sv2.docx

Moleculaire biologie en DNA-technologie H1. Isolatie van nucleïnezuren Leerdoelen Isolatie van nucleïnezuren Doel Isoleren (= opzuiveren) van DNA uit cellen/weefsels Belang Enzymatische ‘down stream’; onzuivere DNA stoort enzymwerking Principe Lyse Verwijderen ongewenste componenten Bewaren va...

Moleculaire biologie en DNA-technologie H1. Isolatie van nucleïnezuren Leerdoelen Isolatie van nucleïnezuren Doel Isoleren (= opzuiveren) van DNA uit cellen/weefsels Belang Enzymatische ‘down stream’; onzuivere DNA stoort enzymwerking Principe Lyse Verwijderen ongewenste componenten Bewaren van geïsoleerd DNA Kwaliteitscontrole van geïsoleerde DNA (kwalitatief en kwantitatief) Hoe kunnen we cellen openbreken om er DNA uit te isoleren? Lysemethode afhankelijk van staaltype (grote diversiteit in cel architectuur) ≠ lysemethoden met ≠ voorbehandelingen Chemisch Detergens: maakt celmembraan kapot (SDS) Alkalische buffer (NaOH) Biologisch (enzymen) Proteïnase K: breekt EW af uit celmembraan en op de NZ nucleasen onschadelijk maken Eigenschappen van proteïnase K: Breed-spectrum proteinase Knipt na hydrofobe AZ Temperatuurprofiel Stabiel over breed pH-bereik Werking verhoogd door detergenten en chaotropen (denatureren substraat: enzym meer toegang) Activiteit proteïnase K verhogen Lysozyme: breekt celwand van grampositieven open Detergenten en chaotrope stoffen (denatureren substraat: enzym meer toegang) Fysisch: warmte, osmose Mechanisch: vortex, soniceren Combinatie Humane cellen proteïnase K, detergent, warmte, chaotrope stof/zout (in lysebuffer) Bacteriën NaOH en warmte 2. Hoe zuiveren we het DNA? Hoe verwijderen we de overige componenten? Vroeger: Fenol-chloroform extractie Fasen: 1. Waterige fase DNA 2. Interfase celdebris 3. Organische fase proteïnen, lipiden Extractie: isopropanol precipitatie om DNA te controleren Voordelen Nadelen Zuiver DNA Zeer goede opbrengst Tijdrovend Isopropanol precipitatie Schadelijke organische solventen Residuele organische solventen interfereren met DNA-concentratiebepaling en enzymatisch DNA-manipulatie Sinds 1990: Boom-‘extractie’ = kolomchromatografie Adsorptie van DNA op silicagel Met behulp van bindingbuffer met een hoge zoutconcentratie en chaotrop agens Functie van buffer: Verwijderen watermantel van DNA Verwijderen watermantel van kolom Vormen kationbrug tussen silicakolom en negatief geladen DNA Verwijderen van contaminanten (wassen, flow through) Wassen met ethanol (chaotrop) en hoge zoutconcentratie DNA blijft gebonden aan kolom Contaminanten worden weggewassen Verwijderen van enzyminhibatoren Elutie van DNA door lage zoutconcentratie Voordelen Snel Minder schadelijke organische solventen Zuiver en geconcentreerd DNA Makkelijk te automatiseren Samenvatting DNA-isolatie technieken: 3. Hoe bewaren we het geïsoleerd DNA? Buffer: - Dnase-vrij water - TE ( Tris-EDTA) buffer +: DNA blijft langer stabiel -: mogelijkst storend voor downstream applicaties Temperatuur: - Standaard -20°C - Langere periodes - 80°C - Uitzondering: bewaren van genomisch DNA dat intact moet blijven voor een bepaalde toepassing 4. Hoeveel DNA we kunnen we isoleren uit een bepaald monster/staal? Hoe bew aren we startmateriaal? Staal bewaren Vers staal onmiddellijk ingevroren bij -90°C tot -15°C Herhaaldelijk invriezen en ontdooien reduceert DNA grootte Slechte kwaliteit stalen reduceert DNA grootte In ATL buffer Na proteinase K digestie 6maanden bewaren zonder reductie DNA Hoeveel startmateriaal 100 cellen tot 5x106 cellen RNase toevoegen tijdens de extractie? Toevoegen voor buffer AL om RNA te digesteren Elutievolume? Verwachte opbrengst? practicum Kwaliteitscontrole van geïsoleerd DNA en/of RNA Kwantitatief: DNA-concentraties Kwalitatief: Zuiverheid Extractierobots Vaak: magnetische beads gecoat met silica +: automatisatie veel monsters in korte tijd verwerken beter reproduceerbaar contaminatierisico kleiner traceren van monsters makkelijker Remmende factoren van de PCR Oplossingen Extra zuiveringsstap Monster verdunnen Hulpstoffen toevoegen BSA, Tween-20 Keuze DNA-polymerase Controleren door: interne PCR-controle H2. PCR-analyse 2.1. Leerdoelen 2.2. Basisprincipes PCR 2.2.1. Begrippen Dubbelstrengig (ds) en enkelstrengig (ss) Antiparallele strengen: 5’ 3’ 3’ 5’ Denaturatie van ds DNA bekomen van 2 enkelstrengen door toevoegen van warmte, alkalische opl. of formamide Renaturatie gedenatureerd DNA wordt geïntubeerd bij een temp. juist onder de smelttemperatuur van de DNA en er wordt opnieuw een dubbelstrengig DNA gevormd Hybridisatie dubbelstrengig DNA gevormd door 2 enkelstrengen van verschillende oorsprong Smelttemperatuur ds DNA temperatuur waarbij even veel enkelstreng als dubbelstreng aanwezig is temperatuur waarbij helft gedenatureerd is Tm =2*(A+T)+4*(G+C) Afhankelijk van: - %GC van het ds DNA - lengte van het ds DNA - ionsterkte van de oplossing Detectie van denaturatie via spectrofotometrie UV-spectrum i.f.v. temperatuur A260 i.f.v. temperatuur: smeltcurve PCR polymerase chain reaction (polymerasekettingreactie) snel exponentieel vermeerderen van een DNA-fragment Primer kort stukje enkelstreng DNA dat gebruikt wordt als starpunt voor DNA-synthese; complementair aan target-sequentie 2.2.2. Doel van PCR Analytisch of diagnostisch Wat? Aantonen aanwezigheid van bepaald DNA-fragment Voorbeelden: opsporen ziekte verwekkers, genetische aandoening en verwantschap van organismen aantonen GGO’s sequentie-analyse forensisch onderzoek Preparatief: bereiding DNA-fragment 2.2.3. Principe van PCR = snel exponentieel vermeerderen van een DNA-fragment Gebaseerd op principe van DNA-replicatie in de cel Bevat essentiële componenten (gelijkaardig aan componenten in de cel) DNA- template DNA-polymerase Twee primers Nucleotiden (dNTPs) Water (DNase-vrij) Buffer met MgCl2 Vermeerdering verloopt via S-curve 1 cyclus = 3 fasen PCR-reactie = meerdere cycli 2.3. Fasen PCR-reactie 1. Denaturatie fase (95°C) dubbelstrengig DNA smelt ↓ waterstofbruggen tussen de nucleotiden kapot ↓ 2 strengen uit elkaar gaan strengen worden toegankelijk gemaakt voor de DNA-polymerase 2. Annealing fase (45°C – 60°C) Forward en reverse primers annealen/binden (hybridiseren) met de complementaire sequenties van het gedenatureerde target (doel-DNA) Ta = annealing temperatuur = ong. 5°C onder Tm van de primers 3. Extensiefase (72°C) Synthese nieuw DNA van 5’ naar 3’ Nucleotide volgorde van de complementaire streng = template voor DNA-synthese Duur van de extensiefase is afhankelijk van de lengte van de amplicon Amplicon= gevormde PCR-product 2.4. Berekeningen PCR-mix Mastermix alle PCR-componenten zonder DNA-template PCR-mix alle PCR-componenten, inclusief DNA-template 2.4.1. Verdunnen template DNA Formule c1 * V1 = c2 * V2 c1 = beginconcentratie, bepaald dmv Nanodrop [ng/µl] V1= volume dat je dient te nemen van je staal [µl] c2 = eindconcentratie, 6 ng/µl [ng/µl] V2 = gewenste eindvolume [µl] 2.4.2. Primeroplossingen Bewaaroplossingen hoge primerconcentratie (100µM of 250µM) verklaring: hoe lager primerconcentratie, hoe sneller primer degradeert Werkoplossingen lagere primerconcentratie (5µM of 20 µM) verklaring: zodat het volume dat je toevoegt aan de mastermix groot genoeg is Oefening dia 36 H2 2.4.3. Mastermix (MM) Waarom? Om alle componenten uit de stockoplossing samen te pipetteren in een epje Kleiner relatieve fout maken door grotere volumes te pipetteren Uit epje volume voor 1 reactie pipetteren in dunwandig PCR-epje Wat? DNase-vrij water Nucleotiden Taq buffer Primers Taq polymerase (op ijs bewaren, niet vortexen) Wat niet? Template DNA 5 µl DNA Berekeningen mastermix: practica en slides 40-50 H2 2.5. DNA-contaminatie/PCR-contaminatie Wat? Overdracht van DNA of PCR-producten naar een ander epje Gevolg? Vals-positieve PCR-resultaten Bron van contaminatie alle nucleïnezuur bevattende materialen in labo Monsters zelf Eerder gemaakte PCR-producten Huidschilfers laborant Stofdeeltjes Hoe verspreid? Aerosol kleine vochtdruppel met vaste deeltjes Kleine partikel stofdeeltjes, huidschilfers Hoe veroorzaakt? Micropipetten (aerosol) Vortexen (aerosol) Hoe voorkomen? Gebruik maken van gescheiden ruimtes werken in een richting: van Pré PCR naar Post PCR lab Werken volgens GLP-normen (Good Laboratory Practice) Filtertips gebruiken Handschoenen Infrastructuur pré- en post-PCR labs nucleïnezuurisolatie (pré) Bereiding mastermix (pré) Toevoegen template aan mastermix (pré) PCR-amplificatie en PCR-analyse (post) Aparte set lab apparatuur en labomateriaal Eigen labojassen Pré-PCR-lokaal: PCR hood Post-PCR-lokaal = PCR-werkstation = PCR-kabinet 2 UV-lampen, ventilator en stoffilter: Decontaminatie door UV-lamp Circulatie van UV-bestraalde lucht voorkomt aerosolvorming Thermocyclers Gelelektroforesetoestel Opmerking: Waarom conventioneel PCR-toestel steeds in post-PCR-lokaal staan en een qPCR-toestel niet? bij conventionele: epjes nog geopend worden na PCR vb. om gelanalyse uit te voeren qPCR PCR-plaat blijft na PCR afgedekt en onmiddellijk in afval gegooid vb. gelanalyse in real time Negatieve controles Positieve controles Interne controles 2.6. PCR-controles Negatieve controles Positieve controles Interne controles 2.6.1. Negatieve controles Wat? Controle die geen template DNA bevat Doel? Contaminatie detecteren ongewenste PCR-producten detecteren Soorten (1) Normale of negatieve controle = staal waarvan je weet dat negatief moet zijn voor de eigenschap of de biomerker die je test - gaat specificiteit van de test na - spoort contaminatie op (2) Isolatiecontrole = extra epje in de isolatieprocedure waaraan je geen staal toevoegt - spoort contaminatie tijdens nucleïnzuurisolatie op (3) No-template controle = mastermix waaraan je geen template DNA toevoegt = PCR-mix zonder template DNA - spoort contaminatie in mastermix op t.g.v. ‘carry-over’ Indien normale of negatieve controle PCR-fragment oplevert? PCR-componenten controleren PCR optimaliseren = andere reactiecondities uittesten: specificiteit van primers nagaan via software andere primers ontwikkelen? annealingstemperatuur aanpassen? concentratie MgCl2 aanpassen? Indien isolatiecontrole of NTC PCR-fragment oplevert? resultaten van andere monsters: niet betrouwbaar en niet gerapporteerd = vals-positieve resultaten alle reagentia en consumables controleren/vervangen bron van contaminatie opsporen 2.6.2. Positieve controles Wat? Monster waarin het te amplificeren target aanwezig is Wat indien positieve controle negatief? Alle componenten controleren Apparaten controleren PCR-reactie opnieuw uitvoeren 2.6.3. Interne controles = controleren of de PCR technisch goed is verlopen 2.6.4. Analyse PCR-fragmenten Agarosegelelektroforese scheiding van DNA-fragmenten o.b.v. grootte door middel van agarosegel Capillaire gelelektroforese scheiding van DNA-fragmenten o.b.v. grootte d.m.v. agarosegel in lang capillair 2.7. PCR-componenten 2.7.1. dNTP’s = desoxyribonucleotiden Gelijke hoeveelheid van elk nucleotide Meestal 200µM Concentratie te hoog fouten Concentratie te laag synthesesnelheid van polymerase daalt Niet erg stabiel in oplossing Beperk vriesdooi-cycli Aliquoteer Controleer vervaldatum 2.7.2. primers = oligonucleotiden = kort stukje enkelstrengs-DNA dat gebruikt wordt als startpunt van de DNA-synthese Forward en reverse primer bepalen grootte van de PCR-product Forward primer: bindt aan 3’ van antisense string (non-coding, template) = 5’ uiteinde van de sense streng Reverse primer bindt aan 3’ van sense streng (coding, non- template) = 5’ uiteinde van de antisense streng Sequentie van de primers wordt altijd weergegeven van de 5’ uiteinde Hybridiseren specifiek met complementaire sequentie de specificiteit bepalen Concentratie zelf bepalen binnen je proef +/- 0,1µM - 0,5µM = primer titratie Te hoog ongewenste PCR-producten vb. primer dimeren Te laag PCR-efficiëntie daalt Sommige complementaire basen binden aan andere primer Sommige complementaire basen binden aan dezelfde primer Soorten examenvragen/oefeningen over sequentie van primers dia 83- 86 2.7.3. Polymerase = enzym dat lange ketens/polymeren van AZ of nucleotiden synthetiseert VWR Taq DNA polymerase = thermostabiel recombinant DNA-polymerase met zeer hoge activiteit in het primer-enzym Thermostabiel DNA/RNA-polymerase: samenstellen van DNA/RNA-moleculen door kopiëren van templatestreng met basenparing interacties Invloed MgCl2-buffer Hoe hoger concentratie, hoe beter werking polymerase Hoe hoger concentratie, hoe lager specificiteit PCR 5’ – 3’ DNA polymerase 3’ – 5’ exonuclease activiteit = proofreading = verwijderen foutief ingebouwde nucleotiden 5’ – 3’ exonuclease activiteit = verwijderen van oligonucleotide reeds aanwezig op de template 2.7.4. MgCl2 buffer 2.7.5. hulpstoffen = additieven, enhancers Doel? Verhogen de PCR-efficiëntie Hoe? Stabiliseren de activiteit van de polymerase verbeteren de opbrengst 2.8. PCR-toepassingen Hot-start PCR Touch down PCR Nested PCR Multiplex PCR Reverse transcriptase PCR H3. Scheiding en detectie van DNA 3.1. Leerdoelen 3.2. Begrippen Elektro = elektrisch veld Forese = transport, beweging Beweging van geladen deeltjes onder invloed van een elektrisch veld Snelheid van deze beweging afhankelijk van… … eigenschappen deeltje: lading, grootte en vorm … eigenschappen medium viscositeit Soorten elektroforese (1) agarosegelelektroforese in agarose AGE (2) polyacrylamidegelelektroforese in polyacrylamide PAGE (3) capillaire gelelektroforese in polyacrylamide-achtig polymeer CE 3.3. Principe elektroforese Negatief geladen nucleïnezuren worden met behulp van elektrische stroom in een matrix gescheiden volgens fragmentgrootte. De dichtheid van de matrix kan gevarieerd worden zodat ook het scheidend vermogen kan gevarieerd worden. 3.4. Agarosegelelektroforese (AEG) = scheiding van (korte) PCR-fragmenten o.b.v. grootte want lading per nucleotide is identiek Matrix agarose hoe meer, hoe kleiner de poriën Apparatuur kunststofbak spanningsbron agarose elektroforesebuffer Geleidt elektrische stroom ionsterkte Bufferende capaciteit pH Vb. TAE: grote fragmenten TBE: kleine fragmenten +: goedkope techniek groot scheidingsvermogen -: arbeidsintensief niet geautomatiseerd beperkte resolutie en gevoeligheid Uitvoering Scheidend vermogen en resolutie Scheidend vermogen = Hoeveel baseparen gescheiden kunnen worden (range) Hoe meer agarose, hoe kleiner poriën in gel, hoe kleiner scheidend vermogen 1%(m/V) Moet zo groot mogelijk zijn Resolutie = verschil in lengte tussen twee fragmenten dat goed van elkaar gescheiden kan worden Uitgedrukt in aantal bp Moet zo klein mogelijk zijn Voorbereiding monsters Elektroforesebuffer Geleiding elektrische stroom Bufferende capaciteit Ladingsbuffer Aanbrengen in monsters in putjes in de gel glycerol Positie DNA-fragmenten in gel broomfenolblauw en xylene cyanol (kleurstoffen) Meestal 4 tot 6 geconcentreerd Moleculaire marker als referentiepunt DNA-ladder = moleculaire marker = basenpaarladder Wat? Mengsel van DNA- fragmenten met gekende grootte Migratie en detectie van nucleïnezuren Migratie Hoe verder dat de deeltjes lopen, hoe groter poriegrootte, hoe minder agarose dus procent gel daalt Detectie SybrGreen en Ethidiumbromide = DNA intercalerende fluorescente kleurstoffen Voordelen SybrGreen t.o.v. EtBr Fluorescente eigenschappen SybrGreen na binding aan DNA sterker Lagere concentraties nodig Betere signaal-ruisverhouding SybrGreen minder mutageen en veiliger Samenvatting agarosegelelektroforese (AEG) 3.5. Polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) Apparatuur verticaal elektroforese eenvoudige materialen polyacrylamide = neurotoxine +: resolutie van 1 bp -: arbeidsintensief niet geautomatiseerd Toepassing Sequencing bij grote resolutie Resolutie en scheidend vermogen Resolutie 1 bp Scheidend vermogen 5 – 2000 bp 3.6. Capillaire gelelektroforese (CE) Apparatuur computer gestuurd systeem +: geautomatiseerd en snel zeer hoge resolutie (1bp) digitale opslag van data -: duur Principe SAMENVATTING Agarosegelelektroforese (AGE) Polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) Capillaire gelelektroforese (CE) Resolutie + 10-20bp +++ 1bp +++ 1bp Scheidingsgebied +++ 50bp-50.000bp + 5-2000bp + 5-2000bp Detectie Fluorescerende intercalerende kleurstoffen Fluorescerende labels gekoppeld aan NZ of radioactiviteit Fluorescerende labels gekoppeld aan NZ H4. De stroom van genetische informatie 4.1. Moleculaire bouwstenen van leven Levend organisme = iets dat stofwisseling/metabolisme en informatieoverdracht - complex: differentiatie van cellen dynamisch verschillende organisatieniveaus Metabolisme = vermogen om door middel van chemische reacties stoffen om te vormen Informatieoverdracht = vermogen om informatie door te geven aan volgende generaties Alle cellen zijn opgebouwd uit DNA uit nucleïnezuren die opgebouwd zijn uit nucleotiden EW uit aminozuren (meeste cel functies) Lipiden uit vetzuren (vormen membraan van organellen) Carbohydraten uit suikers (energie opstapeling) DNA (desoxyribonucleïnezuur) = herhalend dubbelstrengige polymeer van nucleotiden dat genetische informatie in cellen opslaat Dubbele helix Twee strengen DNA verbonden door H-bruggen Antiparallel: 5’ ene met 3’ andere Complementair: Sequentie ene dicteert sequenties andere Nucleïnezuren Opslag en verzenden informatie Fosfodiësterbinding 3’ suiker NZ1 + 5’ fosfaat NZ2 Nucleotiden Base + suiker + fosfaat Suiker en fosfaat = backbone Basen altijd anders Basenparen A en T: 2 H-bruggen G en C: 3 H-bruggen => Watson-Crick basenparen RNA (Ribonucleïnezuur) = +/- DNA = herhalend enkelstrengig polymeer van nucleotiden dat genetische informatie in cellen opslaat U ipv T RNA binden met DNA U met A Enkelstrengig 2’-OH belangrijk voor structuur en functie kan fosfodiësterbindingen breken RNA actiever en minder stabiel korte termijn info opslaan snelle turnover Fosfaten negatief geladen elkaar afstoten veel kationen binden als tegenreactie compacte en stabielere structuur 4.2. Het genoom – blauwdruk voor leven 4.2.1. Behoud en doorgeven van informatie essentieel voor leven Replicatie: complementaire vorm van DNA maakt het mogelijk dat DNA gekopieerd kan worden gekopieerde chromosomen worden verdeeld in 2 dochtercellen tussen verschillende generaties cellen ≈ correct kopiëren van bewaarde informatie ≈ DNA-replicatie in een cel ≈ expressie van genetische informatie ≈ genexpressie 4.2.2. Het genoom Verschillen van organisme tot organisme Genoom: eencellige < meercellige Grotere genoomomvang en verhoogde genoomcomplexiteit correleren niet altijd Dure technieken: onderzoek lang geduurd Toepassing genoominformatie Farmacogenetica vakgebied dat bestudeert hoe mensen reageren op bepaalde geneesmiddelen o.b.v. genoom en variaties trial en error: vb. dokter die geneesmiddel kiest, veel bijwerkingen, andere kiezen Kan genoom bepalen en zo medicatie kiezen: te duur Epigenetica veroudering bestuderen genoom: chemische labels op en afhankelijk van hoeveelheid en plaats toch eigenschappen doorgeven die niet bepaald worden door genoom maar door de labels Eukaryoot genoom bestaat uit genen en junk DNA junk DNA = niet coderend DNA DNA gestockeerd in lineaire of circulaire units = chromosomen DNA om verpakkingseiwitten (= histonen) gewikkeld en samengeperst gDNA: dubbelstrengig verpakt in chromatine en chromosomen Chromosoom = DNA gestockeerd in lineaire of circulaire units enkel zichtbaar tijdens mitose bestaat uit 2 identieke chromatiden ontwonden tot verschillende niveaus: a. Gecondenseerde heterochromatine, chromatine en chromatinedraden b. Nucleosomen c. Histoneiwitten met dsDNA rond d. Euchromatisch DNA = functioneel actief DNA twee soorten chromatine Heterochromatine: compact en inactief Facultatieve heterochromatine: omgezet tot euchromatine en omgekeerd Constitutieve heterochromatine: permanent compact structuur binnen de chromosomen Vb. centromeren en telomeren Euchromatine: minder compact en actief Gen = regio die een afzonderlijke erfelijke eigenschap regelt, meestal een specifiek product zoals een eiwit heeft de info voor maken van iets, wanneer en waar gemaakt coderen voor meerdere producten Bacterieel genoom ≈ eukaryoot genoom bacterieel chromosoom Nucleoid= DNA molecule gebonden aan klein hoeveelheid eiwitten Negatief supercoiled en gevouwen in lussen DNA lussen worden in hun plek gehouden door RNA en eiwitten 4.3. Genexpressie – omzetting genetische informatie tot lichaamseigenschappen Genexpressie = proces waarbij informatie in een gen tot expressie komt doordat het gen afgelezen wordt en RNA en eiwitten worden gemaakt. HET CENTRALE DOGMA Twee belangrijke stappen Transcriptie = overschrijven DNA en vormen van mRNA Translatie = vertalen van mRNA in eiwit RNA ofwel onmiddellijk gebruikt door de cel of gebruikt om specifiek eiwit aan te maken GEMODIFCIEERDE VERSIE DOGMA Klassiek: DNA RNA eiwit Aangevullen: a. rol van functionele ncRNA’s b. epigenetische modificaties = chemische modificaties van DNA en histonen Belangrijke stappen Transcriptie: DNA overschrijven van DNA naar RNA DNA signaal aan RNA polymerase RNA polymerase maakt RNA Gemaakte RNA verder verfijnd Translatie mRNA naar eiwit mRNA bepalen start en einde translatie Elk AZ = 3 nucleotiden = codon Door ribosomen tRNA interpreteert info uit mRNA in eiwit sequenties 4.4. Regulatie van genexpressie – differentiatie en modelorganismen 4.4.1. Genexpressie op verschillende niveaus Transcriptioneel Post-transcriptioneel Translationeel Post-translationeel Expressie RNA/EW gereguleerd op niveau van… synthese ‘processing’ of modificatie degradatie Wanneer gen X tot expressie? Temporele regeling ≈ tijdstip Waar gen X tot expressie? Spatiële regeling ≈ plaats Hoeveel genproduct X op tijd Y en plaats Z? regeling hoeveelheid en activiteit genproduct Regulatie genexpressie door degradatie van een eiwit vb. EW in plantje bepaalt afh. licht hoe groot plant wordt Regulatie genexpressie door modificatie vb. insuline pas actief na preproinsuline afgeknipt in twee verschillende ketens 4.4.2. Verband differentiatie en genexpressie Differentiatie = proces waarbij iets zich in verschillende richtingen ontwikkelt = specialisatie cellen om daarna om te vormen tot gedifferentieerde cellen in een gespecialiseerd weefsel Verband differentiatie en genexpressie elke cel dezelfde verzameling van genen niet alle genen actief elke celtype: eigen patroon van genexpressie cellen = gespecialiseerd/gedifferentieerd 4.4.3. Verband fenotypische plasticiteit en genexpressie Fenotypische plasticiteit = het genotype van twee individuen kan hetzelfde zijn, maar het fenotype verschilt onder invloed van de omgeving Verband Welke genen tot expressie gereguleerd door een complex systeem regulatoren rol spelen Epigenetica en omgevingsfactoren zijn ook belangrijk genen kunnen meer of minder actief zijn afhankelijk van de omgeving 4.4.4. Prokaryoten vs. Eukaryoten 4.5. Genexpressie en de architectuur van de cel 4.5.1. Compartimentalisatie = De componenten van cellen zijn ruimtelijk georganiseerd in regio's om functies en regulering te vergemakkelijken Compartimentering voegt extra lagen van mogelijke regulering toe Bv: eukaryote transcriptie binnen de kern, en translatie buiten kern 4.5.2. Prokaryoten vs. eukaryoten Prokaryoten geen interne membraangebonden compartimenten wel regio’s: chromosomaal DNA in gebied nucleoïde compartimentering minder complex Eukaryoten wel interne membraangebonden compartimenten compartimentering complex verschillende bijkomende membraangebonden gebieden verschillende functies mitochondriën en chloroplasten eigen genoom ER en Golgi betrokken bij eiwitverwerking Niet-gespecialiseerde gebieden van een cel vormen het cytoplasma Chromosomen karakteristieke plaats = chromosomen territory transcriptie ↑, chromosomen territory ↑ 4.6. Evolutie van het genoom 4.6.1. Diversiteit van genomen Op basis van genetische analyse levende organismen indelen Prokaryoten = bacteriën (eubacteria) + archae (archaebacteria) Eukaryoten Ontstaan van nieuwe genen: 1. Intragenische mutatie (tijdens replicatie) 2. Genduplicatie (tijdens replicatie) gedupliceerde genen kunnen verschillende evolueren 3. ’Shuffling’ van DNA-segmenten 4. Horizontale gentransfer 4.6.2. Variaties en mutaties Variaties kunnen veroorzaakt zijn door kleine of grote mutaties leiden ertoe dat er binnen een soort verschillen voorkomen Mutaties kunnen volgorde en structuur EW veranderen kunnen de regulerende regio's van een gen en de expressie veranderen in somatische cellen enkel organisme zelf in kiembaancellen beïnvloeden volgende generaties Nulmutaties of verliesmutaties = mutaties die de functie van een gen volledig elimineren Basensubstituties = aanpassing in codon Missense mutatie = als nucleotide verandert maar het codon ook Nonsense mutatie = een stopcodon wordt gevormd Silent mutatie = als nucleotide verandert maar het codon niet Puntmutatie = kleinschalige verandering door 1 of enkele nucleotide Deletie = 1 of enkele nucleotiden weg Insertie = 1 of enkele nucleotiden bij Rearrangement = herplaatsing Mutaties vaak tot ziekte leiden: Monogene mutatie Ziekte gevolg verandering in 1 enkel gen Polygene mutatie Ziekten gevolg veranderingen in verschillende genen Mutaties niet altijd tot ziekte, maar kans vergroten Penetrantie = % mensen met mutatie dat ziekte ontwikkelen 4.6.3. Genduplicaties en genfamilies Geven aanleiding tot families van verwante genen binnen een cel Gedupliceerde genen kunnen onafhankelijk evolueren. Genduplicatie en genfamilies: Orthologen = homologe genen die gedivergeerd zijn nadat twee verschillende soorten ontstaan zijn Paralogen = homologe genen die binnen één soort verschillend geëvolueerd zijn 4.7. Onderzoeksgebieden per domein; andere stalen; andere technologie (Meta)genomics de studie van alle genen in een cel Transcriptomics de studie van alle in een cel getranscribeerde genen Epigenomics de studie van de volledige reeks epigenetische modificaties op het genetisch materiaal van een cel, bekend als het epigenoom. Metabolomics de analyse van alle metabole reacties die op een bepaald moment gebeuren in een cel Lipidomics de studie van alle lipiden in een cel Ionomics de studie van alle ionen in een cel Alle domeinen samen: ‘systems biology’ H5. Genexpressie 5.1. Dogma moleculaire biologie Genexpressie = proces waarbij informatie in een gen ‘tot expressie’ komt doordat het gen afgelezen wordt en RNA en eiwitten worden gemaakt transcriptie translatie Transcriptie: productie van een RNA-afschrift van gen tot primair transcript RNA-processing: Chemisch bewerken van primaire transcript tot matuur RNA Matuur RNA meerdere bestemmingen… Sommige naar ribosomen: nucleotidesequentie gelezen als instructie voor eiwitsynthese Andere functioneren als bestanddeel van ribosomen Overige transporteert geactiveerde AZ naar de ribosomen Translatie: nucleotidensequentie van mRNA vertaalt tot aminozuursequentie van EW 5.2. van DNA tot RNA: transcriptie 5.2.1. verschillen tussen DNA en RNA DNA ∈ genetische informatie nodig voor celdeling en proteïne synthese altijd in nucleus Functie: stockage genetische informatie RNA tussenvorm van DNA voor proteïne synthese buiten de kern soort van “back-ups” van unieke DNA Enkele keten: enkelstrengig Hierdoor op verschillende manier opvouwen: Primair niveau: nucleotide samenstelling en sequentie Secundair niveau: ruimtelijke structuur door de intramoleculaire complementaire basenparen partiële helixen Tertiair niveau: 3D-structuur door complexe vouwing als enzyme functioneren Gevolg: Verschillende functies Structureel ribosomen Regulatorisch non-coding RNA’s Katalytisch ribozymen 2’-OH ribose; chemisch minder stabiel U ipv T: A, C, G en U 5.2.2. Efficiëntie van eiwitsynthese Cellen: snel grote hoeveelheden eiwit aanmaken Sommige grote hoeveelheden, andere kleine hoeveelheden 5.2.3. RNA-polymerase DNA-transcriptie door RNA-polymerase: ↓ Coding strand = coderende streng = sense streng = non-template streng = plus streng Template strand = template streng = antisense streng = non-coding streng = min streng mRNA dezelfde nucleotidensamenstelling als de coderende of sense streng. 5.2.4. Verschillende soorten RNA Type RNA Functie messenger RNAs =unieke nucleotide sequentie - heeft specifiek gen dat code is voor 1 bepaald proteïne ribosomaal RNAs = niet-unieke nucleotide sequentie - zorgt voor koppeling van elk AZ op de tRNAs op het ribosoom - vormt de basis van ribosomen transfer RNAs = niet-unieke sequentie - draagt code complementair aan stukje van de code uit corresponderen mRNA - bindt bepaald AZ volgens die code small nuclear RNAs - betrokken bij splicing van pre-mRNA tot mRNA micro RNAs small interfering RNAs = moleculen die genexpressie helpen reguleren other non coding - gebruikt door telomerase, … 5.2.5. Binding – initiatie – elongatie – terminatie transcriptie Vereenvoudigde weergave van de eenheid van transcriptie bij prokaryoten en eukaryoten Eenheid van transcriptie = elk stukje DNA dat naar RNA overgeschreven wordt In eukaryoten transcriptie-eenheid draagt de informatie van 1 enkel gen en codeert voor 1 RNA-molecule of 1 eiwit In prokaryoten een set van nabijgelegen genen (een operon) overgeschreven wordt als een eenheid informatie draagt voor meerdere, verschillende eiwitten Het mechanisme van de transcriptie heeft volgende algemene eigenschappen: 3 fasen naar analogie met de DNA replicatie: Initiatie, elongatie en terminatie Geen primer nodig voor de start van de transcriptie Start transcriptie gebeurt aan een specifieke DNA-sequentie = de promotor-zone Voor synthese van elk mRNA: 1 gen per keer overgeschreven DNA helix gaat enkel lokaal open Een enkelvoudige keten met basen die complementair zijn t.o.v. het stukje DNA of gen gevormd In prokaryoten Bacteriële RNA-polymerase (lichtblauw) Subunit: sigma-factor (geel) Promotor (groen) Terminator (rood) ↓ In eukaryoten Verschillende RNA-polymerasen Transcriptiefactoren Prokaryoot: RNA-polymerase zelf starten Eukaryoot nood aan meerdere transcriptiefactoren Deze EW binden samen met polymerase aan een promoter Regulatorische DNA-sequenties Prokaryoot: genen dicht bij elkaar Eukaryoot: verspreid over volledige genoom Transcriptie gereguleerd door regulatorisch DNA-sequenties Nucleosomen Eukaryote chromatine veel compacter Introns en exons Assemblage van het eukaryotish eiwitcomplex voor initiatie van transcriptie begint als… ↓ Transcriptiefactor TFIID op een kleine DNA-sequenciesite bindt via een van de TFIID-subeenheden TBP ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 5.2.6. RNA-processing van eukaryotische mRNAs in de nucleus Van pre-mRNA tot matuur mRNA Primaire RNA-transcripten: nog niet functioneel nog chemisch worden bewerkt = RNA-processing Bij bacteriën processing van de rRNA en tRNA-voorlopers mRNA direct afgelezen door ribosomen Bij eukaryoten processing van mRNA-voorlopers primair transcript zwaar gemodificeerd: veelvuldig geknipt, geplakt en chemisch bewerkt thv. het 3’-en 5’-uiteinde alvorens naar het cytoplasma te verhuizen als functioneel mRNA. pre-mRNA = het nucleair primair transcript De belangrijkste modificaties van het pre-mRNA zijn: 1.Toevoegen van een 5’-cap 2.Vorming van een 3’-poly-A-staart 3.Splicing Splicing: intronsequenties tussen exonsequenties uit worden geknipt, ↓ zodat de eiwit coderende basen onafgebroken naast elkaar komen te liggen het verwijderen uiterst precies gebeuren:verschuift leesraam translatie, kan een functioneel inactief eiwit ontstaan door snRNA snRNA + eiwitten = spliceosoom Functie 5’-cap en 3’-poly-A-staart extra stabiliteit belangrijk transport van mRNA naar cytoplasma belangrijk bij translatie controle dat mRNA compleet is complexe mRNA transcriptie-eenheden en alternatieve splicing Sommige genen slechts één soort mRNA = simpele mRNA-transcriptie-eenheden Andere genen meer dan één verschillend mRNA = complexe transcriptie-eenheden Door alternatieve splicing of alternatieve polyadenylatiesignalen In alternatieve splicing verschillende manieren introns verwijderen 5’-en/of de 3’-introngrenzen ‘afgedekt’ door specifieke RNA-bindende eiwitten, ↓ zodat deze grenzen niet ‘zichtbaar’ zijn voor het spliceosoom De alternatieve polyadenylatie in één gen verschillende AATAA-sequenties liggen aan de 3’-zijde van gen In primair transcript sommige signalen worden ‘afgedekt’ door RNA-bindende eiwitten ↓ zodat deze grenzen niet ‘zichtbaar’ zijn voor het klievingsapparaat Voordelen alternatieve splicing regulatie genexpressie diversiteit: van een pre-mRNA, meerdere eiwitten isovormen Gevolg bio-informatica steeds nagaan hoeveel verschillende transcripten gemaakt en beslissen welke bestuderen Voorbeeld alternatieve splicing weefselafhankelijke expressie calcitonine in schildklier = regeling calciumconcentratie CGRP in hersenen = smaakperceptie 5.2.7. Transcriptie unit Op examens als figuur tonen moeten wij zeggen welk gen gemaakt Upstream = promotor Downstream = terminator Reading frame of leesraam