Southern Blot Technique PDF

Université Frères Mentouri Constantine 01 L3 Bioinformatique Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Année universitaire 2024/2025 Département de Biologie Appliquée Présenté par Dr Méziani.D.Y...

Université Frères Mentouri Constantine 01 L3 Bioinformatique Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Année universitaire 2024/2025 Département de Biologie Appliquée Présenté par Dr Méziani.D.Y Southern blot Le Southern blot est une technique décrite par Edwin Mellor Southern en 1975, professeur britannique de biologie moléculaire. Dans le but de rechercher spécifiquement des fragments de DNA sur électrophorèse en les hybridant avec une sonde complémentaire marquée par un radioisotope I. Principe du Southern blot Le Southern blot est une méthode utilisée pour la détection et la quantification d'une séquence d'ADN spécifique dans des échantillons d'ADN. Cette méthode est utilisée en biologie moléculaire. En bref, l'ADN purifié d'un échantillon biologique (tel que du sang ou des tissus) est digéré avec des enzymes de restriction, et les fragments d'ADN résultants sont séparés en utilisant un courant électrique pour les déplacer à travers un gel ou une matrice en forme de tamis, ce qui permet aux fragments plus petits de se déplacés plus rapidement que les fragments plus gros. Les fragments d'ADN sont transférés hors du gel ou de la matrice sur une membrane solide, qui est ensuite exposée à une sonde ADN marquée avec une étiquette radioactive, fluorescente ou chimique. L'étiquette permet de visualiser tous les fragments d'ADN contenant des séquences complémentaires avec la séquence de la sonde ADN dans le transfert de Southern. Le Southern blot combine le transfert de fragments d'ADN séparés par électrophorèse vers une membrane filtrante dans un processus appelé transfert, et la détection ultérieure des fragments par hybridation de sonde. II. Étapes du Southern blot Les étapes successives de cette technique sont les suivantes : 1. Isolement de l'ADN : L'ADN génomique à étudier est isolé de divers tissus. La source d’ADN la plus appropriée est le tissu sanguin. Cependant, il peut être isolé à partir de différents tissus (cheveux, sperme, salive…). 2. Digestion de l'ADN : L’ADN à étudier est digéré à l’aide d’enzymes de restriction différentes en de très nombreux fragments 1 3. Électrophorèse sur gel : Les fragments d'ADN sont ensuite soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose pour les séparer par taille. 4. Dénaturation : Le gel d’électrophorèse est ensuite immergé dans une solution alcaline (hydroxyde de sodium) afin de permettre la dénaturation de l’ADN bicaténaire en ADN monocaténaire. La dénaturation dans un environnement alcalin peut améliorer la liaison des résidus thymine chargés négativement de l'ADN à des groupes aminés chargés positivement de la membrane, en les séparant en brins d'ADN simples pour une hybridation ultérieure avec la sonde, et détruit tout ARN résiduel qui pourrait toujours présent dans l'ADN. 5. Blot (Transfert sur membre de nitrocellulose ou nylon) : Une feuille de membrane de nitrocellulose ou de nylon est placée au-dessus du gel recouvert d’une pile de papier absorbant, l’ensemble est comprimé par un poids de façon à exercer une pression constante sur le gel et assurer un contacte uniforme entre le gel et la membrane. Les fragments sont transférés grâce à une montée par simple capillarité de tampon imprégnant le gel déplaçant l'ADN du gel vers la membrane. L’emplacement des fragments séparés par l’électrophorèse est conservé au cours du transfert. 6. Immobilisation : La membrane est ensuite cuite sous vide ou dans un four ordinaire à 80 °C pendant 2 heures dans le cas de nitrocellulose ou exposée à un rayonnement ultraviolet s’il s’agit de nylon, pour fixer de manière permanente l'ADN transféré à la membrane. 7. Hybridation : La membrane avec l’ADN fixé est ensuite incubée dans une solution contenant une sonde marquée (par radioactivité ou avec un colorant fluorescent) complémentaire du fragment d’ADN dont on recherche a révélé la position, la température d’incubation est assez basse pour que l'hybride se forme mais assez élevée pour que cet hybride soit parfaitement complémentaire. 8. Rinçage : La membrane est ultérieurement lavée des molécules de la sonde qui ne sont pas fixées à leur DNA complémentaire. 9. Révélation : Selon le type de sonde utilisée, la position sera déterminée par autoradiographie ou par fluorescence. L’information obtenue est double : la présence de marquage confirme la présence de la séquence d’intérêt et sa position permet de déterminer la taille du fragment de restriction. 2  Poids III. Interprétation des résultats : L'hybridation de la sonde avec un fragment d'ADN spécifique sur la membrane filtrante indique que ce fragment contient une séquence d'ADN complémentaire à la sonde. L'étape de transfert de l'ADN du gel d'électrophorèse vers une membrane permet une liaison aisée de la sonde d'hybridation marquée à l'ADN fractionné selon la taille. Il permet également la fixation des hybrides cible-sonde, nécessaires à l'analyse par autoradiographie ou autres méthodes de détection. Les transferts Southern réalisés avec de l'ADN génomique digéré par une enzyme de restriction peuvent être utilisés pour déterminer le nombre de séquences (par exemple, des copies de gènes) dans un génome. Une sonde qui s'hybride uniquement avec un seul segment d'ADN qui n'a pas été coupé par l'enzyme de restriction produira une seule bande sur un transfert de Southern, alors que plusieurs bandes seront probablement observées lorsque la sonde s'hybride avec plusieurs séquences très similaires (par exemple, celles qui peut être le résultat d’une duplication de séquence). La sonde va révéler la position sur la membrane des fragments d'ADN recherchés. Plusieurs situations peuvent se présenter :  Les fragments d'ADN sont semblables au lieu d'hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci et les fragments sont de même taille : il n'y a pas de polymorphisme.  Un site de restriction au voisinage de la sonde n'est présent que chez l'un des deux individus ; les fragments n'ont pas la même taille et ne sont donc pas à la même hauteur sur le gel : il y a polymorphisme de sites de restriction. 3 IV. Application de la technique du Southern blot : Le Southern blot peut détecter la présence des gènes homologues entre les espèces. Par exemple, si un gène d’intérêt biologique a été localisé chez le rat, il est possible de construire une sonde marquée à partir du gène de rat et de l'utiliser pour rechercher un gène homologue chez l'homme par analyse Southern bolt. Le transfert d'ADN peut également être utilisé pour évaluer le nombre de copies d’un gène spécifique, ce qui constitue une réponse à l’effet des conditions particulières de l'environnement et explique souvent la résistance aux médicaments dans les cellules de mammifères. L'analyse Southern permet d'identifier des mutations, des délétions ou des réarrangements qui altèrent l'intégrité d'un gène spécifique, ce qui peut être utile dans le pronostic de certains types de cancer et dans le diagnostic prénatal de maladies génétiques. De plus, le Southern blot est un outil précieux pour le clonage moléculaire, offrant un mécanisme de localisation des séquences spécifiques dans des clones d’ADN de bactériophages et de cosmides. 4