.1. PODER DE RESOLUCIÓN (PR) Es la capacidad de las lentes de distinguir con nitidez dos puntos situados muy próximos entre sí. Se expresa como la distancia mínima que permite dar una imagen bien definida de dos puntos, donde λ es la longitud de onda de la iluminación y AN es la apertura numérica. PR (µm) = λ (µm) / (2 × AN) Cuanto mayor es el PR, con mayor claridad observaremos dos puntos muy pequeños y próximos entre sí como puntos bien separados y definidos. El ojo humano tiene un límite de poder de resolución de aproximadamente 0,2 mm, pudiendo ser capaz de discernir como dos puntos separados dos puntos situados a 0,2 mm de distancia uno respecto al otro. El microscopio óptico tiene un límite de resolución máximo de 0,2 µm. Las lentes del objetivo deben recolectar la mayor cantidad de luz para formar una imagen nítida; a más rayos capturados, mayor resolución. 3.2. APERTURA NUMÉRICA (AN) Cuando la luz atraviesa la muestra en dirección al objetivo, ésta forma un cono con un ángulo de apertura (α). La AN de un objetivo se define como: AN = n x sen (α/2), donde n es el índice de refracción de la luz en el medio que hay entre la muestra y el objetivo. Para el aire n = 1 y para el vidrio o aceite de inmersión n = 1,51. Un poder de resolución bajo, indica una alta resolución del objetivo, ya que indica que es capaz de discernir como independientes dos puntos separados por una distancia muy pequeña. 3.3. PROFUNDIDAD DE CAMPO O PODER DE PENETRACIÓN Es el espesor máximo de muestra que aparece enfocado a la vez. Guarda relación inversa con el aumento: es menor cuanto mayor es el aumento utilizado. 3.4. ÍNDICE DE REFRACCIÓN (n) Es la relación que existe entre la velocidad de la luz en el aire y su velocidad en el medio transparente que se emplea. El índice de refracción de un objeto o una sustancia transparente se expresa mediante la fórmula: n = velocidad de la luz en el aire/ velocidad de la luz en el medio La velocidad de la luz en el aire es de aprox. 300.000 km/s. Al atravesar un medio como el aceite de inmersión, su velocidad se reduce a aprox. 200.000 km/s. Por lo tanto, el aceite tiene un índice de refracción de 1,5. 3.5. AUMENTOS El aumento total del microscopio se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el del ocular: Aumento total= aumentos del objetivo × aumentos del ocular 4. USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 4.1. MANEJO Para observar una muestra en el microscopio óptico ésta se debe colocar sobre un portaobjetos y sobre ella se coloca el cubreobjetos, siempre que no se vaya a utilizar el objetivo de inmersión. Los pasos que se han de seguir para un enfoque perfecto del microscopio son: 1. Encender el microscopio. 2. Graduar el asiento a la altura adecuada. 3. Ajustar los oculares hasta adaptarlos a las características del observador: espacio interocular y distancia focal. 4. Bajar la platina con el tornillo macrométrico al máximo. 5. Colocar la muestra sobre la platina de forma que la estructura que se va a observar quede sobre el orificio central. 6. Comenzar con el objetivo de menor aumento, que ofrece un mayor campo visual, lo cual facilita el hallazgo de estructuras importantes. 7. Mirando la muestra desde fuera, subir la platina accionando el tornillo macrométrico hasta alcanzar el tope superior, sin que llegue a tocar con los objetivos, excepto cuando se utilice el de inmersión (en este caso debe estar en contacto con el aceite). 8. Bajar lentamente la platina con el tornillo macrométrico, mirando por los oculares, hasta conseguir ver el objeto lo más claramente posible. 9. Ajustar el enfoque con el tornillo micrométrico hasta ver el objeto con nitidez. 10. Una vez enfocada la preparación, para observarla a mayores aumentos, cambiar el objetivo con un giro del revólver (no hay que mover el tornillo macrométrico). Las  pequeñas variaciones que se producen en el enfoque al cambiar de objetivo se corrigen con el tornillo micrométrico. 11. Desplazar la preparación, moviendo los tornillos de la platina, para observar la muestra en su totalidad. 12. Para cambiar la preparación, bajar la platina, colocar el objetivo de menor aumento, quitar la preparación y colocar la siguiente. 4.1.1. CONSEJOS PRÁCTICOS Encender la luz del microscopio sólo cuando vaya a utilizarse. Comenzar siempre el enfoque con el objetivo de menor aumento. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico y micrométrico). El objetivo de inmersión se utiliza para muestras específicas y requiere aceite especial para enfocar correctamente. Si no se usa aceite la lente se puede dañar. Los objetivos secos nunca se utilizan con aceite. Una vez enfocada la muestra, recorrer toda la preparación. 4.2. MANTENIMIENTO Terminada la observación, se debe: Bajar la platina al máximo y retirar la preparación. Limpiar los objetivos (excepto el de inmersión) y los oculares con un papel de óptica impregnado en una solución de etanol-éter al 50%. El objetivo de inmersión se limpia con un paño seco, nunca se debe impregnar con alcohol ni xilol para limpiar la lente, ya que éstos la deterioran. Las partes mecánicas se limpian con un paño humedecido en acetona. Mantener seca y limpia la platina del microscopio: si se derrama sobre ella algún líquido orgánico, se utiliza un paño con lejía y se seca posteriormente, si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de observación. Bajar la intensidad de la luz del microscopio. Apagar el microscopio mediante el interruptor. Finalmente, cubrir el microscopio con su funda. 5. TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS Microscopio de campo claro. Las muestras se visualizan al destacar sobre un fondo iluminado. La fuente de iluminación se sitúa bajo la muestra y la luz la atraviesa. Las estructuras más densas y gruesas de la muestra obstaculizarán el paso de la luz a través de ellas, por lo que se observan más oscuras que aquellas que son más delgadas y menos densas, que dejan pasar luz a través de ellas. l Microscopio de campo oscuro. Normalmente en las muestras el contraste entre la célula viva y el agua es muy difícil de resolver con un microscopio de campo claro. Pero este microscopio cambia las condiciones. Se coloca un condensador especial que impide el acceso de luz a la muestra directamente y sólo los rayos oblicuos que inciden son reflejados. Se observa una imagen con un fondo oscuro y los rayos oblicuos hacen que la muestra se vea iluminada o brillante. Se usa para visualizar microorganismos que son difíciles de teñir por sus características o no se ven con el microscopio normal, p.e. la bacteria de la sífilis (Treponema palidum) o las espiroquetas, que son muy delgadas.  Microscopio de luz UV. Utiliza una longitud de onda (λ) que está en el ultravioleta (200-300 nm). Microscopía de fluorescencia. Consiste en utilizar marcadores fluorescentes (fluorocromos), tales como la rodamina B o isotiocianato de fluoresceína, para detectar determinadas estructuras o componentes celulares. Estos marcadores fluorescentes se excitan con energía luminosa y emiten una luz a una longitud de onda mayor (menos energética). Parte de esa energía que emiten es detectada por el microscopio. Ejercicios: 1. Con una bombilla que da una luz rojiza a 700 nm de longitud de onda y sabiendo que el ángulo de apertura del cono de luz al atravesar la muestra es de 56º, ¿cuál es el poder de resolución del microscopio? ¿Cuál será el poder de resolución si la bombilla emitiera una luz azulada a 400 nm? ¿Con qué bombilla obtendremos mejor resolución? Dato: el índice de refracción del aire es 1. 2. ¿Cuál es el índice de refracción de un aceite por el que la luz viaja a 140.000 Km/s? Si utilizara este aceite en la muestra del ejercicio anterior con la bombilla azulada, ¿qué poder de resolución obtendría?