Biotecnologias da Reprodução - Guia Completo PDF

29/04/2022 Biotecnologias da Reprodução Sêmen: coleta, análise e transporte Profa. Bianca Gerardi A avali...

29/04/2022 Biotecnologias da Reprodução Sêmen: coleta, análise e transporte Profa. Bianca Gerardi A avaliação criteriosa da função reprodutiva de touros é Andrologia um dos critérios utilizados na seleção para se verificar e ou predizer seu potencial reprodutivo. Fornece subsídio para a principal estratégia usada no melhoramento genético dos animais. Introdução de novos reprodutores, geneticamente superiores Uso em monta natural, inseminação artificial (fresco, congelado ou refrigerado) ou fertilização in vitro. 1  29/04/2022 Sabe-se que entre 15 a 25% dos touros utilizados em monta natural podem ter algum problema Andrologia reprodutivo identificável por meio do exame andrológico 1. Avaliação comportamental do reprodutor (libido presente?) 2. Avaliação clínica do animal (é capaz de cobrir?) 3. Espermograma / avaliação do ejaculado Andrologia Espermograma Análise física Volume Coloração Aspecto pH 2  29/04/2022 Andrologia Espermograma Características de movimentação dos sptz Motilidade total e Vigor Turbilhonamento progressiva Andrologia Espermograma Quantificação dos sptz Número de sptz Concentração Número total móveis / (sptz/mL) (sptz/ejaculado) ejaculado 3  29/04/2022 Andrologia Espermograma Avaliação morfológica dos sptz Estudo anatômico do gameta masculino Andrologia Importante lembrar que o ejaculado é o resultado de uma composição de eventos dos últimos 62 dias. 4  29/04/2022 Avaliação do sêmen Condição ideal para coleta e avaliação: Animal adaptado ao procedimento Estimulação sexual adequada Mínimo estresse Repouso sexual de 5 a 7 dias. Como coletar Vagina artificial (equinos e bovinos) Manipulação peniana (cães e suínos) Eletroejaculação (animais silvestres e felinos; bovinos) Estimulação elétrica lombossacral, mimetizando o reflexo ejaculatório 5 29/04/2022 6  29/04/2022 www.uece.br Coleta de sêmen cães Excitação mecânica: Técnica consiste em uma excitação manual do corpo do pênis. Desvantagens: método restrito a animais mansos e treinados e oferece um risco potencial de contaminação do Colheita de sêmen no cão: a) início da excitação, b) sêmen por sujidades do ambiente. manipulação contínua, c) desprezo da primeira fração, d) colheita da fração espermática Coleta do sêmen / equinos A coleta deverá acontecer em um local apropriado, onde o piso não seja liso para evitar que o garanhão, a égua em estro e a equipe se machuquem. O piso deve ser emborrachado ou de areia Antes da coleta, o pênis do garanhão deverá ser higienizado com mantas de algodão umedecidas em água morna (aproximadamente 33º C). 7  29/04/2022 Coleta do sêmen / equinos Para coletar o sêmen com a vagina artificial é preciso utilizar um manequim ou uma fêmea em estro que deverá estar contida adequadamente para evitar traumas. A equipe responsável pela coleta, desde a hora em que o garanhão é cabresteado para realizar a monta, precisa ter muito cuidado e atenção para evitar acidentes e fazer com que a coleta seja realizada de forma calma e rotineira. 8  29/04/2022 Coleta de sêmen equinos https://www.youtube.com/watch?v=JdhKsA- T8Lc https://www.youtube.com/watch?v=vJCu897Isi8 Coleta do sêmen / equinos O médico veterinário deverá desviar o pênis do garanhão lateralmente e introduzi-lo na vagina artificial. O pênis só deve ser retirado após a ejaculação, enquanto o garanhão desce da égua/manequim. Para constatação da ejaculação podem ser verificadas as seguintes características: Movimento da cauda para cima e para baixo; Sapatear; Contração dos músculos perineais; Fluxo pulsátil da ejaculação. Após coletado, o material recolhido precisa ser enviado para o laboratório, a fim de ser analisado. 9  29/04/2022 Coleta do sêmen / equinos Coleta de sêmen / Equinos Vagina artificial modelo Botucatu: Tubo rígido Mucosa de látex Copo coletor protegido de luz e alterações de temperatura. 10  29/04/2022 Coleta de sêmen / equino A vagina deve preenchida com água quente, para permanecer com temperatura de 42-45°C para colheita. Coleta do sêmen Após a colheita: separação da fração gelatinosa do ejaculado da fração rica em espermatozoides Gelatinosa SPTZ Evitar efeitos nocivos à célula espermática. 11  29/04/2022 Avaliação do sêmen Filtragem Retenção da fração gelatinosa Retenção de parte dos contaminantes bacterianos e além de sujidades (elementos estranhos) A filtragem é realizada através do acoplamento de um filtro ao copo coletor de sêmen, ou realizada imediatamente após sua coleta. Coleta do sêmen Imediatamente após a coleta: Colocar os tubos coletores em banho-maria a 35°C Manter durante todo processo de avaliação dos aspectos físicos e diluição do sêmen Posteriormente realizar o processo de refrigeração 12  29/04/2022 Avaliação do sêmen Mensurar volume da fração rica em spz Avaliar coloração – sangue, urina, pus, sujidades de pênis e prepúcio. Para o garanhão, o normal é a coloração branca acinzentada A maioria dos garanhões ejacula entre 25 e 80 ml de fração rica em espermatozoides Avaliação do sêmen O volume ejaculado, apesar de seguir padrão de normalidade para cada espécie, é menos importante que o número de sptz. pH do sêmen: 7,2 a 7,7 maioria das espécies Cão pH 6,5 13  29/04/2022 Concentração espermática Neubauer A contagem é realizada após a diluição Diluição: formol salina ou água Facilita a contagem 14  29/04/2022 Concentração espermática Cada lado da câmara possui 25 quadrados, dos quais no mínimo, 5 deverão ter os espermatozoides contados. Fazer a contagem em L ou L invertido dos espermatozoides que se encontram sobre a linha. Contar os 5 quadrados na diagonal, e fazer a média dos dois lados da câmara Espermatozóides que apresentam apenas a cauda dentro do quadrado não são contados. 15  29/04/2022 Concentração espermática Concentração espermática Concentração = N x 5 x 200 x 10 x 1000 N = média dos espermatozoides contados nos dois lados da câmara 5 = número de quadrados contados em1mm2 ou em cada 25 200 = fator de diluição 10 = fator de profundidade da câmara 1000 = para a transformação para mL. 16  29/04/2022 Concentração espermática Exemplo: Foram contados no lado 1 = 78 e lado 2 = 64, portanto, 78 + 64/2 = 71 =N Diluição 1:200 (10 µL de sêmen em 2 mL de água). Concentração = 71 x 5 x 200 x 10 x 1000 = 710.106 espermatozoides/mL. Concentração espermática Multiplicando pelo volume do ejaculado: número total de sptz. 17  29/04/2022 Movimento espermático Motilidade Total: percentual de sptz que estão se movimentando, não importa a direção Progressiva: Percentual de sptz que se movimentam para frente de forma retilínea Vigor Velocidade do deslocamento do sptz Colocar uma gota (10µL) entre lâmina e lamínula, previamente aquecidas a 37°C, para avaliação da motilidade espermática progressiva retilínea (expressa em porcentagem) e o vigor espermático (escala de zero a cinco) com aumento de 100 a 400 vezes. Movimento espermático Turbilhonamento Movimento em massa (esperado apenas em ruminantes) Colocar uma gota de sêmen (10µL) do ejaculado na lâmina, previamente aquecida a 37°C (placa aquecedora), para observação do turbilhonamento (escala de zero a cinco) em microscópio ótico com aumento de 100 vezes. 18  29/04/2022 Avaliação geral / bovinos O sêmen normal do bovino deve apresentar, no mínimo, 60% de sptz com mobilidade progressiva retilínea e vigor 5/5. CBRA: não mais do que 5% do mesmo defeito maior e não mais do que 10% do mesmo defeito menor. Não mais do que 30% de defeitos ao total. [ ] espermática de 0,6 a 1,2 bilhão/mL. Avaliação geral / equinos Volume médio 60mL 70% de motilidade 70% de sptz normais no ejaculado 3,9 bilhões de sptz por ejaculado [ ] 100 a 200 milhões/ml Sofre influência da sazonalidade 19  29/04/2022 Avaliação do sêmen Morfologia espermática Estudo anatômico do gameta masculino, ou seja, da célula espermática. Avaliação do sêmen Particularidades dos equinos Cabeça pequena e assimétrica Pequeno acrossoma Implantação abaxial da cauda 20  29/04/2022 Morfologia espermática Preparo de material : Colocar uma gota de sêmen em uma lâmina e realizar um esfregaço Fixar o esfregaço em metanol Corar a lâmina com corantes Ex:. Karras modificado por Papa et al. (1998) (2 minutos no Rosa Bengala, lava-se a lâmina em água corrente fraca, então põe-se 1 min no Tanino, lava-se novamente e 30 segundos no Azul Vitória, lava-se a lâmina, deixa secar, observa-se em microscopia de luz (óptica) aumento de 1000x). Morfologia espermática Contar 200 células, percorrendo a lâmina de forma homogênea 21  29/04/2022. Morfologia espermática Cabeça: Núcleo achatado de forma oval, contendo a cromatina altamente compactada Extremidade anterior recoberta pelo acrossomo Acrossomo: dupla camada de membranas que envolvem o núcleo durante os últimos estágios de formação do spz. Contém enzimas.. Morfologia espermática Cauda: Peça intermediária Peça principal Peça terminal 22  29/04/2022 Morfologia espermática Os espermatozoides saem dos testículos ainda imaturos, apresentando resquícios do citoplasma, incompleta condensação da cromatina, insuficiente conteúdo proteico e de outros componentes da membrana plasmática. Morfologia espermática Se durante o trajeto pelo epidídimo os espermatozoides não finalizarem a sua transformação morfológica devido a algum distúrbio, eles apresentarão alterações na sua morfologia, que poderão afetar o processo de fecundação. 23  29/04/2022 Morfologia espermática Morfologicamente, o espermatozoide tem que sair no ejaculado já maduro cromatina completamente condensada membrana acrossomal íntegra e sem deformação peça intermediária sem danos flagelo livre de gota citoplasmática Morfologia do sêmen Avaliação do sêmen = controle de qualidade Morfologia ideal / perfeita : Capacidade de atingir e penetrar um oócito DNA transportado intacto e capaz de sustentar o desenvolvimento embrionário 24  29/04/2022 Avaliação do sêmen Tipo de defeito = origem Espermatogênese Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Existe correlação entre alteração na morfologia e infertilidade? Correlação pode variar de 0,06 a 0,86 Baixa a alta correlação com fertilidade Fertilidade Morfologia 25  29/04/2022 Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Classificação Defeitos maiores alterações de acrossomo, a presença de gota citoplasmática proximal, patologias de cabeça, alterações de peça intermediária, patologias de cauda e formas teratológicas Defeitos menores patologias da cabeça, alterações de inserção entre peça intermediária e cabeça, cauda dobrada ou enrolada e gota citoplasmática distal Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Alterações do acrossomo / Defeitos maiores Acrossomo rompido Acrossomo enrugado ou dobrado Acrossomo destacado knobbed acrosome ou grânulo persistente do acrossosso 26  29/04/2022 Knobbed sperm Estresse térmico, intoxicações, genético Baixa taxa de fecundação, motilidade normal 27  29/04/2022 Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Gota citoplasmática proximal e distal Origina-se nas fases finais da espermiogênese Manutenção dos corpos residuais oriundos das organelas que compunham o citoplasma das espermátides Distal: Permanência após ejaculação é considerada defeito de menor importância do que a gota proximal. Possibilidade da gota ser eliminada durante o trajeto do espermatozoide no trato reprodutivo feminino Gota citoplasmática proximal e distal Degeneração do epitélio seminífero / estresse térmico Baixa motilidade 28  29/04/2022 Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Patologias da cabeça espermática / Defeitos maiores Estruturas subdesenvolvidas Cauda enrolada na cabeça Cabeça isolada patológica Cabeça estreita na base Cabeça piriforme Cabeça pequena anormal Contorno anormal da cabeça Presença de vacúolos na cabeça / Pouch formation Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Patologias da cabeça espermática / Defeitos menores Cabeça delgada Cabeça gigante Cabeça curta Cabeça larga Pequena normal Isolada normal 29  29/04/2022 Defeitos de cabeça: 11. Normal; 12. Delgada; 13. Alongada;, 14-15. Delgada na base; 16. Piriforme; 17 e 19. Grande; 18. Pequena normal; 20. Arredondada ou globosa; 21. Pequena patologica; 22. Cabeças duplas. Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Alterações de peça intermediária / Defeitos maiores Fibrilação Fratura total Fratura parcial Edema Pseudogotas 30  29/04/2022 Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Alterações de peça intermediária / Defeitos menores Inserção abaxial Inserção retroaxial Inserção oblíqua Em equinos, a inserção abaxial é considerada como normal 23 Grossas; 24. Pseudogota; 25. Filiforme; 26. Mordida; 27. Implantação abaxial; 28. Saca-rolha; 29 e 33. Desassociada ou com aplasia segmentar; 30. Dupla; 31. Dividida; 32. Desdobrada; 34. Quebradas, 35. Dobrada na cabeça 31  29/04/2022 Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Patologias da cauda / Defeitos maiores Cauda fortemente dobrada Cauda fortemente enrolada Cauda dobrada com gota citoplasmática distal Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Patologias da cauda / Defeitos menores Cauda dobrada Cauda enrolada Cauda com gota citoplasmática distal 32  29/04/2022 36-37. Cauda dobrada simples; 38. Caudas enroladas simples; 39-40. Fortemente enrolada ou dobrada; 41. Cauda e peça intermediaria enrolada na cabeça; 42. Gota citoplasmática proximal; 44-45. Gota citoplasmática distal; 46. Cabeça isolada normal ou decapitada. Morfologia espermática: origem, interpretação e impacto na fertilidade Formas teratológicas / Defeitos maiores Espermatozoides aberrantes, contendo cabeça, cauda e/ou peça intermediária supranumerária. São alterações que ocorrem durante a espermatogênese e, quando em grande número pode afetar a fertilidade severamente. 33  29/04/2022 CASA- Análise Computadorizada de Sêmen É um sistema computadorizado e automático de captura e análise de sucessivas fotos dos espermatozoides, as quais, quando unidas, formam um filme com o trajeto de cada célula. Por esse sistema é possível obter informações mais precisas e acuradas do movimento de cada célula espermática https://www.youtube.com/watch?v=6fPzn7fo1EY (tradicional) https://www.youtube.com/watch?v=SRV_C3L3H9Y (CASA) Seleção de reprodutores Apto –Podem ser utilizados Questionável –Reavaliados Inapto –Imediatamente afastado Reavaliação constante –Aptos e questionáveis Touros adultos = mínimo de 1 andrológico 1 x ao ano, 60 dias antes da estação Doadores de sêmen = Avaliação a cada 60-70 dias e de todos os ejaculados Comportamento sexual = Libido, cópula, comportamento. 34  29/04/2022 Seleção de reprodutores Reprodutor é todo animal doador utilizado para coleta e industrialização de sêmen nos Centros de Coleta e Processamento de Sêmen (CCPS). Todos os reprodutores doadores de sêmen em CCPS devem estar inscritos junto ao MAPA. PROTOCOLO PARA CERTIFICADO DE EXAME ANDROLÓGICO –CBRA (DADOS MÍNIMOS OBRIGATÓRIOS) IDENTIFICAÇÃO Nome do reprodutor Espécie Raça Nº Registro genealógico Data de nascimento Proprietário do reprodutor Endereço Telefone 35  29/04/2022 PROTOCOLO PARA CERTIFICADO DE EXAME ANDROLÓGICO –CBRA (DADOS MÍNIMOS OBRIGATÓRIOS) DATA DO EXAME ANAMNESE EXAME CLÍNICO Condição Geral –Principalmente locomotor Sistema genital Escroto Cordões espermáticos Testículos (simetria, consistência, forma, posição, mobilidade, sensibilidade, medidas) Epidídimos Prepúcio Pênis Comportamento sexual e índole PROTOCOLO PARA CERTIFICADO DE EXAME ANDROLÓGICO –CBRA (DADOS MÍNIMOS OBRIGATÓRIOS) AVALIAÇÃO SEMINAL Método de colheita Atividade sexual no período próximo Características do sêmen Volume, cor, turbilhonamento, motilidade, vigor, concentração, nº total de espermatozoides Morfologia espermática –Normais, def. maiores, def. menores Outros elementos DIAGNÓSTICO E CONCLUSÃO Apto, Questionável, Inapto Data MedVet–CRMV Endereço / tel/ E-mail 36  29/04/2022 Fresco Diluído Sêmen Resfriado Congelado O que levar em consideração: Localização da(s) propriedade(s) Momento inseminante (pré e/ou pós-ovulação) Número total de espermatozoides Volume Diluidor Temperatura do armazenamento Características individuais de qualidade do sêmen do garanhão Valor do sêmen Etc 37  29/04/2022 O que levar em consideração: A utilização de sêmen fresco, diluído e resfriado implica em maior flexibilidade de manejos de controle folicular, momento e local de deposição do sêmen. Sêmen congelado exige um manejo mais rígido, palpações retais mais frequentes e, quanto ao local de deposição, preferencialmente, o mais profundo no corno uterino ipsilateral à ovulação Sêmen fresco in natura Colhido e utilizado, imediatamente, no Vantagens Desvantagens próprio local. Economia Perde em Rapidamente se perdem os parâmetros com diluidor qualidade de motilidade e vigor, além do espermática metabolismo espermático manter-se elevado. 38  29/04/2022 Sêmen fresco in natura O local de deposição pode ser o corpo ou o corno uterino, e o volume espermático deve ser de até 3 ml O regime de inseminação utilizado mais recomendado é de inseminação a cada 48 horas, a partir da detecção de um folículo ovariano de 3 a 3,5 cm ou a partir do segundo dia da detecção da égua em cio. Sêmen diluído O sêmen diluído tem como vantagens: Tratamento antibiótico, diminuindo a contaminação bacteriana Diluição de fatores tóxicos presentes no plasma seminal Melhora da fertilidade do sêmen devido ao aporte de nutrientes contidos no diluidor 39  29/04/2022 Sêmen diluído O sêmen diluído tem como vantagens: Maior flexibilidade de inseminação: o sêmen depois de diluído, dependendo da situação, pode ser transportado em curtas distâncias sem necessidade de resfriamento, entre haras próximos e, se devidamente protegido dos raios solares até uma hora, sem prejuízo da fertilidade. Possibilidade do fracionamento para maior número de éguas pela expansão do volume diluidor mais o sêmen. Diluidores Os diluidores utilizados para sêmen equino são constituídos por: Água Tampões Substâncias não iônicas Açúcares Diferentes tipos de macromoléculas e antibióticos. 40  29/04/2022 Diluidores De maneira geral os diluidores podem ser divididos em quatro grupos: Salinos Com gema de ovo Com leite e derivados Com albumina sérica bovina 41  29/04/2022 Sêmen diluído resfriado Os sistemas mais utilizados em nosso país e no mundo são sistemas de refrigeração e resfriamento passivos, que são feitos em caixas (containers). Conservação e transporte As características de um bom container de transporte de sêmen equino devem seguir algumas condições como: Completo isolamento ambiente Baixo custo Ser inócuo para os espermatozoides Manutenção da temperatura para o período proposto Ser possível realização de curva de resfriamento lento Características para ser aceito pelos sistemas de transporte aéreo e terrestre Seguro contra violações; entre outras situações adversas De acordo com o sistema deixará o sêmen resfriado a 15 – 20ºC ou refrigerado a 4 – 6ºC. 42  29/04/2022 Conservação e transporte Por que reduzir a temperatura? Conservação por diminuição do crescimento bacteriano Redução do metabolismo espermático Conservação e transporte O sêmen mantido a 5ºC pode ser utilizado por até 48 horas. O sêmen mantido a 15 - 20ºC deve ser utilizado de preferência entre as 12 horas de sua colheita. Nem todos os garanhões se prestam ao resfriamento de sêmen, pois apresentam baixa motilidade espermática progressiva após o resfriamento. 43  29/04/2022 Dose inseminante As inseminações com sêmen fresco devem ser realizadas utilizando-se entre 500 a 1000x106 sptz viáveis. As amostras com sêmen refrigerado devem conter 1000x106 sptz viáveis. Sêmen congelado Cálculo do número de palhetas a serem congeladas: Cada palheta deve conter 100 milhões de espermatozoides viáveis. Desta forma para o cálculo do número de palhetas basta dividir por 100 o número total de espermatozoides viáveis do ejaculado. 44  29/04/2022 Sêmen congelado Um ejaculado de 50 mL com motilidade total de 80% e concentração espermática de 100 milhões por mL. Total de espermatozoides viáveis neste ejaculado: 50 mL x 100 milhões x 80% = 4 bilhões de espermatozoides viáveis dividido por 100 milhões = 40 palhetas. Sêmen congelado / passo a passo Centrifugação: deve ser feita para eliminar o plasma seminal, com sêmen diluído na proporção de 1:1 Cálculo do volume final de ressuspensão: cada palheta contém 0,5mL, ou seja, multiplicar o número de palhetas por 0,5 que é o volume final da suspensão com o diluente de congelação. Ressuspensão: Após a parada da centrífuga, o sobrenadante de cada frasco deve ser imediatamente desprezado e os “pellets” devem ser ressuspendidos no diluidor de congelação 45  29/04/2022 Sêmen congelado / passo a passo Envasamento: Deve ser feito em palhetas de 0,5 mL. Estabilização: 20 minutos em refrigerador a 5 oC. Resfriamento rápido: 15 a 20 minutos em vapor de nitrogênio, mantendo entre 3 e 6 cm acima do nível do nitrogênio líquido, em caixa isopor térmica tampada (37 a 45 litros). Congelação: imersão das doses no nitrogênio líquido. Sêmen congelado / passo a passo Recomenda-se os seguintes requisitos para que uma dose congelada esteja apta inseminação artificial. Motilidade total >50% Vigor >3 Porcentagem de patologia espermática aceita: Defeitos menores < 20% Defeitos maiores < 20% Defeitos Totais < 40% 46