Synthèse développement animal PDF 2023/2024

2023/2024 Développement animal Lefebvre Sarah Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Table des matières Chapitre 1 / Concepts de base....

2023/2024 Développement animal Lefebvre Sarah Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Table des matières Chapitre 1 / Concepts de base............................................................................................................................ 5 1. L’organisme se construit de manière progressive................................................................................. 5 2. Organismes pluricellulaires sont constituées de cell germinales et somatiques.................................. 5 3. Tous les embryons passent par el même stade de développement..................................................... 5 3.1 Fécondation.............................................................................................................................................. 5 3.2 Segmentation............................................................................................................................................ 5 3.3 Gastrulation............................................................................................................................................... 5 4. L’organogenèse..................................................................................................................................... 5 4.1 Neurulation............................................................................................................................................... 5 4.2 Le stade phylotypique souligne l’origine évolutive commune des organismes (fin p 7).......................... 5 5. Métamorphose............................................................................................................................................ 6 5.1 Des expérience de marquage permettent de révéler quelles cellules de l’embryon donnent naissance aux structures de l’adulte............................................................................................................................... 6 6. Nouvelles approches du marquage génétique pour visualiser le destin des cellules individuelles...... 8 Chapitre 2 / L’embryologie expérimentale......................................................................................................... 9 1. Les pionniers de la tétralogie expérimentale........................................................................................ 9 2. Des facteurs de l’environnement peuvent induire des malformations fœtales................................... 9 2.1 Facteurs environnementaux qui constituent des paramètres essentiels du développement normal... 10 3. Des facteurs à l’intérieur de l’embryon contrôlent la différenciation................................................. 11 3.1 Deux expériences décisives vont poser les bases des 2 grands mécanismes intrinsèques au développement............................................................................................................................................. 11 3.2 Le développement pourra être mosaïque ou régulatif selon les espèces et/ou les processus développementaux considérés..................................................................................................................... 12 3.3 La différenciation cellulaire est un processus progressif qui se réalise par étapes................................ 12 3.4 Déterminants cytoplasmiques................................................................................................................ 13 3.5 Définition et nature des déterminants.................................................................................................... 13 3.6 Communication cellulaire....................................................................................................................... 14 3.7 Différents types de signaux sont utilisés par les cellules pour communiquer........................................ 16 Chapitre 3 / Contrôle génétique du développement........................................................................................ 18 1. Les cellules se différencient parce que les gènes sont exprimés de manière différentielle............... 18 2. La régulation de l’expression génique s’exerce à toutes les étapes.................................................... 18 2.1 L’épissage des ARN issus de la transcription constitue aussi une étape importante de l’expression des gènes............................................................................................................................................................. 18 2.2 Contrôle de la traduction des ARNm............................................................................................... 19 2.3 Des ARN non traduits jouent un rôle important ds la régulation de la traduction................................. 20 2.2 Contrôle post-traductionnel de l’expression des gènes.................................................................. 20 3. La transcription des gènes est contrôlée par l’état de compaction de la chromatine........................ 20 1 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 3.1 Les profils de modification d’histones peuvent persister et être transmis d’une génération cellulaire à l’autre............................................................................................................................................................ 22 3.2 Méthodes d’étude de l’accessibilité de la chromatine........................................................................... 24 4. Le contrôle de transcription implique des séquences d’ADN cis-régulatrices et des facteurs de transcription.................................................................................................................................................. 24 4.1 Régions cis-régulatrices........................................................................................................................... 25 4.2 Les séquences « enhancers » ou « amplificatrices »............................................................................... 25 4.3 L’activité « enhancer » d’une séquence d’ADN peut être mise en évidence par des expériences de type « gène rapporteur »...................................................................................................................................... 26 4.4 Méthode efficace pour découvrir les sites de liaison sur l’ADN de facteurs de transcription................ 26 4.5 Modèle de formation des domaines TAD............................................................................................... 27 4.6 Evidence des domaines TAD dans le contrôle de l’expression des gènes............................................... 27 4.7 Méthodes pour l’identification des domaines TAD................................................................................. 27 5. Les gènes sélecteurs............................................................................................................................ 28 5.1 Différentes catégories de gènes.............................................................................................................. 28 5.2 Exemple de gène sélecteur..................................................................................................................... 28 5.3 Autre exemple de gène sélecteur : eyeless............................................................................................. 28 5.4 Mécanismes d’activation et de maintenance des gènes sélecteurs ?.................................................... 29 6. Les cellules communiquent entres-elles via un nombre limité de molécules de signalisation........... 29 Chapitre 3 / Technique d’identififcation et d’étude de la fonction des gènes.................................................. 31 1. Les premiers gènes de développement ont été identifiés grâce à des mutations spontanées induisant un phénotype anormal.................................................................................................................................. 31 2. Des gènes de développement peuvent être identifiés grâce à des criblages par mutagenèse aléatoire 31 3. Génétique inverse............................................................................................................................... 32 3.1 Technique KO ou KI......................................................................................................................... 32 3.2 Chez la souris, des animaux transgéniques peuvent être obtenu via l’utilisation de cell souches embryonnaires.............................................................................................................................................. 33 3.2.1 Découverte des cellules souches hématopoïétiques et origine du concept de cellules souches........ 33 3.2.2 A quel stade de développement retrouve-t-on ces cellules souches ?................................................ 33 3.2.3 Découverte des cellules ES et de leur pluripotence............................................................................. 34 3.2.4 Démonstration de la pluripotence des cellules ES............................................................................... 34 3.2.6 Par transplantation des cellules ES modifiées dans la masse cellulaire interne d’un blastocyste hôte, on obtient un animal transgénique porteur de la modification génétique.................................................. 35 3.2.7 Les cellules souches embryonnaires (ES) permettent de modifier des gènes spécifiques (KO et KI).. 35 3.2.7 Exemple d’application de la technique du KO..................................................................................... 36 4. L’invalidation conditionnelle (« knock-out » conditionnel)...................................................................... 36 4.1 Les système CRE recombinase -LoxP (contrôle spatial).......................................................................... 37 4.2 Le système CRE/Lox peut aussi être utilisé pour générer des Knock-in exprimant un transgène dans un tissu spécifique.............................................................................................................................................. 37 2 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 4.3 Le KO conditionnel inductible (contrôle temporelle)............................................................................. 37 5. De nouvelles méthodes de mutagenèse ciblée................................................................................... 38 5.1 Comment générer des endonucléases artificielles avec une spécificité de coupure pr le gène ciblé ? 38 5.1.2 Découverte et Fonctionnement du système Crispr............................................................................. 39 6. Techniques de Knock-down d’un gène................................................................................................ 40 6.1 Oligonucléotides anti-sens...................................................................................................................... 40 6.2 Arn interférence...................................................................................................................................... 40 7. La fonction d’un gène peut aussi être étudiée par des expériences de gain de fonction à court terme 41 8. La fonction d’un gène peut aussi être étudiée en ciblant la protéine................................................. 41 Chapitre 5 / Etapes précoces du développement embryonnaire..................................................................... 43 1. Résumé................................................................................................................................................ 43 2. Mise en place des axes embryonnaires............................................................................................... 43 2.1 La rotation corticale................................................................................................................................ 44 2.2 La rotation corticale relocalise des déterminants maternels dorsalisant............................................... 44 2.3 Expérience de la translocation des facteurs dorsalisants depuis le pôle végétatif vers le future côté dorsal............................................................................................................................................................. 44 2.4 Expérience de l’importance du réseau de microtubule au pôle végétatif de l’œuf pour la rotation corticale......................................................................................................................................................... 45 2.5 Les facteurs dorsalisants spécifient le côté dorsal en activant localement la voie de signalisation Wnt/...................................................................................................................................................................... 45 3. Spécification des feuillets embryonnaires................................................................................................ 46 3.1 Rappel : Carte des territoires présomptifs de la blastula tardive de xénope.......................................... 46 3.2 L’endoderme et l’ectoderme sont spécifiés par des déterminants maternels cytoplasmiques............. 46 3.3 Formation du mésoderme sous l’influence de signaux........................................................................... 46 3.4 Expérience démontrant que les cellules dorsales et ventrales de l’endoderme la blastula de xénope ont des propriétés inductrices différentes.......................................................................................................... 47 3.5 L’expression zygotique de signaux inducteurs de la famille des TGF-b est responsable de l’induction du mésoderme............................................................................................................................ 48 3.6 Résumé de l’induction du mésoderme................................................................................................... 48 4. Rôle et mode d’action de l'organisateur dans la construction de l’embryon........................................... 49 4.1 Démonstration que l’organisateur joue un rôle dorsalisant................................................................... 49 4.2 « Nouveau » modèle : des signaux de type TGF-b à activité ventralisante............................................. 49 4.3 Modèle actuel simplifié de fonctionnement de l’organisateur............................................................... 50 4.4 Comment ont été identifiés ces facteurs de dorsalisation produits par l’organisateur ?....................... 50 4.5 Les facteurs produits par l’organisateur sont des protéines qui inhibent les signaux ventraux à l’extérieur de la cellule.................................................................................................................................. 51 4.6 L’induction neurale par inhibition des BMP est un mécanisme conservé évolutivement.............. 51 Chapitre 6/ Développement précoce de l’embryon de drosophile.................................................................. 52 3 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 1. Résumé................................................................................................................................................ 52 2. Cycle de vie et développement de la drosophile................................................................................. 52 2.1 L’embryon précoce de drosophile est un syncytium.............................................................................. 53 2.2 La cellularisation a lieu à la 13° division.................................................................................................. 53 2.3 La gastrulation de l’embryon de drosophile........................................................................................... 53 2.4 Premier et dernier stade larvaire............................................................................................................ 54 3. Gènes impliqués dans la mise en place des axes de polarité et la segmentation............................... 55 3.1 Bicoid et Nanos : déterminants de l’axe A/P........................................................................................... 55 3.2 Protéine maternelle Dorsal : Déterminant maternel ventral.................................................................. 55 3.3 Les gradients de gènes maternels spécifiant les axes A/P et D/V sont dus à des interactions pendant l’ovogenèse entre l’ovocyte et les cellules qui l’entourent.......................................................................... 55 3.4 Une cascade de gènes zygotiques assure en aval des gènes maternels la segmentation de l’embryon 56 4. Gènes impliqués dans la spécification de l’identité des segments (gènes architectes/homéotiques) : conservés dans tous les modèles animaux................................................................................................... 56 4.1 L’activité combinée des gènes Hox donnent une identité à chaque segment........................................ 57 4.2 Des changements d’expression ou de l’activité des Hox peut amener à des modifications évolutives du développement embryonnaire..................................................................................................................... 57 4.3 Contrairement à la drosophile, chez les mammifères, il y a aussi une colinéarité dans le temps.......... 58 4.4 Résumé.................................................................................................................................................... 59 4 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Chapitre 1 / Concepts de base 1. L’organisme se construit de manière progressive 2. Organismes pluricellulaires sont constituées de cell germinales et somatiques 3. Tous les embryons passent par el même stade de développement 3.1 Fécondation 3.2 Segmentation 3.3 Gastrulation 4. L’organogenèse Une fois que la structure en 3 feuillets et le plan d’organisation sont mis en place les ⊄ vont interagir et s’organiser pr constituer des groupes de ⊄ progénitrices (primordia ou ébauche) à l’origine des ≠ tissus et organes. La plupart des organes sont composites, càd qu’ils sont constitués de ⊄ provenant de feuillets ≠. 4.1 Neurulation Neurulation = 1ère étape de l’organogenèse durant laquelle se met en place le neurectoderme, formant initialement la plaque neurale, à l’origine du système nerveux central (CNS). → Stade neurula : De part et d’autre de la plaque, on a les bourrelets neuraux qui vont se rapprocher et se souder (ds la région troncale, puis progresse vers région post et + lentement vers région céphalique : l’embryon s’allonge) sur le plan médian pr former le tube neural. Rem : Les cellules de la crête neurale se détachent de la partie dorsale du tube neural, elles sont à l’origine du système nerveux périphérique et des cellules pigmentaires. → Stade bourgeon caudal : ici les différentes structures caractéristiques des vertébrés sont mises en place : tube neural, notochorde, somites, endoderme et arcs branchiaux. Le stade bourgeon caudal est le stade phylotypique (IMPORTANT) = stade où un max de similarité est observé entre les espèces d’un même phylum. Ce stade a été découvert par Von Baer. Von Baer a conclu qu’au cours de l’ontogenèse, les caractères généraux des animaux appartenant à un même phylum apparaissent en 1er puis les caractéristiques spécifiques apparaissent ds un 2 ème temps. Ensuite on s’est demandé si au niv moléculaire c’était la même chose ? Oui. 4.2 Le stade phylotypique souligne l’origine évolutive commune des organismes (fin p 7) Pex : les arcs pharyngiens sont des structures embryonnaires transitoires qui donneront par la suite diverses structures différentes, en fonction des espèces de vertébrés. Les mêmes cellules donneront les branchies et l’os hyomandibulaire chez les poissons, l’os quadrate et l’articulaire chez les reptiles, des os et du cartilage du cou et de l’oreille moyenne chez les mammifères : ce sont des structures homologues, càd qu’elles ont une origine évolutive commun. Stade têtard : la queue s’est développée, une bouche apparait à l’avant de l’embryon et le système digestif devient fonctionnel : la glande adhésive disparait progressivement et le têtard se nourrit de manière autonome. Lorsque le vitellus est entièrement consommé, le têtard devient transparent. L’allongements de l’embryon est lié à la production de métamères (segments ou somites) à partir d’un réservoir de cellules progénitrices maintenu (non-utilisé) pendant une certaine période de l’embryogenèse (mésoderme présomitique). Chez la plupart des espèces, la métamérisation est séquentielle (sauf chez la drosophile ou tous les segments sont spécifiés en même temps). 5 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 5. Métamorphose La larve de xénope subit une métamorphose pour devenir un juvénile qui doit croître pour devenir un adulte sexuellement mature, qui vit +/- longtemps, se reproduit, entre ensuite en sénescence (processus de ralentissement de l’activité) avant de mourir. Chez le xénope, la métamorphose implique des changements importants selon une séquence temporelle bien précise : les quatre pattes apparaissent avant que la queue ne régresse. - Milieu aquatique → Milieu terrestre - Respiration branchiale→ Respiration pulmonaire - Herbivore → Carnivore 5.1 Des expérience de marquage permettent de révéler quelles cellules de l’embryon donnent naissance aux structures de l’adulte 1ère expérience : Marquages de petits grps de cellules à l’aide de colorants alimentaires Chez le xénope, si on veut suivre le destin d’un petit groupe de cellules à court terme, on peut appliquer à la surface des cellules des colorants vitaux, qui ne diffusent pas trop autour de la zone intentionnellement marquée. Un jour ou deux après, cette peinture ornera les cellules issues de la prolifération et de la migration de la/les cellule(s) marquée(s). De cette manière, en appliquant le colorant sur des territoires définis de l'embryon, W. Vogt a pu visualiser les mouvements morphogénétiques de la gastrulation. 2ème expérience : Marquages de cellules isolées par injection intracellulaire de composés fluorescents Cette technique s’utilise chez les espèces où les cellules de l’embryon (blastomères) sont de tailles suffisamment importantes. Les composés injectés peuvent être : - Grosses molécules inertes (dextran) couplées à des groupements fluorescents (rhodamine, fluorescéine, …) ; - ARNm codant pour des protéines fluorescentes (GFP, RFP, …) ; - Protéines (peroxydase) pouvant être révélées avec un substrat (benzidine). En cumulant les résultats de différentes expériences de lignage, on peut, pour un embryon à un stade donné de son développement, établir une carte de destinée ou des territoires présomptifs qui indique le devenir des cellules des différentes régions de l’embryon. 6 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 3ème expérience : Marquages de territoires embryonnaires via la réalistation d’animaux chimériques Chimères intrspécifiques : Chez le xénope, on peut remplacer un fragment d’embryon par un fragment équivalent d’un autre embryon de xénope, préalablemnt maequé à la GFP. Chimères interspécifiques : Chez le poulet, on fait la même manip ms en prélevant le fragment sur un embryon de caille. La coloration de l’ADN des co- cultures de tissus de poulet et de caille révèle une nette différence entre les deux espèces : les noyaux des cellules de caille présentent une masse volumineuse d’hétérochromatine associée au nucléole, absente dans les cellules de poulet. Pour suivre la migration des cellules de la crête neurale, et pour identifier leurs dérivés, on remplace des fragments définis du tube neural de l’embryon de poulet par l’équivalent provenant d’un embryon de caille au même stade de développement. La coloration de Feulgen, qui met en évidence l’hétérochromatine chez la caille, permet de visualiser la migration cellulaire. Aujourd’hui, cette coloration est substituée par un immunomarquage : on utilise un anticorps qui reconnait un antigène commun à toutes les cellules de la caille mais qui ne se trouve pas chez le poulet (QCPN, Quail non Chick PeriNuclear antigen). Les cellules de la crête neurale quittant le tube neural = cellules multipotentes car elles donnent naissances à divers choses (cellules nerveuses et endocriniennes…). Les cellules de la crête neurale encéphalique donnent des cellules osseuses, cartilagineuses, musculaires et des cellules du tissu conjonctif. 4ème Expériences de lignage cellulaire par marquage génétique chez les souris On utilise la technique des gènes rapporteurs : on utilise le promoteur d’un gène d’intérêt, dans une cellule d’intérêt, pour y placer l’expression d’un gène rapporteur (ex : GFP) sous son contrôle. Mais pour pouvoir suivre l’entièreté d’une lignée cellulaire, il faudrait trouver un gène qui s’exprime à tous les stades de développement… ce qui n’existe pas à cause de la différenciation cellulaire. → Comment faire pour que le gène rapporteur soit exprimé de façon permanente ? Ces expériences de lignage cellulaire sont réalisées à l’aide de la recombinase CRE, une enzyme du bactériophage P1 qui reconnait des sites spécifiques (LoxP) dans l’ADN. Dans le cas où deux sites LoxP sont dans le même sens, la recombinase induit l’excision du fragment d’ADN situé entre ces deux sites. Pour marquer spécifiquement de manière stable les cellules d'intérêt et les cellules qui en dérivent, un système de 2 souris transgéniques est utilisé. Une 1ère lignée de souris exprime la CRE recombinase, ss le contrôle d’un promoteur spécifique di tissus d’intérêt. (ex : le gène Wnt1 est exprimé spécifiquement dans les cellules de la crête neurale, de manière transitoire au moment de leur sortie du tube neural (bleu = transcription active du gène)). 7 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Une 2ème lignée de souris contient un gène rapporteur (ex : β-galactosidase = LacZ). Celui-ci est inactif car séparé de son promoteur par une séquence induisant l’arrêt de la transcription (cassette stop = polyadénylation), flanquée de deux sites LoxP. Souvent, le gène rapporteur est inséré dans le locus ROSA26 (R26R) contenant un gène non-essentiel exprimé ubiquitairement (c’est-à-dire par toutes les cellules de la souris). → Les deux lignées de souris sont croisées : les embryons issus de ce croisement présentent des cellules (ex : de la CN) qui expriment la CRE recombinase. Par conséquent, la cassette stop est excisée et le gène lacZ est exprimé de manière permanente dans les cellules ciblées et leur descendance. Chez les souris issues du croisement Wnt1-CRE/R26R, la CRE excise la cassette stop dans les cellules progénitrices de la CN qui expriment Wnt1.  Toutes les cellules qui expriment Wnt1 et celles qui en dérivent (où Wnt1 est éteint) sont LacZ+. La recombinase est exprimée uniquement dans les cellules de la crête neurale (sous le contrôle du promoteur de Wnt1), donc seules ces cellules-là pourront exprimer le gène rapporteur de façon constante. La β-galactosidase est révélée grâce à la coloration X-gal. 6. Nouvelles approches du marquage génétique pour visualiser le destin des cellules individuelles Pr différencier des cellules adjacentes ds un tissu, il faut qu’elles soient colorées différemment → Elles doivent exprimer aléatoirement des combinaisons de protéines fluorescentes. Fonctionnement ? Comment ça fonctionne ? La lignée de souris Brainbow-1.1 présente un système avec 4 rapporteurs fluorescents différents, séparés par des sites LoxP et en aval d’un même promoteur ubiquitaire (CMV). Les cellules de cette lignée de souris la OFP et sont donc orange. Si des souris Brainbow-1.1 sont croisées avec des souris exprimant la CRE recombinase dans un tissu donné, les sites LoxP de la descendance seront recombinés au hasard (dans les tissus qui expriment la recombinase). Il y a variation des sites LoxP (qui vont deux par deux), ce qui permet une expression de couleur aléatoire. Après recombinaison, c’est le gène rapporteur (marqueur) situé directement en aval du promoteur qui est exprimé. On obtient ainsi des embryons pouvant exprimer l’une des quatre protéines fluorescentes du système. Comment faire pour avoir plus que 4 couleurs ? → En utilisant des lignées de souris transgéniques « Brainbow » qui contiennent plusieurs copies du système de rapporteur à trois couleurs. Avec trois copies du système, on peut obtenir jusqu’à 10 couleurs différentes, les couleurs de chaque copie étant « mixées ». 8 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Chapitre 2 / L’embryologie expérimentale Embryologie expérimentale = explore les mécanismes qui coordonnent le développement. La démarche de l’embryologie expérimentale est de perturber le développement normal : les effets, produits par des perturbations expérimentales sur un système vivant, devraient fournir des informations sur les mécanismes du développement. Les débuts de l’embryologie expérimentale sont liés à la tératologie = étude des anomalies congénitales spontanées (2 à 5% des naissances). Exemples : - « Monstres » doubles, complets ou incomplets (jumeaux siamois) ; - Anencéphalie : absence totale ou partielle de l’encéphale, du crâne et du cuir chevelu suite à une absence de fermeture du tube neural ; - Holoprosencéphalie : malformation congénitale du cerveau et de la face, avec une séparation incomplète des deux hémisphères cérébraux, et parfois des yeux (cyclopie). 1. Les pionniers de la tétralogie expérimentale Les premières expérimentations sur embryons ont eu pour but de démontrer que des anomalies congénitales peuvent être dues à des facteurs environnementaux. → Isidore Geoffroy Saint Hilaire, un pionnier de l’embryologie expérimentale → Son but était de démontrer que des anomalies congénitales pouvaient être dues à des facteurs de l’environnement → a fait des expériences sur des embryons de poulet en leur faisant subir différents traitements (modificat° de la T° d’incubat° de l’œuf, secousses...) → observa un certain nbre de poussins av anomalies. → En 1931, Etienne Wolff tente de causer une cyclopie (=malformat° bien définies) en détruisant des territoires précis de l’embryon de poulet, à l’aide d’un fin faisceau de rayons X→ observe que l’irradiation de l’ébauche neurale, située entre les territoires destinés à former les yeux, bloque le développement de la partie la plus antérieure du cerveau → les yeux protégés de l’irradiation se rejoignent pour n’en faire qu’un, ou sont très rapprochés et situés dans une seule orbite → c’est donc un blocage du développement de la partie médiane du cerveau antérieur qui est à l’origine de la cyclopie. 2. Des facteurs de l’environnement peuvent induire des malformations fœtales Disruptions : anomalies de développement causées par des facteurs de l’environnement. Tératogènes : agents de l’environnement qui peuvent altérer le développement (agents chimiques, physiques ou biologiques). Exemple de tératogènes : − Certains médicaments se sont avérés être tératogènes : la thalidomide était un médicament contre les nausées prescrit aux femmes enceintes dans les années 1960 → il s’est avéré qu’il induisait des anomalies de développement importantes, en particulier au niv de la croissance des membres. − Certains pesticides (DDT) ou autres molécules (BPA) causent des disruptions en agissant comme perturbateurs endocriniens (antagonistes ou agonistes), et sont responsables d’anomalies du développement du système reproducteur, de problèmes de fertilité, de cancers, … Un perturbateur endocrinien va mimer ou bloquer l’action de certaines hormones. − L’alcool, l’excès ou le manque de vitamine A (acide rétinoïque), les métaux lourds, les agents pathogènes, … sont également des tératogènes. 9 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 2.1 Facteurs environnementaux qui constituent des paramètres essentiels du développement normal 1- Gravité Gravité = 1ère source qui organise l’embryon dans les 3 dimensions de l’espace + ds l’œuf d’amphibien, elle définit la polarité pôle animal – pôle végétatif, un axe qui préfigure l’axe antérieur – postérieur de l’embryon. → L'œuf d’embryon d’amphibien est polarisé, mais celui-ci ne préfigure pas exactement un axe embryonnaire. Ce n'est qu'au moment de la fécondat° que le cytoplasme de l'œuf devenu embryon unicellulaire est réarrangé. Ce réarrangement est en partie guidé par la gravité qui agit sur le cytoplasme cellulaire dont la densité n'est pas homogène. C’est également le cas chez le poulet : Au cours de la progression de l’embryon dans l’oviducte, l’œuf subit un mouvement de rotation (1 tour/ 6 minutes) dû à des contractions musculaires de la paroi de l’oviducte. L’intérieur de l’œuf, qui est relié à la coquille par des chalazes, suit également le mouvement de rotation. En raison de sa densité plus faible et de la gravité, l’embryon qui a tendance à se maintenir dans la zone supérieure de l’œuf est légèrement incliné au cours de ce mouvement de rotation à cause du vitellus (car lourd) qui s’incline en permanence → c’est cette inclinaison qui déterminera l’axe A/P, le côté le plus élevé correspondant au futur côté postérieur de l’embryon. 2- La température ⇒ Chez certaines espèces, elle contrôle le déterminisme sexuel en influençant l’activité/l’expression d’une enzyme : l’aromatase converti la testostérone en œstrogène. 3- Hormones et dimorphisme sexuel ⇒ Chez la bonellie, un ver marin fréquent en méditerranée, le sexe est également déterminé par l’environnement → le mâle et a femelle présentent un dimorphisme sexuel très marqué : le mâle est minuscule, néoténique, et vit ds corps de la femelle… il ne sert que d’organe reproducteur. Les larves de bonellie nagent en pleine eau avant de tomber sur le fond, où elles évolueront en femelles. Celles qui se trouvent par hasard à côté d’une femelle adulte sont aspirées, migrent vers les gonades et deviennent des mâles sous l’influence des hormones de la femelle. 4- Plasticité développementale (phénotypique) Plasticité phénotypique : Capacité d’un organisme à exprimer des phénotypes légèrement différents à partir d’un même génotype, selon les conditions environnementales. Polyphénisme : un seul génotype produit deux ou plusieurs phénotypes discrets, à la suite d’un signal environnemental. - Araschnia levana (papillon européen) : la plasticité phénotypique est liée à la T° et à la longueur du jour ; - Nemoria arizonaria (papillon de nuit) : le phénotype est lié à la nourriture. Les chenilles de printemps sont brunes et portent des excroissances qui les font ressembler aux chatons des arbres (les protégeons donc des prédateurs), les chenilles d’été se nourrissent de feuilles plus verdâtres et ressemblent ainsi à des brindilles ; - Daphnie : elle change de forme en fonction des saisons (av ou ss casque), de façon liée à la présence de substances chimiques (pex kairomones) produites par les prédateurs ; - Criquet : des stimuli physiques perçus par l’animal (contact des pattes, vue, odeur, …) vont déterminer deux formes. L’une est sédentaire (ailes courtes), l’autre est migratrice (ailes longues). 10 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 3. Des facteurs à l’intérieur de l’embryon contrôlent la différenciation 3.1 Deux expériences décisives vont poser les bases des 2 grands mécanismes intrinsèques au développement. 1 ère expérience (W. Roux) : 1) Ds un embryon d’amphibien au stade 2 cellules, le chercheur détruit, au moyen d’une aiguille portée préalablement à la flamme, 1 des 2 blastomères. 2) Il observe que la cell touchée dégénère et que l’autre se divise, donnant ainsi un demi-embryon. La cellule tuée devait donc contenir l’information permettant de former la partie gauche et la cell droite de faire la partie droite. → Développement mosaïque (ou spécification autonome) : chaque cellule de l’embryon contient, dès le départ (stade zygote), les informations nécessaires pour orienter son devenir. Ces informations sont appelées des déterminants. Théorie de la détermination nucléaire de weismann (1880) : Selon Weismann, les déterminants devraient être nucléaires : Au cours des divisions successives, ces déterminants sont répartis dans les cellules filles de manière asymétriques générant donc des cell distinctes les unes des autres. Les cell somatiques ne retiennent qu’une partie des déterminants nucléaires présents dans l’œuf, seules les cell germinales garderaient l’entièreté des déterminants (d’où la « théorie du plasma germinal »). → Cette explication est mauvaise car comme ds le génome on a répli semi-conservatif donc on ne perd rien + Il a été prouvé que les déterminants ne sont pas dans le noyau mais dans le cytoplasme. 2ème expérience (H.Driesch) : 1) Dans un embryon d’oursin, le chercheur sépare les 1ère cellules et observe un résultat inverse à celui de la 1ère expérience. 2) Observe que chaque blastomère isolé forme un embryon entier. → Développement régulatif : chaque cellule est capable de compenser l’absence des autres et de former un embryon complet. Un dév de type régulatif implique donc que le potentiel de différenciation des cellules est plus grand que ce que révèle leur destinée, que les cellules sont déterminées plus tardivement que ds la stratégie opposée de développement mosaïque → On parle aussi de spécification conditionnelle car les cellules se développent en fonction des autres = les cellules communiquent entre-elles. 11 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Conclusion : Les résultats contradictoires de W. Roux et H. Driesch peuvent s’expliquer par les différences de protocoles utilisés. Dans le cas de la 1ère expérience, la cellule tuée reste en contact avec l’autre cellule : ce contact va empêcher toute une série de processus de se dérouler normalement (= artefact expérimental). → Expérience de Spemann (1903) : deux blastomères d’un embryon d’amphibien sont totalement séparés à l’aide d’une boucle de cheveux, ce qui génère deux têtards normaux. 3.2 Le développement pourra être mosaïque ou régulatif selon les espèces et/ou les processus développementaux considérés. L’ascidie est un protochordé (la larve présente une chorde mais pas l’adulte) dont le développement précoce (de base) est de type mosaïque. → Si on établit une carte de destinées d’un embryon au stade 8 cellules, on constate que chaque blastomère isolé donne les mê cellules que s’il était resté en place. → De plus, les tissus qui auraient dû être formés par ces mêmes cellules manquent à l’organisme. Les blastomères B4.1 sont à l’origine des muscles → Si on les élimine, aucun muscle n’est détecté dans l’embryon amputé. Le destin des cellules est fixé par les déterminants distribués de manière asymétrique dans l’œuf. → Si on transfère du cytoplasme des blastomères B4.1, contenant le déterminant Macho, dans d’autres blastomères, ceux-ci donneront naissance à des cell musculaires. 3.3 La différenciation cellulaire est un processus progressif qui se réalise par étapes L’acquisition de caractéristiques spécifiques par les cellules spécialisées est précédée par une phase d’engagement (« commitment »), où le destin de la cellule est déjà restreint bien que celle-ci ne soit pas encore différenciée. Lors de cette phase d’engagement, la cellule va passer par 2 stades : 1- Spécification : l’engagement de la cellule est encore réversible 2- Détermination : l’engagement de la cellule est irréversible (dans un contexte de développement normal). Ces deux stades ont été définis sur base de manipulations embryologiques. 1- Une cellule est dite spécifiée lorsque celle-ci est capable de se différencier de manière autonome, même si on la sort de l’embryon et qu’on la maintient dans un milieu « neutre ». Les différentes régions de la blastula tardive de xénope peuvent être disséquées et cultivées dans un milieu salin simple, afin de tester leur état de spécification à ce stade de développement. - Les cellules du pôle animal sont spécifiées à former de l’épiderme ; - Les cellules de la région équatoriale sont spécifiées à former du mésoderme (essentiellement ventral) ; - Les cellules du pôle végétatif sont spécifiées à former de l’endoderme. On peut ainsi construire une carte de spécification des territoires, et la comparer à la carte des destinées : - Les cellules dorsales de l’hémisphère animal ne sont pas encore spécifiées à former du tissu neural, leur différenciation est encore dépendante de signaux de l’environnement. Elles pourront se différencier de manière autonome et irréversible au stade neurula. - Les cellules de la région équatoriale ne sont pas encore spécifiées à former des somites. 12 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 2- Une cellule est dite déterminée lorsque, transplantée dans une autre région de l’embryon (environnement non-neutre), elle est capable de se différencier de manière autonome.  Ds une gastrula jeune : si on transplante un morceau de tissu de l’hémisphère animal dorsal (destiné à former du tissu neural), les cellules s’adaptent à leur nouvel environnement et donnent de l’épiderme. → Les cellules de l’ectoderme dorsal de la jeune gastrula sont encore indéterminées (différenciation dépendante).  Gastrula tardive : les mê cellules transplantées dans l’épiderme ventral vont se différencier en tissus nerveux, de manière insensible à leur nouvel environnement. → Elles sont déterminées à former le syst nerveux. 3.4 Déterminants cytoplasmiques Déterminants cytoplasmiques = ds la stratégie de développement mosaïque, ce sont des déterminants cytoplasmiques distribués de manière inégale dans la cellule qui au cours de la division déterminent le destin des cellules-filles et donc permettent cette différenciation cell. → La notion de déterminant cytoplasmique est étroitement liée à la notion de polarité cellulaire et de division asymétrique. La polarité peut être intrinsèque, c’est-à-dire liée à la position du noyau et du centrosome, ou extrinsèque, c’est-à-dire due à l’entrée du spermatozoïde, à un contact physique avec une autre cellule et/ou avec la membrane basale, … De nbreuses molécules impliquées dans la mise en place de la polarité cellulaire ont été identifiées indépendamment chez différents modèles d’études. Dans tous les cas, la localisation précise de ces protéines est essentielle à leur fonction. Les divisions peuvent être symétriques ou asymétriques, en fonction de l’orientation du fuseau mitotique par rapport à la polarité de la cellule. Les divisions asymétriques entrainent une répartition différentielle des déterminants → elles sont impliquées au début du développement embryonnaire pour créer de la diversité entre les cellules, mais elles interviennent aussi dans des processus plus tardif (neurogenèse) ainsi que chez l’adulte. Exemple : premières divisions de Caenorhabditis elegans Des divisions asymétriques successives permettent la ségrégation de déterminants dans la cellule la plus postérieure (p3), à l’origine de la lignée germinale. Les déterminants (granule p) des cellules germinales vont s’accumuler dans la cellule p1 de l’embryon : ces granules, d’abord distribuées de façon homogène dans l’œuf et sont transloquées lors des divisions successives du zygote dans des cell spécifiques (P1-P4). 3.5 Définition et nature des déterminants Déterminant = lors d’une division asymétrique, un déterminant est une molécule reçue différentiellement par les cellules – filles et qui détermine le devenir de la cellule qui la reçoit. Un déterminant est localisé, nécessaire et suffisant. →Il peut s’agir de protéines ou d’ARNm, ce sont souvent des facteurs de transcription ou des molécules permettant leur synthèse. 13 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Localisation des déterminants : - Accumulation progressive par diffusion différentielle des molécules (granules P) ; - Ancrage des molécules à la membrane plasmique ; - Transport des molécules le long du réseau polarisé de microtubules ; - Dégradation des molécules à l’un des deux pôles de la cellule ; - Contrôle local de la traduction ; - … Exemples 1: Démonstration de l’existence de déterminant du destin cellulaire dans le cytoplasme des cellules 1. L’ARNm codant pour le facteur de transcription Macho, un déterminant des cellules musculaires. Les cellules B4.1 (jaune) de l’ascidie, qui sont à l’origine des muscles, contiennent un ARNm maternel codant pour le FT « Macho ». 2. Si on insère cette ARNm (se trouve ds cytosol partie rouge de la B4.1) dans une autre cellule (Cell B4.2 en bleu) , la destinée de celle-ci changera et elle deviendra une cellule musculaire. Exemple 2 : 3. L’ARNm Bicoïd code pour un facteur de transcription et est localisé au pôle antérieur de l’ovocyte de drosophile. Lors de la fécondation, il est traduit en protéine. 4. En absence de Bicoïd, la partie antérieure de l’embryon (incluant la tête) ne se forme pas. Ce déterminant est donc nécessaire pour former la partie antérieure. 5. Si on transplante du cytoplasme de la partie antérieure et/ou de l’ARNm Bicoïd et/ou la protéine Bicoïd dans une autre partie de l’embryon, une tête se formera alors à cet endroit : Bicoïd est suffisant pour former la tête. ⇒ Ces trois caractéristiques (localisé, nécessaire et suffisant) permettent de définir Bicoïd comme un étant un déterminant. 3.6 Communication cellulaire Les cellules sont en contact les unes avec les autres, et elles peuvent aussi communiquer par l’intermédiaire de signaux extracellulaires qui vont potentiellement changer leur comportement. Induction : changement de comportement lié à la réception d’un signal extracellulaire. L’induction se retrouve dans tous les processus d’organogenèse. 14 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Mais comment une cellule est compétente ? Ca dépend de son identité Rem : cô on a peu de signaux, on n’a pas 1 signal pr 1 cellule donc ça dépend pas juste du signal !! Découverte du phénomène d’induction : expérience de greffe de Spemann But : Evaluer l’état de détermination des différentes régions de la gastrula de la salamandre, en réalisant des expériences de transplantation. La lèvre blastoporale (qui donnera la chorde) est-elle déjà déterminée au stade gastrula donc on veut savoir à quel moment ça se passe ? 1) La transplantation de la lèvre blastoporale, d’une jeune gastrula vers un site ventral d’un embryon hôte au même stade, provoque l’apparition d’embryon « siamois » : 2 têtes ac 2 faces dorsales opposées réunies en un ventre commun. 1ère conclusion : Spemann interpréta initialement ce résultat comme étant la preuve qu’au stade jeune gastrula, les cellules de la lèvre blastoporale sont déjà déterminées à donner des structures dorsales. Il pensait que tout l’embryon secondaire dérivait du tissu greffé et qualifia la lèvre blastoporale de « centre de différenciation des organes axiaux ». Problème : comment distinguer les cellules greffées des cellules de l’hôte, étant donné que cette expérience a été réalisée entre tritons de la même espèce ? 2) Spemann décida alors d’utiliser comme donneur et receveur des tritons d’espèces différentes, l’une ayant des œufs pigmentés et l’autre non. 3) Résultats : les cellules greffées n’interviennent que dans la formation de l’axe embryonnaire secondaire (chorde). Ce sont les tissus ventraux de l’hôte qui sont réorientés et fournissent la majeure partie du deuxième embryon. 4) La lèvre blastoporale a induit les cellules du côté ventral de l’hôte à former des structures différentes de celles qu’elles étaient censées former. → Ceux dérivant des cellules greffées donnent la chorde 15 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 → Par contre, les cellules de l’ectoderme ventral vont alors donner du tissu neural, les cellules du mésoderme ventral vont participer à la formation des somites ???? 2ème conclusion : La lèvre blastoporale est une structure inductrice : ce processus est qualifié d’induction primaire pour souligner son importance dans le développement. Spemann va qualifier la lèvre blastoporale de centre organisateur parce qu’elle ne produit pas d’amas chaotiques, mais qu’elle organise autour d’elle la formation d’un embryon entier. 3.7 Différents types de signaux sont utilisés par les cellules pour communiquer ⇒ On a des signaux normaux et des signaux se nommant morphogenèse (+ important). Qu’est-ce qui distingue les morphogenèses des signaux normaux ? Les morphogenèses donnent le plan d’organisation de l‘embryon. → Mais comment les cellules vont-elles savoir comment s'organiser du coup ? Si le signal est émis de manière localisée (organisateur) et diffuse de manière limitée, il forme un gradient de concentration. En évaluant la concentration locale du signal à laquelle elles sont soumises, les cellules peuvent « mesurer » la distance qui les sépare de l’organisateur et acquérir des destinées différentes. → On a donc le modèle du drapeau français qui a été proposé : Un signal qui permet aux cellules d’acquérir une information de position et se différencier différemment en fonction de seuil de concentration est qualifié de morphogène. Ceux-ci constituent de très bons moyens d’organiser l’espace, d’établir le patron de l’embryon. 16 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Expériences de Morgan sur les planaires : Origine du concept de morphogène 1) Lorsque l’on coupe transversalement une planaire en trois morceaux, le morceau intermédiaire régénère une tête à partir de son bord antérieur et une extrémité caudale à partir de son bord postérieur : il y a une polarité A/P. 2) Si le fragment intermédiaire devient trop petit, la régénération peut se faire de manière anormale (ex : deux têtes). → Il y aurait un ou des gradients de morphogènes qui donnent une information de position aux cellules se trouvant à l’intérieur du champ morphogénétique (ensemble des cellules contrôlées par un morphogène). Conclusion : Ce sont donc des substances essentielles pour la régénération de la planaire. De nombreux signaux peuvent fonctionner comme morphogènes et sont impliqués dans un grand nombre de processus de développement. Exemple 1 de morphogènes : Dans le tube neural en développement, 2 types de signaux aux gradients opposés sont responsables de la régionalisation dorso – ventrale. - Les signaux BMP et Wnts sont produits à partir de l’ectoderme de surface et du toit du tube neural ; - Les signaux « Sonic Hedgehog » (SHH) sont produits par la chorde et par le plancher du tube neural. Il diffuse dans la partie ventrale et fonctionne comme morphogène, induisant la différenciation de différentes populations neuronales (neurones moteurs, interneurones). Exemple 2 de morphogènes : La spécification des différents doigts des membres est contrôlée par un gradient de SHH, produit par la ZPA (« zone à activité polarisante »). Cette zone est située dans la partie postérieure de l’ébauche des membres. La greffe de ZPA dans la région antérieure du bourgeon d’aile conduit à une duplication en miroir du gradient de morphogène et donc des doigts. 17 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Chapitre 3 / Contrôle génétique du développement Naissance de la géné-que du développement à partir de la fin du XXe siècle (années 1970-80), sur base d’une série de découvertes. 1- Les cellules se différencient parce que les gènes sont exprimés de manière différentielle. 2- La régulation de l’expression génique s’exerce à toutes les étapes de l’expression d’un gène. Des ARN non codant interviennent aussi dans le contrôle de l’expression des gènes 3- L’état de compaction de la chromatine dépendant d’une série de modifications chimiques (modifications épigénétiques) contrôle l’expression des gènes. L’inactivation d’un des deux chromosomes X chez les mammifères et l’empreinte génomique constitue deux exemples d’hérédité épigénétique. 4- Le contrôle de la transcription implique des séquences d’ADN cis-régulatrices (promoteur, enhancer) et des protéines régulatrices (facteurs de transcription et cofacteurs) qui se lient à ces sites régulateurs. 5- L’organisation 3D de la chromatine intervient aussi dans le contrôle de l’expression des gènes. 6- Les gènes sélecteurs constituent une catégorie de gènes de développement responsables de l’étape de détermination des cellules. 7- L’activité génique d’une cellule peut être transmise à sa descendance grâce à la persistance de protéines régulatrices ou par le maintien des modifications de la chromatine. 8- Il existe 7 grandes familles de signaux dans le développement des vertébrés. 1. Les cellules se différencient parce que les gènes sont exprimés de manière différentielle. Les chercheurs disposent ojrd d’une palette d’outils pr étudier l’expression des gènes : - La RT-PCR : Si on use l’ADN on aura juste une idée de l’expression d’un gène alors que si on veut tt les gènes alors on use le séquençage de l’ARNm. - Single cell RNA-seq ou scRNA-seq : ojrd on peut séquencer avec des mini séquences et on va séparer les cell des unes des autres afin de les marquer individuellement 2. La régulation de l’expression génique s’exerce à toutes les étapes ✓ Transcription ✓ Maturation (épissage...) des ARNm ✓ Transport/dégradation et traduction des ARNm ✓ Maturation/dégradation des protéines 2.1 L’épissage des ARN issus de la transcription constitue aussi une étape importante de l’expression des gènes Petit rappel sur la maturation différentielle et export des ARNm : Dans le noyau, l’ARNm primaire doit subir une série de modifications : Addition d’une méthylguanosine (CAP) en 5’, addition d’une queue poly-A en 3’ et épissage. Ces modifications vont, avec d’autres motifs internes souvent localisées dans les 3’ – UTR (« UT rich elements »), déterminer la stabilité des ARNm. Les ARNm maturés sont ensuite exportés vers le cytoplasme, un export qui est sélectif (contrôle de qualité). L’épissage différentiel (ou alternatif) des gènes permet de produire plusieurs protéines (isoformes) différentes à partir d’un même gène. 92% des gènes chez l'homme sont épissés de manière différentielle, ce qui augmente de manière dramatique la complexité du protéome. 18 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Exemple de l'importance de l’épissage différentiel ds le développement : Ex 1 : la détermination du sexe chez la drosophile La drosophile utilise le même système hétérogamétique que l’Homme (XX/XY), mais, contrairement à l’humain où le Y porte les gènes de différenciation des mâles, le chromosome Y n’intervient pas dans la détermination du sexe dans le cas de la drosophile. → C’est le nombre de chromosomes X qui est important : un gène se trouvant sur ce chromosome est plus ou moins dosé avec le nombre de chromosomes X et détermine le sexe de l’individu. - XY ou XO = mâle (les individus XO sont cependant stériles car certains gènes nécessaires à la fertilité se trouvent sur le chromosome Y) ; - XX ou XXX ou XXY = femelle Les drosophiles présentent 4 chromosomes : une paire de chromosome sexuel, trois paires d’autosomes. Chez les femelles, certains gènes présents en double dose seront exprimés suffisamment que pour activer l’expression d’une cascade de gènes : sex lethal (Sxl) et transformer (Tra) sont des protéines qui peuvent lier les pré-ARNm et contrôler leur épissage. → Ces gènes sont activés chez la femelle, inhibés chez le mâle. L’expression différentielle de ces protéines aboutis à la production d’isoformes différents d’un facteur de transcription (doublesex, Dsx) : en fonction du sexe considéré, ce FT aura des propriétés activatrices différentes et mènera à la formation d’un mâle ou d’une femelle. Ex 2 : chez la souris Le gène myostatin code pour un facteur de croissance de la famille des TGF-β, qui limite la croissance des muscles. Des mutations ont été identifiées : elles causent la création de nouveaux sites d’épissage dans le 1er intron, ce qui entraine la formation d’une protéine tronquée et l’induction d’une hypertrophie musculaire. → Origine de la race de bovins blanc-bleu-belge. 2.2 Contrôle de la traduction des ARNm La traduction est réalisée dans le cytoplasme par des complexes nucléoprotéiques : les ribosomes. L’accessibilité des ARNm aux ribosomes est régulée par les extr 3’ et 5’ : des protéines (facteurs) se lient à la coiffe (eI4E, eI4G, …) et à la queue poly-A (PABP). L’interaction de l’ARNm avec ces protéines favorise le recrutement de la petite sous-unité du ribosome, et donc l’initiation de la traduction. → Il n’est pas rare que certains ARNm soient produits mais non – traduits. Certains ne seront traduits qu’à un moment précis et/ou seront localisés uniquement dans certaines zones de la cellule. Exemple de contrôle ds le temps de la traduction des ARNm : Au cours de l’ovogenèse, l’ovocyte produit et stock des ARNm qui ne seront utilisés qu’à la fécondation, lors de la période de clivage (avant la MBT (transition blastuléenne, page 5)). 19 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 → Ce blocage de la traduction des ARNm maternels peut être réalisé si la coiffe en 5’ et/ou la queue poly-A en 3’ n’ont pas été ajoutées, et/ou si l’accessibilité à ces structures est bloquée. Ex : Dans l’ovocyte de xénope, la protéine Maskin bloque la traduction de nombreux ARNm. Elle lie la queue poly-A et bloque la formation du complexe protéique nécessaire au recrutement de la petite sous-unité. 2.3 Des ARN non traduits jouent un rôle important ds la régulation de la traduction Les miRNAs (= microARN) = sont de très courts ARN (21 – 22 nucléotides) qui, en s’appariant à une séquence complémentaire, bloquent la synthèse des protéines et/ou induisent la dégradation de l’ARNm. → Ils sont initialement produits à partir de précurseurs plus longs (pre-miRNA) qui forment des structures double brin en épingle à cheveux (les portions qui donneront des miRNAs matures sont en rouge). Quel est le mécanisme de synthèse des miRNAs ? 1) Les précurseurs des miARNs sont maturés par différents protéines (Droscha dans le noyau, Dicer dans le cytoplasme), pour finalement libérer un petit ARN double brin (duplex miRNA/miRNA). 2) Un complexe protéique appelé Risc (« RNA induced silencing complex ») va séparer les deux brins et utiliser l’un des deux comme guide, pour aller repérer les ARNm possédant des séquences complémentaires. → Si complémentarité partielle : blocage de la traduction 2.2 Contrôle post-traductionnel de l’expression des gènes Certaines protéines ne seront pas actives tant qu’elles n’auront pas subi certaines modifications qui vont affecter leur activité, leur durée de vie, … → Protéolyse, phosphorylation, acétylation, méthylation, glycosylation, lipidation, ubiquitination, pont disulfure, … Certaines protéines doivent être transportées vers un site bien précis de la cellule pour être fonctionnelles (membrane, noyau, lysosome, …) ; Certaines protéines doivent s’assembler avec d’autres pour former des unités fonctionnelles (ribosomes, spliceosomes, microtrubules, …). 3. La transcription des gènes est contrôlée par l’état de compaction de la chromatine La chromatine est constituée d’ADN et de protéines, histones et non histones. → L’unité fondamentale de la chromatine est le nucléosome, composé : d’ADN enroulé 2X autour d’un cœur protéique constitué de 8 histones (2 bde chacun des 4 types : H2A, H2B, H3 et H4). L’extrémité N-ter de chaque histone (queue de l’histone) pointant à l’extérieur du nucléosome → L’état de compaction de la chromatine est contrôlé par une série de modifications chimiques de la chromatine (= modifications épigénétiques) réalisées par un ensemble d’enzymes. 20 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 La chromatine fortement compactée qui empêche la transcription est appelée hétérochromatine, par opposition à la chromatine déroulée accessible à la machinerie transcriptionnelle et aux autres protéines régulatrices (euchromatine). → La 1ère modification épigénétique est dû à la méthylation réalisée par des ADN méthylases (= enzymes qui méthylent les cytosines lorsque celles-ci sont suivies d'une guanosine (dinucléoCdes CpG)). Au niveau de certains sites de l’ADN. La méthylation de l’ADN est généralement associée à une répression transcriptionnelle. → La 2ère modification épigénétique est dû à l’acétylation d’histones (ex. : H3K27ac) est caractéristique de régions du génome où les gènes sont actifs. L’acétylation, en diminuant la charge positive des lysines, entraine un relâchement de la chromatine qui devient permissive pour la transcription. ✓ Les résidus lysines peuvent être mono-, di- ou tri-acétylés (ou méthylé) : le résultat global des modifications va définir si la transcription est activée et/ou inhibée. ✓ Les modifications se font sur des résidus spécifiques des extrémités N-terminales et/ou C-terminales des histones. ✓ Le patron de ces modifications d’histones associées à une région chromosomique donnée permet de prédire l’activité d’un gène (code épigénétique). ✓ Les modifications chimiques de la chromatine agissent sur sa structure en provoquant le recrutement de protéines qui reconnaissent les résidus modifiés (« readers ») et peuvent initier la formation d’hétérochromatine et donc favoriser la transcription. Les modifications de la chromatine est dû à 3 catégories d’enzymes 3 catégories d’enzymes : - Readers - Erasers - Writers ⇒ Les histones sont… - Acétylées par des acétylases (Writers) et déacétylées par des déacétylases (Erasers). - Méthylées par des méthylases (HMT = Histone méthyltransférase) et déméthylées par des déméthylases. → Ce sont toutes ces enzymes qui mettent en place et/ou effacent les marques épigénétiques. Les « Writers » peuvent être recrutés par des facteurs de transcription : ces protéines capables de lier l’ADN permettent une action ciblée dans certaines zones spécifiques du génome. 21 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 ⇒ A côté de enzymes pouvant ajouter et/ou retirer des groupements chimiques des histones et de l’ADN → il existe une 3ème classe de protéines (les Readers) qui reconnaissent les marques épigénétiques donc sont impliquées dans la maintenance de l’expression des gènes et modifient l’état de la chromatine, en permettant le recrutement des protéines effectrices (« writers », « erasers », …). Rem : toutes ces modifications sont instables et réversibles 3.1 Les profils de modification d’histones peuvent persister et être transmis d’une génération cellulaire à l’autre Est-ce que ces modifications sont stables ou disparaissent ? Ds certains cas, oui, elles sont stables. → La méthylation est une modification stable càd qu’elle peut être transmis de façon fiable au cours des divisions cellulaires. A chaque réplication de l’ADN, il y a des enzymes qui agissent au niveau des brins matrices déjà méthylés, et ajoutent des grpts méthyles au endroits correspondants sur le brin nouvellement synthétisé. Cette persistance et transmission des marques épigénétiques représente un mécanisme de contrôle de l’expression génique à long terme, une mémoire du statut transcriptionnel d’une région de l’ADN (mémoire ou hérédité épigénétique, cad qui n’impliquent pas la séquence nucléotidique en soi). Exemple d’hérédité épigénétique : Ex 1 : L’inactivation du chromosome X Chez les femelles mammifères (XX), un des deux chromosomes X est toujours inactivé (il est transformé en hétérochromatine). On parle de « mécanisme de compensation de dosage » : sans ce processus d’inactivation, les protéines codées par un gène situé sur le chromosome X seraient produites en deux fois plus grandes quantités chez les femelles que chez les mâles. Les embryons femelles mourraient alors très vite, intoxiqués par la double dose de protéines. → Le chromosome X inactivé est visible dans le noyau des cellules chez la femelle, c’est le corpuscule de Barr. Lieu du processus d’inactivation : Ce processus a lieu dans les cellules souches embryonnaires lors de l’implantation de l’embryon, est aléatoire. Ainsi, dans l’organisme femelle, une partie des cellules expriment les gènes du chromosome X d’origine maternelle, une autre partie expriment ceux du chromosome X d’origine paternelle. Le chromosome inactivé est maintenu dans cet état inactif dans toutes les cellules descendantes, tout au long de la vie de l’individu. L’inactivation n‘est pas irréversible puisque le chromosome X inactivé est réactivé dans la lignée germinale, au cours de la formation des gamètes femelles, contenant un seul chromosome X. 22 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Mécanisme : 1- Méthylation de l’ADN 2- Modifications des histones 3- Echanges d’histones (MacroH2A) 4- Longs ARN non codants= Xist est un lARNnc qui recouvre le chromosome et ce faisant contribue à son inactivation. 5- Recrutement de complexes de protéines « reader » (Polycomb repressive complex –PCR2) qui contribuent aux maintiens de l’état silencieux. ⇒ L'inactivation au hasard du chromosome X explique pourquoi tous les chats calico (roux et noir) sont des femelles ! Le gène pour la coloration des poils se trouve sur le chromosome X. Il y a 2 allèles, l’un donnant une couleur noire, l’autre orangée. Les mâles ne possédant qu’1 seul chromosome X et donc 1 seul allèle, seul les femelles, mosaïques, possédant les 2 allèles et n’exprimant qu’un des deux, peuvent donc présenter un pelage « calico ». Ex 2 : Empreinte génomique ou parentale (« genomic imprinting ») Empreinte parentale (marques épigénétiques) : mécanisme responsable de l’inactivation de certaines gènes ds le génome maternel ou paternel. Ceci permet ces différences entre génomes paternel et maternel. Certains gènes, dont une soixantaine a été identifiée aujourd’hui, sont marqués différemment : cela les conduit à une expression mono – allélique (où 1 des 2 allèles est inactivé) dépendante de l’origine parentale. Découverte de l’empreinte parentale : ⇒ Des expériences de transplantation nucléaire dans des de souris ont été réalisées pour obtenir des embryons dont le génome, 2N, est uniquement d’origine maternelle (gynogénotes) ou uniquement d’origine paternelle (androgénotes) → Ces embryons ne sont pas viables. La présence conjuguée de chromosomes d’origine, maternelle et paternelles, ayant des apports différents, est requise pour un développement normal de l’embryon. ⇒ L’existence de l’empreinte génomique est aussi révélée par l’observation que des mutations dont certains ont des effets différents suivant que la mutation affecte le gène d’origine paternelle ou maternelle. Le 1er gène identifié comme étant soumis à l’empreinte parentale est IGF2, un gène qui code pour un facteur de croissance dont seul l’allèle hérité du père est exprimé au cours du développement chez la souris. - Si une mutation touche l’allèle maternel (donc le gène IGF2 est exprimé normalement chez père), l’embryon se développe normalement - Si une mutation affecte l’allèle paternel, l’embryon présente un déficit de croissance. 23 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Chez l’Homme, la délétion de certaines régions chromosomiques incluant des gènes soumis à l’empreinte parentale donnera lieu à des syndromes différents, selon quel chromosome a été délété (maternel ou paternel). Syndrome de Prader- Willi : délétion du chromosome 15 paternel ; Syndrome d’Angelman : délétion du chromosome 15 maternel. Les chromosomes présentent des différences dans l’expression des gènes soumis à une empreinte parentale : on observe donc des phénotypes différents liés à la même délétion chromosomique. Où et quand a lieu l’empreinte parentale ? Certains gènes seront éteints spécifiquement, soit dans l’ovule, soit dans les spermatozoïdes en formation (gamétogenèse). Ces gènes éteints restent silencieux dans les cellules somatiques de l’embryon et de l’adulte. L’inactivation n‘est pas irréversible. C’est important puisque le gène inactivé peut se retrouver dans l’individu de la génération suivante dans des cellules germinales mâles ou femelles. Les empreintes sont effacées durant la formation précoce des cellules germinales primordiales (gris) puis rétablies au cours de leur différenciation. 3.2 Méthodes d’étude de l’accessibilité de la chromatine 1- Méthode DNAse-seq: L’accessibilité de la chromatine est mesurée grâce à la DNAse I, une enzyme qui digère les noyaux des cellules d’intérêt : elle coupe la chromatine là où elle n’est pas condensée. Les petits fragments d’ADN obtenus sont purifiés, amplifiés par PCR et séquencés. Les séquences obtenues sont alignées sur le génome de référence et leurs fréquences sont analysées : une fréquence élevée indique un ADN plus accessible et donc une région d’autant plus ouverte de la chromatine. En fonction du type de fragment d’ADN que l’on veut analyser, on peut utiliser diverses enzymes aux fonctions différentes. 2- Méthode ATAC-seq : Méthode ATAC-seq, ("Assay for Transposase-Accessible ChromaIn") = identifie les régions de la chromatine accessibles à une transposase (Tn5) in vivo. Les cellules sont perméabilisées pour permettre l'accès au noyau à la transposase. Celle- ci va couper l'ADN nu et y insérer des séquences définies d'ADN ("adaptateurs") au niveau du site d'intégration. Les petits fragments capturés entre deux "adaptateurs" peuvent alors être amplifiés par PCR et séquencés. 4. Le contrôle de transcription implique des séquences d’ADN cis- régulatrices et des facteurs de transcription Facteur de transcription = se lie à des régions « cis-régulatrices » du gène. Le site cible d’un facteur de transcription est une courte séquence de nucléotides reconnue spécifiquement par la protéine. 24 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 → Les facteurs de transcription sont classés en fonction du motif de liaison à l'ADN. → Certains sont exprimés dans tous les types cellulaires (facteurs généraux), d’autres sont exprimés dans un seul type (facteurs tissu-spécifique). Ils ont une structure modulaire. 4.1 Régions cis-régulatrices Régions cis-régulatrices = partie transcrite du gène est précédée d’un promoteur. C’est la région de l'ADN directement adjacente au site d'initiation de la transcription (+1). Le promoteur contient souvent une séq TATAA (boite « TATA »,….) et d’autres motifs (boite GC, CAAT…) et est la région du gène sur laquelle se lie l ’ARN polymérase II + une série d’autres facteurs associés (facteurs de transcription généraux) → Ensemble, ils forment le complexe basal d'initiation de la transcription. Ce n'est pas suffisant pour activer l’expression des gènes sans aide. 4.2 Les séquences « enhancers » ou « amplificatrices » Séquences « enhancers » ou « amplificatrices » = sont des séquences régulatrices qui non nécessaires pr la transcription. - Sont des fragments de séquences pouvant se trouver très proche ou à très grande distance du promoteur, en amont, en aval où à l’intérieur du gène. Elles fonctionnent donc indépendamment de leur position, de leur distance et de leur orientation par rapport aux gènes qu'ils régulent. - Régions enrichies en motifs d'ADN reconnus par des facteurs de transcription spécifiques. C’est pratiquement toujours une combinatoire de facteurs de transcription (FT) spécifiques qui se fixent sur une séquence enhancer. - Correspondent à des régions de chromatine ouverte, associée à des modifications épigénétiques spécifiques (H3K4 me1, H3K27ac) et occupées par des FT associés à des cofacteurs (BRD, p300) 1.1 Mode d’action des FTs liés aux séquences enhancers 1- Les facteurs de transcription liés aux séquences « enhancers » peuvent moduler l’efficacité de transcription des gènes en interagissant avec les FTs généraux du complexe d’initiation de la transcription → Ces interactions stabilisent la liaison de la RNA polymérase II à l’ADN et facilitent le démarrage de la transcription. 2- Ces interactions sont rendues possibles via la formation de repliements de la molécule d’ADN. Elles impliquent aussi une autre classe de protéine régulatrices, les cofacteurs, qui ne se lient pas à l’ADN eux même mais fixent les facteurs de transcription. 3- Certains facteurs de transcription fonctionnent comme répresseurs en entrant en compétition avec des facteurs activateurs pour lier les séquences enhancers. 25 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Exemple de région de contrôle d’un gène : Les gènes importants dans le développement ont souvent des profils d’expression et des régions de contrôle complexes, avec plusieurs "enhancers", chacun étant responsable de son expression dans un type cellulaire/Issu spécifique. L’activation d’un gène dans un type cellulaire donné implique que la combinaison de FTs reconnaissant les différents motifs d’ADN présents dans cet enhancer soient exprimés dans ces cellules. 4.3 L’activité « enhancer » d’une séquence d’ADN peut être mise en évidence par des expériences de type « gène rapporteur » ⇒ L'acIvité "enhancer" d'un fragment d'ADN peut être testée via une approche de type : - Gène rapporteur (GFP, LacZ,..) in vitro - In vivo dans des embryons transgéniques. → In vivo, dans des embryons transgéniques : si la séquence clonée contient un enhancer alors le gène rapporteur sera exprimé à certains endroits et à certains moments. →Comparer les génomes entre espèces : les régions codantes sont souvent mutées et conservées, tandis que les régions non – codantes sont généralement hautement conservées. Celles-ci sont potentiellement des enhancers. 4.4 Méthode efficace pour découvrir les sites de liaison sur l’ADN de facteurs de transcription In vivo : La technique d’immunoprécipitation de la chromatine= technique ChIP-seq 1- Les cellules/tissus/embryons sont traités pr que toutes les protéines associées à l’ADN soient liées de façon covalente à l’ADN (par traitement à la formaldéhyde). 2- La chromatine est ensuite fragmentée (par sonication). L'ADN fragmenté est alors incubé avec un anticorps spécifique d’un facteur de transcription donné. 3- Les fragments d’ADN sur lequels sont liés le facteur de transcription sont alors immunoprécipités. 4- Les fragments immunoprécipités sont débarrassés des protéines, amplifiés par PCR et séquencés. 5- Après séquençage, les fragments sont alignés sur le génome de référence afin d’identifier l’ensemble des régions génomiques sur lesquelles un FT donné se fixe, dans un tissu donnéµ 2. L’expression des gènes est aussi dépendante de l’organisation de la chromatine Le génome est compacté dans l’espace 3D du noyau en domaines chromosomiques (où les gènes sont actifs ou inactifs) (domaines TAD « topologically associating domains ») à l’intérieur desquels des régions d’ADN peuvent entrer en contact avec d’autres régions du domaine plus fréquemment qu’avec d’autres régions d’autres domaines. 26 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 4.5 Modèle de formation des domaines TAD ⇒ La formation des TAD fait intervenir : - Protéines de liaison à l’ADN (CTCF) - Complexe de protéines formant une structure en anneau (cohesin) à l’int de laquelle la chromatine se déviderait pour agrandir la boucle →On a formation des TADs « par extrusion » de la chromatine avec les contacts « enhancer-promoteur » ayant lieu à l’intérieur de ces domaines → CTCF en se lient à des séquences spécifiques (insulateurs) qui définissent les limites des domaines TAD La formation correcte de ces domaines TAD est essentielle pour la régulation transcriptionnelle des gènes. Les TADs constituent donc des unités fonctionnelles de régulation du génome. Au sein d’un TAD, les interactions physiques entre locus vont aboutir à une régulation des différents gènes par les enhancers présents, avec un possible effet de co-régulation des gènes par un même enhancer. A l’inverse, un enhancer situé dans un TAD ne pourra pas réguler les gènes situés dans un TAD adjacent. 4.6 Evidence des domaines TAD dans le contrôle de l’expression des gènes Chez l'homme, des délétions, des inversions ou des duplications affectant les limites de TADs ont été identifiées, TAD causant différentes malformations des membres. Ces altérations chromosomiques induisent des changements d’expression du gène indian hedgehog (ihh) qui seraient dûes à la modification de la position de séquences enhancers qui sont mises en contact de gènes situés dans d’autres TAD. 4.7 Méthodes pour l’identification des domaines TAD - Via des expériences de CTFC ChIP-seq - via les techniques 3C (capture de conformation chromosomique) utilisées pour analyser l’organisation de la chromatine, permettant de mettre en évidence des boucles dans la chromatine. ⇒ L’idée est de « capturer deux régions en contact » (x et y) et de construire un fragment d’ADN hybride, contenant x à une extrémité et y à l’autre. Le fragment hybride peut ensuite être identifié par diverses méthodes de biologie moléculaire : 3C (simple PCR), Hi-C (séquençage à haut débit). 1- En pratique, on utilise le formaldéhyde pour créer des liaisons covalentes et figer les régions de contact : c’est l’étape du cross-linking. L’ADN est ensuite digéré par des enzymes de restriction, afin de ne garder que les régions en contact. Pour obtenir l’hybride, on utilise la ligase pour réaliser une ligation entre les deux « bouts » des zones en contact. 2- Ac la méthode Hi-C, on obtient une librairie constituée de fragments hybrides séquencés, correspondant à l’ensemble des zones de contact de la chromatine. Les « reads » sont alignés sur le génome de référence, lequel est découpé en intervalles fixes : on peut alors déterminer si une région x est en contact avec une région y. Pour deux intervalles donnés, on comptabilise le nbre de paires existantes : au plus la fréquence de contact est élevée, au plus l’intensité de la couleur rouge sera forte sur la carte de chaleur (« heat map »). 3- Représentation des fréquences de contact par une demi heat map : les TAD sont représentés par les triangles de couleurs intenses, où les contacts sont fréquents. Ici, les régions x, y et z sont à égales distances les unes des autres mais x et y appartiennent au même TAD, tandis que z appartient à un autre. 27 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 5. Les gènes sélecteurs 5.1 Différentes catégories de gènes Des gènes de ménages, actifs dans toutes les cellules. Gènes tissu- ou cellule-spécifiques, responsables des propriétés fonctionnelles des cellules. Gènes pionniers = va ouvrir une région de chromatine alors qu'il est fermé Des gènes de développement, parmi lesquels on trouve les gènes sélecteurs (ou régulateurs maîtres) sont ceux qui, dans un processus de différenciation cellulaire, sont responsables de l’étape de détermination des cellules. Les gènes sélecteurs codent souvent pour des facteurs de transcription dont l’expression est nécessaire et suffisante pour déclencher l’activation d’un ensemble de gènes constituant le programme qui permet la mise en place d’un type cellulaire, d’un tissu ou d’un organe particulier. Dans certains cas, un seul gène peut suffire à la détermination. 5.2 Exemple de gène sélecteur Gène Myod = code pour un facteur de transcription de type hélice-boucle-hélice. S’il est introduit expérimentalement dans un autre type de cellules (fibroblastes) qui ne l’expriment pas, ces cellules se différencient en myotubes. →Celui-ci est suffisant pour transformer un fibroblaste en myoblaste. C’est un gène sélecteur de muscle. Pour un gène sélecteur, le contexte cellulaire est important. →Le gène sélecteur de muscle MyoD transforme des fibroblastes en cellules musculaires mais pas les cellules épithéliales. →Le gène sélecteur de neurones NeuroD transforme des cellules épithéliales en neurones mais pas des fibroblastes. 5.3 Autre exemple de gène sélecteur : eyeless Gène eyless = codant pour un facteur de transcription conservé évolutivement, de la drosophile à l’homme. → Dans les mutants Eyeless de drosophile et Pax6 de souris, les yeux ne se développent pas. On se demande aussi s’il est est suffisant pr enclencher la formation des yeux ? On va donc pr ça insérer ce gène ds les pattes. Et donc on voit que l’expression de eyless ou de son homologue murin Pax6 ds la patte des drosophiles est suffisante pour former des yeux ectopiques. Pax6 est donc un gène maître du développement des yeux. Remarque : Dans certains processus de différenciation, l’étape de détermination n’est pas contrôlée par des gènes sélecteurs uniques, mais par des combinaisons de facteurs de transcription. 28 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 5.4 Mécanismes d’activation et de maintenance des gènes sélecteurs ? 1) Des signaux extracellulaires peuvent enclencher l’expression de gènes sélecteur et la différenciation cellulaire. 2) L’expression de ce gène sélecteur peut être maintenue au cours des divisions cellulaires grâce à la persistance de ces protéines et leur capacité à s’autoactiver ou par le maintien de la structure/organisation de la chromatine. 6. Les cellules communiquent entres-elles via un nombre limité de molécules de signalisation Il existe un nbre limité de facteurs de croissance contrôlant le développement. Ces signaux ne sont pas instructifs mais sélectifs, dans le sens où, en pratique, les options de différenciation accessibles à une cellules à un moment donné sont limitées. Ces options sont imposées par l’état interne de la cellule. C’est ce qui fait que les mêmes signaux sont utilisés à différentes étapes avec des effets différents. Nous distinguons 3 grands types de transduction du signal vers le noyau : 1- Ce sont des facteurs de transcriptions déjà présents ds le noyau ss formes inactive qui sont activés suite à la présence du signal. Cette transduction implique une cascades de phosphorylation av au final une kinase activée qui rentre dans le noyau pour activer et phosphoryler un facteur de transcription spécifique qui va modifier l’expression des gènes… - Les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF) - Les facteurs de croissance de l’épiderme (EGF) 2- Ici y a déplacement d’un facteur de transcription ou autre prot régulatrices (cofacteurs) du cytoplasme vers le noyau - La famille des TGF-b - La famille des Wnt - La famille Hedgehog 29 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 3) Ici c le récepteur lui-même qui, activé, est clivé et dont la partie intracellulaire migre dans le noyau et agit comme cofacteur de transcription - Voie de signalisation de Notch 30 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 Chapitre 3 / Technique d’identififcation et d’étude de la fonction des gènes D’habitude pr trouver un gène responsable d’une mutation, on passse par la génétique classique où à partir d’un mutant on trouve le gène. Mais on peut faire aussi la génétique inverse (mutagenèse dirigée). 1. Les premiers gènes de développement ont été identifiés grâce à des mutations spontanées induisant un phénotype anormal - La mutation vestigial (vg) chez la drosophile conduit à une absence d’aile à l’état homozygote (mutation récessive). - La mutation du gène brachyury (du grec brachy court et oura queue), désigné T, est une mutation qui a un effet évident (queue courte) mai non létal l’état hétérozygote, et létal à l’état homozygote (mutation semi-dominante). - Les études de génétiques humaines permettent aussi d’identifier ou redécouvrir des gènes de développement. Par exemple, des mutations ont été identifiées dans des gènes de la famille HOX induisant des malformations des doigts (syndrome de la « main en miroir ») 2. Des gènes de développement peuvent être identifiés grâce à des criblages par mutagenèse aléatoire Criblage par mutagenèse aléatoire = induction de mutations chez les souris par des traitements chimiques ou par irradiation aux rayons X afin d’identfier des mutations dominantes identifiables ds la 1ère génération. 1) Chez le poisson zèbre, des criblages par mutagenèse à large échelle ont été réalisés. 2) L’objectif est de traiter une population assez grande pour induire au final une mutation dans chacun des gènes du génome. 3) Le but de ces criblages est d’identifier tous les gènes dont la mutation induit un phénotype développemental. 31 Sarah Lefebvre Développement animal 2023/2024 4) Ces criblages nécessitent des programmes d’élevage plus élaborés pour identifier les gènes dont les mutations récessives conduisent à un phénotype 3. Génétique inverse Génétique inverse = Altérer/muter ou moduler l’expression d’un gène (le sur ou le sous-exprimer) pr trouver la fonction d’un gène → C’est une meilleure manière 3.1 Technique KO ou KI →Supprimer ou ajouter des gènes →Inhiber ou activer l’expression des gènes Perte ou gain de fonction ? Technique Knock-out (KO) = la copie normale d’un gène spécifique est échangée avec une version mutée (recombinaison homologue) ou supprimé pr connaitre la conséquence de l’absence du gène spécifique. Technique Knock-in (KI) = Ici le gène est ajouté Rem : Cette technique KO, utilisée depuis 1990 chez la souris, a longtemps été réservée à ce modèle car elle nécessite des cellules souches embryonnaires (ES cells « embryonic stem cells ») pour créer les cellules porteuses de la mutation, et générer un animal « KO » pour le gène ciblé. ⇒ Chez la souris, des animaux transgéniques peuvent être générés par injection directe d’ADN dans l’œuf fécondé. La méthode d’injection directe d’ADN dans l’œuf fécondé est aujourd’hui souvent utilisée pour créer des KO par les nouvelles méthodes d’édition du génome. Après l’injection du zygote, les embryons injectés sont réimplantés dans l’oviducte d’une femelle pseudogestante. La méthode d’injection directe d’ADN dans l’œuf fécondé est aussi utilisée pour créer des souris « knock- in » (KI) exprimant un gène d’intérêt. Ds la construction utilisée pour réaliser des « knock-in » l’ADNc codant pour la protéine d’intérêt doit être placé sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées permettant son expression dans le tissu d’intérêt. ⇒ Dans les 2 cas, les animaux obtenus sont alors testés par PCR (génotypage) pour identifier les animaux transgéniques. - Si la modification a eu lieu dans le génome du zygote, elle sera présente dans toutes les cellules de l’animal. - Sinon, certaines cellules seulement auront intégré le transgène (animaux chimériques). Le croisement de ces animaux chimériques avec des WT (