Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi: RNA İşlemlenmesi Sunumu

Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Sunum Sahibi Dönem I Fotoğraf RNA sentezi ve İşlemlenmesi Prof. Dr. Sultan Cingöz  İÇERİK I. Santral Dogma (DNA→RNA→Protein) II. RNA II...

Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Sunum Sahibi Dönem I Fotoğraf RNA sentezi ve İşlemlenmesi Prof. Dr. Sultan Cingöz  İÇERİK I. Santral Dogma (DNA→RNA→Protein) II. RNA III. RNA sentezi (Transkripsiyon) Prokaryotlarda Transkripsiyon E.coli RNA Polimeraz E.coli promotor RNA sentezi (başlama, uzama ve sonlanması) Ökaryotlarda Transkripsiyon Ökaryotik RNA Polimerazlar Genel Transkripsiyon Faktörleri, RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonun başlatılması cis-acting elemanlar (Promotör ve Enhancerlar) ve trans-acting faktörler (Aktivatör ve represür)  Moleküler biyolojinin SANTRAL DOGMA’sı hücrelerde DNA’daki bilginin RNA ve sonrasında proteine dönüşmesidir. sitoplazma çekirdek gen Öncül Prokaryotlar RNA 5’ şapka ve transkri 3’PolyA pti eklenmesi RNA şapkası RNA splicing (kırpılması) Olgun mRNA Gen ekspresyonu= genin ifadesi. Bilgi genlerden Ökaryotlar proteinlere nasıl akar? RNA ve DNA’nın farkı: RNA’nın Yapısı Ribonükleotit RNA’nın Yapısı Kendiliğinden komplementer bölgelerden katlanmalar (zayıf hidrojen bağları ile) mümkündür. Bu işlev açısından çok önemlidir. (Sap-iplik) (Tek iplik) (İnternal çemberler) (Esnek şişlik) Transkripsiyonda sadece mRNA oluşturulmaz (Gen ekspresyonunda rolü olan başlıca RNA’lar) RNA TİPLERİ İŞLEVLERİ mRNA’lar mesajcı RNA’lar, proteinleri kodlar rRNA ’lar ribozomal RNA’lar, ribozomun yapısında bulunur ve protein sentezini katalizler tRNA ’lar taşıyıcı RNA’lar, mRNA ve aminoasitler arasındaki adaptör molekül olarak protein sentezinin merkezini oluşturur snRNA ’lar small nuclear RNAs (küçük çekirdek RNA’ları), çekirdekte pre-mRNA’nın işlenmesi sırasında görev alan spliceosomes kompleksinin yapısında bulunur. snoRNA ’lar small nucleolar RNAs (küçük çekirdekçik RNA’ları), rRNA’ların işlenmesinde kullanılır miRNA ’lar mikro RNA’lar (yaklaşık 20 bp) bazı genlerin transkripsiyon sonrası yıkımı ve böylelikle ekspresyonunun durum bağımlı olarak düzenlenmesi lnc RNA’lar Uzun kodlanmayan RNAlar (en az 200bp), Transkripsiyon sonrası kontrolde kullanılırlar  tRNA Amino asit bağlanmış uc A, U, G, C dışında inosin (I), psodouridin (Ψ), dehidrouridin (D),.. gibi Yonca yaprağı baz analogları içerir. (antikodon)  rRNA Tüm RNA’ların 80%’ini oluşturur. Ribozomun yapısına katılır ve protein sentezinde katalizör (ribozim) görev alırlar. Ökaryotik hücrede 4 farklı rRNA molekülü vardır: 18S, 5.8S, 28S, and 5S rRNA. Bunlardan 3 tanesi nükleolus (çekirdekcik) içerisinde sentezlenen tek bir transkriptin kesilimi ile oluşur. Çekirdekçikte ribozomal proteinlerle bağlanarak öncül 40s ve 60s ribozomal yapıyı oluşturur ve olgunlaşmak üzere çekirdeğe gönderilir. mRNA kodlayan kodlamayan dizi dizi Ökaryotik mRNA 5’ şapka Ökaryotik hücrede, çekirdekte (nükleus) heterojenik nuklear RNA (hnRNA) yada pre-mRNA (Öncül RNA) olarak sentezlenir ve transkripsiyon sonrası 5' şapka ve 3' kuyruk eklenir. Bunlar ileride sitoplazmada stabil kalması için önemlidir. RNA splicing (kırpılması) ile intronlar çıkarılıp, transkripsiyon sonrası işlenmesi tamamlanınca olgun mRNA haline gelir. Ökaryotik hücrede tüm RNA’ların SADECE %1-5’ini oluşturur.  RNA SENTEZİ = TRANSKRİPSİYON RNA polimeraz: Sentez her zaman 5’→3’ yönündedir. Sentezi başlatmak için primere ihtiyaç yoktur genome.gov Transkripsiyon-Replikasyon Farkları 1. Replikasyon sırasında tüm kromatin kopyalanır fakat transkripsiyonda sadece bir gen bölgesi kopyalanır/kullanılır. 2. Transkripsiyon düzeyi organizmanın o andaki protein ihtiyacına bağlı olarak değişir. Her dokuda aynı anda farklı genlerin transkripsiyonu olur. 3. Transkripsiyon, replikasyonda olduğu gibi bir primer’e ihtiyaç duymaz. Transkripsiyon için sadece bir DNA zinciri kalıp olarak iş görür. 4. DNA segmentinin başı ve sonunu belirleyen spesifik düzenleyici dizeler hangi DNA segmentinin şablon (kalıp) olarak kullanılacağını gösterir. 5. RNA polimeraz, transkripsiyon faktörleri yardımı ile promotora bağlanarak sentezi başlatır. 6.RNA polimerazın proofreading aktivitesi (kendiliğinden hata onarma özelliği) yoktur.  Prokaryotlarda Transkripsiyon * Yapısal Genler p= Promotor dizi= RNA polimerazın t= termination (RNA sentezi başlatmak için bağlandığı sentezi için sonlanma korunmuş DNA dizisi sinyali) * +1 Pribnow kutusu  Prokaryotlarda Transkripsiyon Bakteriyal RNA polimeraz Kor enzim Aynı enzim mRNA, rRNA ve tRNA sentezinde kullanılır α E.coli RNA polimerazı, 2α, 1β, 1β’, 1ω ve 1σ olmak üzere 6 alt ββ’ω üniteden oluşur α β, polimeraz etkinliğine sahiptir, zincir başlatma ve uzatma dahil, RNA sentezini katalizler. σ, genin önündeki promotor bölgeye özgül olarak bağlanarak + σ transkripsiyonu başlatır Haloenzim kompleksi  Prokaryotlarda Transkripsiyon Sonlanma (7): Başlama (1-3): Genin sonunda bulunan Prokaryotlarda GC tekrarları ve bunları transkripsiyonun izleyen 4-5 tane A düzenlenmesinde en sentezlendikten sonra bir önemli evredir. sap-iplik (hair-pin) oluşur RNA pol kor enzim yada sonlandırma faktörü özgül olmayan şekilde rho buradaki diziye DNA’ya bağlanır tutunur. σ alt ünite’nin -35/-10 Buda RNA’nın serbest promotora özgül şekilde kalmasını sağlar bağlanmasıyla haloenzim oluşturulur Elongasyon (4-6): ve DNA bu bölgeden RNA pol β alt ünitesi açılır tarafından 5’→3’ transkripsiyon başlar yönünde sentezlenen ve σ alt ünite serbest zincir uzar. kalır  Ökaryotlarda Transkripsiyon Ökaryot RNA Hücre içi Ürünleri polimerazları yerleşimleri RNA polimeraz I 5.8S, 18S, 28S rRNA’lar Nükleolus RNA polimeraz II mRNA, miRNA, lncRNA Nükleoplazma RNA polimeraz III tRNA, 5S rRNA, snRNA, sc RNA Nükleoplazma Mitokondrial Mitokondriyal genler Mitokondri Kloroplast Kloroplast genleri Kloroplast Ökaryotik RNA polimeraz, transkripsiyon faktörleri yardımıyla promotora bağlanır  Ökaryotlarda Transkripsiyon Ökaryot Genlerinin Promotor Bölgesi Örnek: Bu promotor TATA kutusunun yanında 1 CCAAT kutusu ve 2 GC kutuları içerir. (korunmuş dizisi GGGCGG). The Cell by GM Cooper. NCBI Online Books  Ökaryotik transkripsiyonda rolü olan gen üzerinde korunmuş diziler Başlamak için Sentez sonrası işlenme için Sonlandırmak için TF = Transkripsiyon Faktörleri Ökaryotik RNA polimerazın, transkripsiyonu başlatmak üzere, promotöre bağlanmasını sağlayan, DNA’ya bağlanabilen proteinlerdir. DNA’ya bağlanabilme özelliğini sağlayan yapıları: çinko parmak, sarmal-ilmik sarmal, sarmal-dönüş-sarmal, lösin fermuarı İlk olarak TATA box’a bağlanan TFIID’dir. TFIID, TATA-binding protein (TBP) ve TBP-assosiye faktörler (TAF) olmak özere iki alt birimden oluşur. Genel Sonrasında TFIIB’nin TBP’ye bağlanması, TFIIF’ye bağlı RNA pol II’nin promotora gelmesini TF’ler sağlar. Son olarak, TFIIE ve TFIIH’nin bağlanmasıyla bazal transkripsiyon başlama kompleksi oluşturulmuş olur. Regülator bölgelere regülatör proteinlerin bağlanması, yine genin çok uzağında olabilen Özel enhancer (kuvvetlendirici) bölgelere aktivatör proteinlerin bağlanması transkripsiyonun TF’ler başlamasını, ne zaman ve ne kadar olması gerektiğini kontrol edecektir. RNA polimeraz II ve transkripsiyon faktörleri Transkirpsiyonun başlama noktası * Preinisiasyon kompleksi CTD TAF TAF diğer faktörler C-ucun fosforillenmesi CTD = C terminal domain * +1 RNA polimeraz II ve transkripsiyon faktörleri RNA polimeraz I ve transkripsiyon faktörleri RNA polimeraz III ve transkripsiyon faktörleri  Ökaryotlarda Transkripsiyon Ökaryotlarda mRNA sentezinin başlatılmasında RNA pol II’nin etkin bağlanmasını sağlayan, DNA üzerinde cis-acting düzenleyici diziler vardır. Bunlar Başlıca TATA kutusu’dan oluşan kor promotor elemanları TATA kutusunun hemen yakınındaki (proksimalindeki) CAT ve GC kutuları Kontrol edilen genden çok uzağında (distalinde) olabilen çoğunlukla doku-özgül aktivatörlerin bağlanmasıyla transkripsiyonu kontrol eden enhancer (kuvvetlendirici) diziler Kontrol edilen genden çok uzağında olabilen, transkripsiyonun başlamasını engelliyerek kontrolünü sağlayan silencer (susturucu) diziler  Complex assemblies Ökaryotik of proteins control transkripsiyonun kontrolü eukaryotic transcription A variety of regulatorycis- proteins interact acting elemanlar with DNA and each other (DNA dizileri) Enhancers Promoter Gene DNA Activator Transcription proteins Trans- acting faktörler factors Other (proteinler) proteins RNA polymerase DNA’nın bellenmesi Transcription Videolar: Campbell NE et al (Eds): http://www.youtube.com/watch?v=P6Nyce-4oG4 Biology: Concepts & Connections th RNA işlenmesi rRNA işlemlenmesi rRNA işlenmesi nükleolus (çekirdekcik) da gerçekleşir snoRNA’lar intronların çıkarılmasında görev alır ribozomal alt üniteler Ribozomal alt üniteler sitoplazmaya (=rRNA+protein) çekirdekcikten çıkarılır sitoplazmaya geçer ve Ribozomal proteinler sitoplazmada yapılır translasyonda görev alır ve nükleolusa taşınır RNA işlemlenmesi tRNA’ların işlenmesi Gen ekspresyonunda rolü olan başlıca RNA’lar RNA TİPLERİ İŞLEVLERİ mRNA’lar mesajcı RNA’lar, proteinleri kodlar rRNA ’lar ribozomal RNA’lar, ribozomun yapısında bulunur ve protein sentezini katalizler tRNA ’lar taşıyıcı RNA’lar, mRNA ve aminoasitler arasındaki adaptör molekül olarak protein sentezinin merkezini oluşturur snRNA ’lar small nuclear RNAs (küçük çekirdek RNA’ları), çekirdekte pre-mRNA’nın işlenmesi sırasında görev alan spliceosomes kompleksinin yapısında bulunur. snoRNA ’lar small nucleolar RNAs (küçük çekirdekçik RNA’ları), rRNA’ların işlenmesinde kullanılır miRNA ’lar mikro RNA’lar (yaklaşık 20 bp) bazı genlerin transkripsiyon sonrası yıkımı ve böylelikle ekspresyonunun durum bağımlı olarak düzenlenmesi lnc RNA’lar Uzun kodlanmayan RNAlar (en az 200bp), Transkripsiyon sonrası kontrolde kullanılırlar  mRNA’nın sentez sonrası işlenme RNA Polimeraz II’ nin C ucunun fosforillenmesi önemlidir (CTD= C terminal Domain) 1-mRNA’nın sentez sonrası 5‘- ucunun işlenmesi 1. Transkripsiyon henüz tamamlanmadan RNA polimeraz enziminin ilerlemesiyle ortaya çıkan 5‘- ucuna, “CAP” adı verilen 7-metil guanozin şapkasının eklenmesi 2. mRNA’yı parçalanmaktan korur 3. Translasyonun başlaması için gerekir 4. Çekirdekte gerçeklerşir 2. mRNA’nın sentez sonrası 3‘- ucunun işlemlenmesi ya da modifikasyonu 1-Transkripsiyon tamamlnadıktan sonra, yine Kalıp DNA türler arasında korunmuş konsensus dizilerden biri olan hekzanukleotid “ AAUAAA” diziyi tanıyan bir endonükleaz şapka yardımıyla, bu diziden 20-30 nükleotid sonraki mRNA bölümü çıkarılır 2-Kesilen uca yaklaşık 200 kadar adenin nükleotidi bir polimeraz yolu ile eklenir. Birden fazla adenin nükleotidi eklendiği için Poly- A adı verilmiştir endonukleaz Poliadenilasyon polimeraz 3. RNA splays (pre-RNA’dan intronların çıkarılması) Korunmuş splicing dizileri 200 den fazla hastalık splays hataları sonucu oluşmaktadır. Öncül mRNA’nın splicing’i ; Kement (Lariant) modeli (splayzozom yoluyla uçları birbirine ekleme) Hücre çekirdeğinde gerçekleşir Spliceosome = snRNA (U1,U2, U4, U5, U6) + protein Öncül mRNA = splayzozom= snRNP= small nuclear RNA protein kompleksi Kement halinde çıkan intron dizileri çekirdekte yıkılırken snRNP ler tekrar kullanılacaktır mRNA Alternatifli kırpılma (splicing)  Generating İnsan Genomundan Protein Diversity çok çeşit protein from yollarından oluşumunun the “Small” Human Genome biridir. Transkripsiyon ve alternatifli splays sonrası  4-RNA editing (yeniden yapılandırılması) RNA editing transkripsiyon sonrası RNA dizisinin değişmesidir. Editleme yolu ile Nükleotit eklenebilir, çıkarılabilir veya değiştirilebilir. İki mekanizma ile gerçekleşir. Rehber RNA-aracılıklı uridin insersiyon yada delesyon Nokta-özel deaminasyon 4-Örnek RNA editing (yeniden yapılandırılması) The C is converted to U in intestine by a specific deaminating enzyme, not by a guide RNA. RNA işlemlenmesi 5. RNA degradation RNA’ların Ekzozom ile taşınması miRNA ve mRNAların hücre dışına taşınmasını sağlayan mikro veziküller (MVE)dir. Bu şekilde diğer hücrelerin sitoplazmasında transkripsiyonun kontrolünü/engellenmesini sağlarlar Vücut sıvılarında (kan, tükürük, idrar..) bulunurlar. The cell , Geofrey M. Cooper Robert E Housmeb(“Hücreye Giriş” olarak çevirisi bulunmaktadır ) Molecular Biology of the cell. Ayrıca slaytlar üzerinde verilmiş olan internet adreslerinden yararlanılabilir [email protected]  KAYNAKLAR Bir kaynak mutlaka Türkçe olarak verilmelidir. Soru ve katkılarınız için [email protected] e-posta adresinden ulaşabilirsiniz (Dersi hazırlayan Öğretim Üyesinin e-posta adresi)