Sebenta de Microbiologia MICF 2014/2015 PDF

MICF 2014/2015 Índice Índice.................................................................................................................................................. 2 História da Microbiologia...................................................................................................

MICF 2014/2015 Índice Índice.................................................................................................................................................. 2 História da Microbiologia................................................................................................................... 5 Microscopia........................................................................................................................................ 6 Conceitos inerentes à microscopia................................................................................................ 6 Tipos de microscópio..................................................................................................................... 7 Preparação das amostras para microscópio óptico........................................................................... 9 Parede Celular.................................................................................................................................. 11 Peptidoglicano ou Mureína.......................................................................................................... 12 Fases da biossíntese do peptidoglicano....................................................................................... 13 Parede das bactérias de Gram-Positivo........................................................................................... 14 Parede das bactérias de Gram-Negativo.......................................................................................... 15 Paredes celulares e o mecanismo de coloração de Gram........................................................... 16 Resumo......................................................................................................................................... 17 Parede das bactérias ácido-álcool resistentes................................................................................. 17 Paredes celulares atípicas................................................................................................................ 19 Estruturas internas à parede celular................................................................................................ 19 Membrana citoplasmática........................................................................................................... 19 Citoplasma.................................................................................................................................... 22 Área nuclear................................................................................................................................. 22 Ribossomas................................................................................................................................... 22 Inclusões....................................................................................................................................... 23 Endosporos................................................................................................................................... 24 Esporolação ou esporogénese..................................................................................................... 25 Crescimento bacteriano na natureza............................................................................................... 25 Biofilme: organização para a sobrevivência................................................................................. 26 Biorremediação............................................................................................................................ 27 Crescimento bacteriano em laboratório.......................................................................................... 28 Meios de cultura.......................................................................................................................... 28 Cultura pura................................................................................................................................. 31 Crescimento bacteriano................................................................................................................... 32 Curva de crescimento................................................................................................................... 33 Matemática do crescimento........................................................................................................ 35 Medição do crescimento microbiano.......................................................................................... 37 2 Adriana Carreira  Factores ambientais que afetam o crescimento bacteriano....................................................... 41 Fatores nutricionais que influenciam o crescimento microbiano................................................ 52 Controlo dos microrganismos por agentes físicos e químicos......................................................... 53 Agentes físicos.............................................................................................................................. 54 Agentes químicos......................................................................................................................... 56 ¬ Agentes químicos esterilizantes........................................................................................... 56 ¬ Agentes químicos desinfetantes.......................................................................................... 57 ¬ Agentes químicos anti-sépticos............................................................................................ 57 ¬ Agentes químicos conservantes........................................................................................... 58 Metabolismo microbiano................................................................................................................. 58 Obtenção de energia pelos microrganismos................................................................................... 64 Glicólise........................................................................................................................................ 65 Noções de genética.......................................................................................................................... 71 DNA.............................................................................................................................................. 72 Mutagénese e mutações.............................................................................................................. 80 Filogenia – evolução dos organismos............................................................................................... 86 Cronómetro da evolução............................................................................................................. 88 Filogenia derivada da das sequências do rRNA............................................................................ 92 Características fenotípicas dos domínios com interesse filogenético......................................... 95 Taxonomia........................................................................................................................................ 96 Identificação................................................................................................................................. 97 Classificação................................................................................................................................. 98 Taxonomia numérica.................................................................................................................... 98 Quimiotaxonomia ou Taxonomia molecular................................................................................ 99 Categorias taxonómicas............................................................................................................. 103 Numenclatura................................................................................................................................. 103 Diversidade no mundo microbiano................................................................................................ 103 Fungi........................................................................................................................................... 104 Algas unicelulares....................................................................................................................... 113 Protozoários............................................................................................................................... 114 Archaea...................................................................................................................................... 114 Bacteria...................................................................................................................................... 114 Agentes infecciosos acelulares................................................................................................... 116 Ecologia microbiana e interações entre os microrganismos......................................................... 118 Ecologia microbiana................................................................................................................... 118 Adriana Carreira 3 Microbiologia Ambiental................................................................................................................ 124 Tratamento de resíduos............................................................................................................. 124 Poluentes.................................................................................................................................... 129 Microbiologia alimentar................................................................................................................. 129 Factores que influenciam o crescimento dos microrganismos nos alimentos.......................... 129 Microrganismos como alimentos e como suplementos alimentares........................................ 132 Doenças de origem alimentar.................................................................................................... 132 Deteção dos microrganismos nos alimentos............................................................................. 132 Fungos e micoses........................................................................................................................... 133 Questões no final da aula............................................................................................................... 147 4 Adriana Carreira  História da Microbiologia 1665 – descobre a célula através da observação de um corte fino de cortiça num Robert Hooke microscópio rudimentar da sua autoria (microscópio de 3 lentes – uma ocular, uma objetiva e uma lente de campo) Fez a primeira observação de microrgaismos vivos num microscópio com uma Antoine van ampliação de 200x; conclui que existem seres invisiveís, mas não consegui provar a Leeuwenhoek origem deles Explosão de descobertas que elevaram a microbiologia a uma ciência Idade de ouro da ¬ Descoberta de muitos agentes infecciosos microbiologia ¬ Imunidade (1857-1914) ¬ Melhoria das técnias de microscopia e cultivo ¬ Vacinas Cientista francês ao qual se devem várias descobertas: ¬ Fermentação ¬ Pasteurização ¬ Vacina contra a raiva ¬ Argumentos contra a teoria da geração espontânea: Louis Pasteur  Demonstrou que existem microrganismos no ar, mas este por si só não consegue criar vida  Demonstrou que os microrganismos podem-se encontrar em matéria não viva  Demonstrou que os microrganismos se podem destruir pelo calor ou pela interrupção da nutrição Médico, patologista e bacteriologista alemão; fez várias realixações: ¬ Métodos de coloração e fixação de bactérias para observação ao microscópio ¬ Descoberta e descrição de vários agentes etiológicos:  Bacillus anthracis – carbúnculo  Mycobacterium tuberculosis – tuberculose  Vibrio cholerae – cólera Robert Koch ¬ “Postulados de Koch” (4):  Um microrganismo específico deve estar sempre associado a cada caso de doença;  O microrganismo suspeito deve ser isolado e deve ser capaz de crescer em cultura pura em laboratório;  A inoculaçãoi daquela cultura deve ser capaz de produzir a mesma doença num animal susceptível  O mesmo microrganismo deve ser isolado a partir do animal doente Walther Hesse e 1882 – aplicaram o agar ao meio de cultura que substitui a gelatina que tinha esposa bastantes problemas de condicionamento; trabalharam para Koch Richard Petri Colaborador de Koch; desenvolveu a caixa de petri para meios sólidos Edward Jenne 1796 – pai da vacina Sílvia Amado Laboratório de bacteriologia em Lisboa Em Portugal Laboratório de bacteriologia no Porto (finais do séc.XIX-ínicio do séc.XX) Organização da “Assistência aos tuberculosos”; organizou e dirigiu o “Instituto Ricardo Jorge Central de Higiene” que mais ttarde se passou a chamar “Instituto Nacional de Sáude Doutor Ricardo Jorge” Augusto Gabinete de microbiologia ligado à Faculdade de Medicina da Universidade de Rocha e Coimbra Filomeno da Câmara Adriana Carreira 5  Primeiro grande impulsionador da microbiologia em Portugal Finais do séc.XIX funda um laboratório de bacteriologia no Hospital de Sta Maria que mais tarde passa para o Hospital S. José designando-se por “Real Instituto Bacteriológico de Lisboa” Câmara 1899 – Câmara Pestana e Ricardo Jorge propõem medidas para o combate ao surto Pestana de peste negra (bubónica) na zona portuária do Porto. As medidas não agradaram os locais, mas foram de reconhecimento pelos cientistas estrangeiros. Resultado: consegue-se debelar a peste, mas Câmara Pestana acaba por falecer contaminado nesse ano e Ricardo Jorge muda-se para Lisboa. Ernest Ruska e 1933 – inventores do microscópio eletrónico: divisão dos seres vivos em eucariotas Max Knoll e procariotas; visualização dos vírus Luc Montagnier 1983 – 1984: identificação do HIV (França) e Robert Gallo (EUA) 1986 – produzida e aplicada a primeira vacina por Eng. Genética: vacina para a Hepatite B Conhecido pela “Pílula Mágica”; 1910 – contribui para o tratamento da sífilis Paul Ehrlich (Treponema pallidium) com a descoberta de um derivado de arsénio o qual denominou de “salvarsan” Alexander Médico bacteriologista escocês; 1928 – primeiro antibiótico (penicilina – Penicillium Fleming notatum). Só nos anos 40 é que foi produzida para ser comercializada. A microbiologia é a área de contacto com a: bacteriologia, micologia, parasitologia, Actualidade virologia, imunologia Microscopia É a ciência que estuda os métodos e as aplicações em que se usa o microscópio para a abservação de objetos ou pormenores destes com dimensões inferiores ao limite de resolução do olho humano (0.2mm). Conceitos inerentes à microscopia I. Poder de resolução: é a capacidade que as lentes têm de separar as imagens de dois objetos próximos. É estimado pelo limite de resolução: menor distância entre dois pontos até que apareçam individualizados. 0,5 ×. =.. ( é ) =. sin n – índice de refração Ѳ – semi-ângulo do cone de luz que entra na objetiva II. Ampliação: deve-se à conjugação do poder do sistema de objetivas e do sistema ocular a ser usado. Ex.: objetivas: 40X; oculares: 10X; ampliação:40x10=400X 6 Adriana Carreira Tipos de microscópio Microscópio Características Mais utilizado em laboratório; Visualização de preparações coradas e a fresco; P.R=0.27μm Ampliação das oculares: 10X Ampliação das objetivas: 4X; 10X; 40X; 100X Desvantagem: baixo contraste entre as células e o meio exterior, e entre as estruturas subcelulares/organelos e o citoplasma das células. Campo claro Características: vivas, não coradas Excelentes para observar células ¬ Utiliza um condensador especial com um disco opaco que bloqueia a luz, impedindo-a de entrar na lente da objetiva diretamente; ¬ A luz refletida pela amostra entra nas lentes da objetiva e a Campo escuro amostra aparece brilhante num fundo negro Principais usos: ¬ Examinar microrganismos muito finos. Ex.: treponemas, borrelias e leptospiras ¬ Examinar microrganismos que não se contam facilmente, que ficam distorcidos pela coloração e/ou são invisíveis na microscopia de campo brilhante Desvantagem: pouco detalhe subcelular Fonte de luminosidade: luz UV Coloração: fluorocromos – composto fluorescente ou que apresenta fluorescência Várias aplicações: ¬ FISH (hibridização in situ com fluorescência) ¬ Diagnóstico rápido de microrganismos específicos (ensaios de imunofluorescência) Fluorescência Ex.: Anticorpo que se liga especificamente a um determinado microrganismo é combinado com fluorocromo. (P.ex. Fluoresceína – emite luz verde). O anticorpo combinado é adicionado às células fixadas sobre uma lâmina e vai ligar-se a moléculas específicas (antigéneos) presentes na superfície das células do microrganismo que se pretende detectar; As células às quais o anticorpo se ligou fluorescem (cor verde, no caso do fluorocromo ser a fluoresceína) após serem sujeitas a radiação com comprimento de onda adequado para excitar a molécula do fluorocromo. ¬ Distinção de células viáveis ou mortas Adriana Carreira 7  ¬ Usa luz visível ¬ Poder de resolução máx: 0,20 µm Contraste de fases ¬ Sistema óptico especial (condensador; objectivas) que permite distinguir pequenas diferenças no índice de refracção (p.ex. entre o citoplasma e o exterior; entre os organelos e o citoplasma) ¬ Resultado: melhor contraste ¬ Permite observação de alguns detalhes intracelulares em células vivas (mobilidade, fagocitosee outras atividades celulares) Fonte luminosa: laser Confocal de varrimento a Coloração: normalmente com fluorocromos Microscópio confocal Imagem bi-dimensional ou tri-dimensional final construída por aplicação semelhante ao do (funcionamento microscópio de fluorescência) informática Poder de resolução elevado laser Aplicações: ¬ Análise de camadas de microrganismos em biofilmes; ¬ Análise do conteudo microbiano de amostras espessas, em profundidade (p.ex. em tecidos, solo); ¬ Ecologia microbiana (amostras ambientais) Fonte luminosa: feixe de electrões Uso de magnetes em vez de lentes de vidro nas objectivas, condensadores, etc. P.R.Máx ~ 0,5 nm (⇒ permite resolver estruturas muito pequenas, em comparação com o microscópio óptico)) Transmissão Ampliação máxima útil: ~200 000 x Microscópios eletrónicos Imagem bi-dimensional, formada com base no desvio de electrões pelas estruturas mais densas do objecto e transmissão através das regiões de baixa densidade (regiões densas vs. transparentes) Aplicações: ¬ Observação de vírus; ¬ Observação da ultraestrutura interna de células do tipo procariótico ou eucariótico ¬ Preparação da amostra complexa e morosa Usa electrões reflectidos pela superfície do objecto para formar a imagem; P.R ~ 5 nm Varrimento Imagem tridimensional Observação de características da superficie de células e virus e estrutura de colónias, directamente na superfície de tecidos e diversos tipos de outros materiais. 8 Adriana Carreira Preparação das amostras para microscópio óptico Existem vários tipos de preparações as quais nos permitem visualizar diferentes características do que estamos a visualizar. Em microbiologia vamos trabalhar com: A. Microscópia Óptica: I. Preapações a fresco – permite-nos avaliar microscopicamente a mobilidade de bactérias vivas em solução aquosa i. Técnica entre lâmina e lamela: apesar de simples e fácil de executar, está associada à facilidade de formar correntes de convexão, assim como da exsicação rápida do produto; fig. 1 – 1) Esterilizar a ansa e o fio direito; 2) Limpar e secar uma lâmina de vidro; 3) Flamejar a lâmina; 4) Colocar uma gota de água estéril no centro da lâmina; 5) Destapar o tubo contendo a cultura da levedura em estudo e flamejar o bucal do tubo; 6) Com o fio direito, tocar nas bactérias em cultura, e voltar a flamejar o tubo, antes de o tapar; 7) Suspender as bactérias na gota de água que colocou na lâmina; 8) Esterilizar o fio direito; 9) Colocar uma lamela sobre a suspensão obtida, evitando a formação de bolhas de ar. ii. Técnica da gota pendente: em que a probabilidade de contaminação do operador está diminuída, permite uma observação mais prolongada, e elimina as correntes de convexão. fig. 2 – usa-se uma lâmina de Koch NOTA: Deve ter-se em atenção que por vezes bactérias imóveis, quando em meio aquoso, parecem movimentar-se de forma estranha e errática. Estes movimentos são devidos aos movimentos Brownianos, resultantes dos movimentos aleatórios das moléculas de água contra as bactérias, e não devem, por isso ser confundidos com movimentos próprios das bactérias. Adriana Carreira 9  II. Preparações coradas – todos os tipos de preparações coradas têm uma etapa em comum: preparação do esfregaço: fig. 3 – preparação de um esfregaço – FASE DE EXTENSÃO: 1) retirar a lâmina do álcool; 2) secar com papel; 3) ligar a chama; 4) passar a lâmina pela chama; 5) esterelizar a ansa; 6) enquanto a ansa arrefece, abrir o tubo com a amostra, agitar, passar a abertura pela chama e retirar um pouco de amostra com a ansa e fazer a sua extensão na lâmina; 7) tapar o tubo; 8) esterelizar a ansa pela chama. FASE DE SECAGEM: elevar a lâmina acima da chama o tempo suficiente para que seque. FASE DE FIXAÇÃO: cortar a chama com a lâmina na oblíqua (3X). Depois podemos ter diferentes tipos de coloração: Corantes – substâncias que, em determinadas condições, conseguem conferir uma coloração a outra substância com a qual se encontra em contacto; são sais com um anião e um catião em que um deles é o cromóforo. Tipos de corante Características Exemplos Básicos Cromóforo está no catião; Cristal violeta; fucsina básica; azul de Coram elementos basófilos metileno; verde malaquite; safranina Ácidos Cromóforo está no anião; Eosina; fucsina ácida; nigrosina Coram elementos acidófilos i. Coloração simples Objetivo: observação da morfologia dos microrganismos e agrupamentos no caso de existirem ii. Coloração diferencial Objetivo: dois corantes para diferenciar microrganismos entre si 1. Coloração de Gram Soluções e ordem de Reação e aspeto das bactérias aplicação Gram-positivas Gram-negativas I Cristal de violeta Coradas de violeta Coradas de violeta (corante primário) II Formação do complexo CV-I no interior da Formação do complexo CV-I no Solução de lugol célula, que permanece violeta interior da célula, que permanece (mordente) violeta III Desidratação da parede celular, Extração dos lipídos da parede celular, diminuição da porosidade e da aumento da porosidade; o complexo Álcool-acetona permeabilidade; o complexo CV-I não CV-I é removido da célula (diferenciador) pode sair da célula, que permanece violeta IV Fucsina ou A célula não é afetada, permanecendo A célula adquire o corante, tornando- safranina violeta se vermelha. (corante secundário) 10 Adriana Carreira Principais causas de erro: 1) Má execução do esfregaço (na extensão e fixação); 2) Atuação não correta do diferenciador 3) Idade da cultura 2. Coloração Ácido-Resistente de Ziehl-Neelsen É uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram. Há bactérias que são resistentes à coloração, mas uma vez coradas resistem fortemente à descoloração mesmo com ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. As bactérias que possuem esta propriedade dizem-se álcool-resistentes (géneros Mycobacterium e Nocardia). Esta característica deve-se ao elevado teor em lípidos estruturais na parede celular que provocam uma grande hidrofobicidade e dificultam a ação dos mordentes e diferenciadores dos corantes. Primeiro corante: fucsina básica fenicada; Diferenciador: álcool+ácido; Segundo corante: azul de metileno iii. Colorações estruturais Objetivo: corar e isolar uma parte específica dos microrganismos 1. Coloração de endosporos 2. Coloração negativa de cápsulas 3. Coloração de flagelos B. Microscopia eletrónica A amostra é fixada com OsO4 (tretóxido de ósmio) ou ainda com formaldeído e glutaraldeído; desidratadas com solventes orgânicos; embebida numa resina num suporte de plástico. Cortes ultrafinos com o ultramicrómetro (faca de diamante). Depois são colocados numa grelha e “corados” com soluções de metais pesados (ex.: tungsténio, urânio, chumbo,...) para aumentar o contraste. Ao visualizar:  Áreas transparentes aos eletrões – claras  Áreas que refletem os eletrões – escuras Parede Celularii A parede celular de uma bactéria é uma estrutura semi-rígida responsável pela forma e integridade da bactéria e pelo seu comportamento em relação à coloração de Gram. Função: Proteção e evitar que o interior sofra com as alterações do meio. Adriana Carreira 11 Peptidoglicano ou Mureína É uma molécula única macromolécula única; tem forma de saco, reveste e confere proteção à célula bacteriana. É uma proteína de elevado peso molecular. Tem uma estrutura 3D. Composição: um esqueleto de glicano (polissacarídeo) que consiste em ácido N-acetil murâmico (NAM) e N-acetil glucosamina (NAG) com cadeias laterais de peptídeos contendo aminoácidos D- e L- e às vezes ácido diaminopimélico. As cadeias laterais fazem ligações cruzadas por pontes peptídicas. Essas pontes variam em estrutura entre espécies bacterianas. fig. 4 – Estrutura do peptidoglicano fig. 5 – Ao NAM encontram-se ligados 4 aminoácidos na forma D e L; ligações β 1-4 entre NAM e NAG. fig. 6 – Em Staphylococcus sp. as cadeias peptídicas ligam-se umas às outras no terceiro e quarto aminoácido da cadeia seguinte através de pontes de glicina. Obs.: 12 Adriana Carreira   Na maioria das bactérias de Gram negativo as ligações peptídicas fazem-se diretamente entre o terceiro aminoácido (α-amina) e o quarto aminoácido (α-carboxílico).  Estão reconhecidos mais de 100 tipos diferentes de peptidoglicano em que a sua variante está na ligação peptídica  Para além dos aminoáceidos presentes no tetrapeptídeo podem estar outros nomeadamente a glicina, treonina, serina e ácido aspártico Fases da biossíntese do peptidoglicano 1. Fase citoplasmática – síntese dos percursores: NAM e NAG (I) Durante o crescimento bacteriano não há acumulação citoplasmática destes compostos pois existe um sincronismo entre a sua síntese e a sua transferência para o transportador. 2. Fase membranar – associação dos monómeros de peptidoglicano a um transportador de membrana para atravessarem a membrana citoplasmática(II) 3. Fase parietal – inserção na parede celular (III) Enzimas envolvidas: Transglicolases, Transpeptidades, PBPs (penincillin Binding Proteins) fig. 7 – Síntese do peptidoglicano. FASE CITOPLASMÁTICA: i – A glutamina doa um grupo amina ao açúcar frutose-6- fosfato originando glucosamina-6-fosfato; ii – Um grupo acetilo é transferido de uma molécula de acetil-CoA para um grupo amino da glucosamina-6-fosfato originando N-acetil-glucosamina-6-fosfato; iii – A N-acetil-glucosamina-6- fosfato é isomerizada a N-acetil-glucosamina-1-fosfato; iv – O N-acetil-glucosamina-1-fosfato associa-se a uma molécula de uridina trifosfato (UTP): nesta reação, depois do monofosfato se associar ao UTP, um grupo pirofosfato inorgânico é libertado originando-se UDP-NAG; v – Algum do UDP-NAG é convertido a UDP-NAMA por adição de um grupo lactilo à glucosamina, o qual é previamente reduzido com o gasto de uma molécula de NADPH (vi); vii – O UDP- NAMA é convertido a UDP-NAMA pentapéptido pela adição de 5 aminoácidos (normalmente inclui o dipéptido D- alanil-D-alanina). CADA UM DESTES PASSOS REQUER GASTO DE ATP. FASE MEMBRANAR: o bactoprenol transporta os percursores do peptidoglicano através da membrana celular. O bactoprenol ataca o UDP-NAMA pentapéptido, criando um PP-NAMA pentapéptido. O UDP-NAG é associado ao lípido originando-se PP-NAMA-pentapéptido-NAG, o percursor do peptidoglicano. FASE PARIETAL: o percursor do peptidoglicano é adicionado à cadeia que se está a formar. A reação é conhecida como transglicosilação e corresponde à associação do grupo hidroxilo do NAG ao NAMA o que leva à dissociação do bactoprenol-PP da cadeia de glicano. Adriana Carreira 13 Alguns agentes antimicrobianos que actuam na sínt ese do peptidoglicano  Fase citoplasmática: fosfomicina  Fase membranar: glicopeptídeos (vancomicina)  Fase parietal: β-lactâmicos Parede das bactérias de Gram-Positivo fig. 8 – Parede das bactérias de Gram-Positivo. O peptidoglicano constitui cerca de 50-70% do peso seco da parede celular (20-80nm de espessura; pressão osmótica interna: 20 atmosferas). Parede permeável a macromoléculas com um limite de exclusao que pode variar entre 30 000-57 000 daltons. Constituintes Caracterísitcas Ácido Pequena porção do ácido teicoico associada ao folheto externo da lipoteicoico membrana citoplasmática  Polímero de glicerol ou ribitol, ligados por grupos fosfato; aminoácidos ou açúcares ligam-se ao ribitol ou glicerol; Ácido teicoico  Estão distribuídos por toda a espessura da parede;  Dão cargar negativa à parede;  Conferem especificidade antigénica. Lípidos Não possui Ausentes na maioria das bactérias Gram + Proteínas Quando presentes formam uma camada na porção externa da parede celular Autolisinas Crescimento exponencial (acção fisiológica) 14 Adriana Carreira Parede das bactérias de Gram-Negativo fig. 9 – Parede das bactérias de Gram-Negativo. O peptidoglicano constitui cerca de 5 a 10% do peso seco da parede celular (2-7nm de espessura; pressão osmótica interna: 1-10 atmosferas).  Espaço entre a membrana citoplasmática e a membrana externa;  Espessura variável: 7,5-15nm  Espaço cheio de fluido gelatinoso devido à abundância de proteínas, nomeadamente: Periplasma  Enzimas hidrolíticas – degradação inicial dos nutrientes, degradação de antibióticos  Proteínas de ligação – transporte de substratos  Quimiorreceptores – proteínas envolvidas na quimiotaxia  etc  Distribuição assimétrica  Ancorado na membrana externa pelo lípido A (região hidrofoba) Lipopolissacarídeos  Região polissacarídica projeta-se para o interior da célula (região hidrófila)  Catiões divalentes estabelecem interações entre LPS adjacentes contribuindo para (LPS) a estabilização da membrana externa  Mais estudado: LPS da Salmonella enterica thyphimurium  Comporta-se como um superantigénio provocando uma resposta imune exacerbada contra o hospedeiro  Participa in/diretamente na ativação de macrófagos, linfócitos B e linfócitos T  Composição semelhante à membrana citoplasmática Fosfolípidos  As relações: fosfatidilglicerol/fosfatidiletanolamina e Membrana externa cardiolipina/fosfatidiletanolamina é maior na m. citoplasmática que na m. externa Barreira protetora  Distribuição assimétrica em Enterobacteriaceae  Lipoproteína  Promove a ligação entre a membrana externa e o peptidoglicano  Têm função estrutural  Lipoproteína de Braun – proteína mais abundante  Canais de entrada/saída Porinas Canais cheios de água por onde passam de pequenas moléculas não pequenas moléculas de qualquer Proteínas: hidrofílicas e nutrientes específicas natureza porinas  Distribuídas por toda a Porinas Canais com locais de ligação específicos célula específicas para determinadas moléculas Polissacáridos Adriana Carreira 15 Constituintes da membrana externa  Lipopolissacarídeo (LPS) fig. 10 – Estrutura do LPS  Polissacarídeo O ¬ Diversos resíduos de açúcares ¬ Especificidade antigénica O da espécie bacteriana  Core polissacarídico ¬ Resíduos de açúcarees ¬ L-glicero-D-manoheptose ¬ Cetodesoxictanato – KDO ¬ Específica de grupo  Lípido A ¬ Endotoxina – componente tóxica do LPS ¬ Manifestações clínicas que ocorrem durante uma infeção por bactérias de Gram-negativo: febre, inflamação e choque séptico ¬ Sub-unidades dissacarídicas de D-glucosamina (ligações glicosídicas) interligadas por pontes de pirofosfato ¬ Cada dissacarídeo tem ligado 6 ou 7 ácidos gordos saturados Paredes celulares e o mecanismo de coloração de Gram fig. 11 – Diferença das paredes celulas das bactérias Gram-negativo e Gram- positivo fig. 12 – Coloração diferencial que permite dividir as bactérias em dois grupos: Gram-negativo e Gram-positivo (esta propriedade deve-se à diferença nas paredes: presença/ausência de lípidos, respetivamente) 16 Adriana Carreira fig. 13 – forma física das bactérias. Regra geral, os cocos são bactérias Gram-positivas à excepção do género Neisseria; normalmente os bacilos são Gram-negativos à excepção do género Bacillus Resumo Coloração de Gram Roxo Rosa Géneros representativos Staphylococcus Escherichia Streptococcus Pseudomonas Bacillus Neisseria Peptidoglicano Camada espessa Camada fina Ác. Teicoicos X --- componentes Estrutuas/ Espaço --- X distintos periplasmático M.externa --- X LPS --- X Porinas --- X Parede das bactérias ácido-álcool resistentes Cerca de 60% do peso seco é de ácidos micólicos de cadeia longa e ácidos gordos ramificados Ex.: Géneros Mycobacterium, Nocardia e Corynebacterium fig. 14 – diferenças das paredes Adriana Carreira 17 fig. 15 – Estrutura da parede das bactérias ácido-álcool resistentes. fig. 16 – coloração de Ziehl-Neelsen 18 Adriana Carreira Paredes celulares atípicas  Algumas bactérias não possuem parede celular: 1. Mycoplasma ¬ Género em que se incluem bactérias que não possuem parede ¬ Apresentam diversas formas devido à falta desta ¬ Sobrevivem devido a uma membrana citoplasmática mais resistente que a das restantes bactérias ¬ Possuem esterois na membrana citoplasmática o que a torna mais rígida e estável 2. Archaea ¬ Não possuem/têm paredes invulgares compostas por polissacarídeos e proteínas ¬ Algumas possuem uma substância similar ao peptidoglicano que se denomina de pseudopeptidoglicano Estruturas internas à parede celular fig. 17 – algumas das estruturas internas à parede celular das bactérias Membrana citoplasmática fig. 18 – membrana citoplasmática: modelo do musaico fluido Adriana Carreira 19   Bicamada fosfolipídica  Fosfolípido fig. 19 – estrutura do fosfolípido  Proteínas  Proteínas periféricas  Facilmente removidas  Ficam na superfície externa/interna  Podem funfionar com enzimas  São mediadoras de mundança duranter o movimento  Proteínas integrantes/transmembranares  Penetram completamente na membrana  Podem funcionar como canais  Funções  Barreira seletiva aos materiais – permeabilidade seletiva:  Substâncias hidrofobas atravessam com mais facilidade a MC que as substâncias hidrofílicas  Moléculas menores passam com mais facilidade  Possui enzimas catalisadoras de reações químicas, de quebra de moléculas grandes e produtoras de ATP  Tipos de movimento de materiais através da membrana:  Processo passivo – não há intervenção de energia  Difusão simples Movimento de moléculas ou iões de uma área de elevada concentração para outra de baixa concentração; Exemplo: difusão de O2 e CO2 20 Adriana Carreira   Difusão facilitada A substância a ser transportada combina-se com uma proteína membranar (proteína transportadora/permesa); movimento de substâncias do local de maior para o de menor concentração.  Osmose – exemplo específico de difusão simples para a H2O Movimento de moléculas de solvente de uma área de elevada concentração de solvente (baixa concentração de soluto) para outra de baixa concentração de solvente (elevada concentração de soluto), através de uma membrana permeável. fig. 20 – transporte passivo vs. Transporte ativo  Processo ativo – com gasto de energia na forma de ATP  Transporte ativo Depende de proteínas transportadoras na membrana citoplasmática; Parece existir um transportador para cada substância a ser transportada ou grupos de substâncias; Não há alteração da substância ao ser transportada.  Translocação de grupo Forma especial de transporte ativo; A susbtância transportada é quimicamente alterada durante o transporte; A membrana citoplasmática fica impermeável á substância que entrou, evitando a sua saída mesmo que exista em grande quantidade. Exemplos: Transporte de glucose: a glucose é fosforilada aquando a entrada e nesta forma não pode ser transportada para fora da célula. Adriana Carreira 21 Citoplasma  Tudo o que se encontra dentro da membrana citoplasmática  Aspeto espesso, aquoso, semitransparente e elástico  ~80% H2O  Contém: proteínas (enzimas), hidratos de carbono, lípidos, iões orgânicos, compostos de baixo peso molecular e estruturas de maiores dimensões: área nuclear, ribossomas e inclusões citoplasmáticas Área nuclear  Cromossoma bacteriano  Contínuo fio de DNA de dupla cadeia  Plasmídeos  Pequenas moléculas extracromossomais de dupla cadeia de DNA  Contem entre 5-100 genes  Trazem vantagens para a célula  Multiplicam-se independentemente do cromossoma  Podem ser transferidos de uma célula para outra fig. 21 – estrutura básica da célula bacteriana: todas as bactérias têm a mesma estrutura básica Ribossomas  Ligados à síntese proteica  Uma célula em crescimento possui muitos ribossomas  Ribossomas procariotas iii70S: 30S+50S fig. 22 – estrutura dos ribossomas 22 Adriana Carreira Inclusões  Vários depósitos de reserva – acumulação de nutrientes em excesso para mais tarde utilizá-los quando há insuficiência. Concentração de macromoléculas que evita o aumento da pressão osmótica que resultaria no caso de se encontrarem dispersas  Base de identificação – inclusões gerais e específicas de bactérias  Exemplos:  Grânulos de polissacarídios  Geralmente são de glicogénio e amido  Na presença de iodo, os grânulos de:  Amido coram de azul  Glicogénio coram de vermelho  Grânulos de enxofre  Fonte de energia de reserva para bactérias que obtêm energia a partir da oxidação de enxofre  Exemplo: género Thiobacillus  Inclusões lipídicas  Armazenamento de um lípido; um dos mais comuns é o ácido poli-β- hidroxibutírico  Detetadas pela coloração com corantes gordos como o corante de Sudan  Exemplo: espécies de Mycobacterium, Bacillus, Azobacter e Spirillum  Grânulos metacromáticos  Podem corar de vermelho com corantes azuis como o azul de metileno  Volutinas  Reserva de fosfatos inorgânicos que podem ser utilizados na síntese de ATP  Bactérias que vivem em ambientes ricos em fosfato.  Exemplo: Corynebacterium diphteriae  Vacúolos de gás  Cavidades ocas encontradas em muitos procariotas aquáticos (cianobactérias, bactérias fotossintéticas e halobactérias)  Vesículas de gás – cilindros ocos cobertos por uma proteína  Função: manter as células a fluturar para que recebam oxigénio, luz e nutrientes  Magnetossomas  Inclusões de óxidos de ferro – atuam como magnete  Função: ajudam na locomoção/permanência das bactérias para/em certos locais  Algumas bactérias de Gram negativo possuem estas inclusões Adriana Carreira 23 Endosporos Algumas espécies de bactérias de Gram positivo formam células especializadas que se denominam endosporos. Excepção conhecida: Coxiella burnetii – bactéria de Gram negativo Características:  São estruturas únicas na natureza e formam-se em condições adversas para as células  Muito resistentes ao calor, secagem, radiação, ácidos, desinfetantes químicos  Podem perdurar anos em condições adversas Exemplo: esporos de Thermoactinomyces vulgaris, com cerca de 7500anos, foram encontrados no Minnesota nas lamas do Elk  Estrutura de múltiplas camadas desidratadas que protege e permite que a bactéria exista num estado de dormência  Cada esporo contém:  Uma cópia completa do cromossoma  Concentrações mínimas essenciais de proteínas e ribossomas  Elevadas concentrações de Ca2+ e ácido dipocolínico  Cada esporo é constitiuído por:  Protoplasto ou core  Parede do core  Cortex  Parede do esporo fig. 23 – estrutura do endosporo  Pode ter diversas denominações consoantes a sua posição dentro da célula-mãe fig. 24 – (1,4) – endosporo central; (2,3,5) – endosporo terminal; 6 – endosporo lateral 24 Adriana Carreira   Alguns exemplos de espécies de interesse clínico formadoras de endosporos:  Clostridium tetani – tétano  Clostridium perfringens – enterite  Clostridium botulinum – poduz a toxina do botulismo (usada no BOTOX)  Bacillus anthracis – carbúnculo/antraz  Bacillus subtilis – saprófita comum no solo e na água Esporolação ou esporogénese fig. 25 – processo de formação de um esporo dentro da célula vegetativa. Cerca de 10horas podem ser suficientes para a esporogénese, no entanto, depende da espécie e das condições ambientais. Crescimento bacteriano na natureza O ambiente microbiano é complexo e em constante mudança. Os microrganismos crescem num “microambiente” até que um facto ambiental ou nutricional limite esse crescimento.  Fatores necessários para o crescimento microbiano.  Físicos: temperatura, PH e pressão osmótica.  Químicos: água, fontes de carbono, nitrogênio, minerais, oxigênio e fatores orgânicos de crescimento. Adriana Carreira 25 Biofilme: organização para a sobrevivência Dispersas em meio líquido chama-se os microorganismos de bactérias planctónicas. Segundo passo é a adesão dessas bactérias planctónicas numa superfície, que aí passam a ser chamadas de bactérias sésseis. A diferença entre bactérias planctónicas e bactérias sésseis, é que na segunda forma elas possuem melhores condições/possibilidades de desenvolvimento e sobevivência. Composição Os bioflimes podem ser formados por mais de uma espécie de microrganismos em função da sua localização. Factores de desenvolvimento de biofilmes Biofimes = líquido + superfície + microorganismos Formação Primeira etapa: adesão reversível. É a adesão inicial dos microorganismos à superfície; depende dos seguintes pontos:  Tipo de Superfície  Tipos de microrganismos  Ambiente A adesão primária pode se dar ao acaso ou ser induzida por quimiotaxia (característica físico- quimica da superfície). A composição do material determina ou permite interações eletrostáticas ou hidrofóficas que favorecem a proliferação de biofilmes. Segunda etapa: adesão irreversível ou ancoragem, a matriz de polissacarídeo gerado pelas células microbianas agregam os elementos ancorados no biofilme. A adesão secundária produz uma firme camada de elementos sólidos, onde se encontam embebidos na matriz de polissacarideos os elementos bacterianos e os do hospedeiro. Alguns estudiosos afirmam que o biofilme é irreversível quando a coesão entre os elementos e adesão à superfície é concluida. Factores que influenciam a velocidade de formação do biofilme: 1. Número de células. 2. Tipos de células presentes no líquido. 3. Tipo de superfície (físico-químico) 4. Taxa de fluxo do liquido atravéz da superfície. 5. Composição nutricional do liquido. 6. Temperatura do ambiente. 26 Adriana Carreira fig. 26 – formação de um biofilme: 1 – adesão reversível; 2 – adesão irreversível; 3 – formação de microcolónias e maturação; 4 – biofilme maduro; 5 – desadesão. fig. 27 – Quorum sensing: mecanismo de comunicação entre bactérias, através da produção e difusão de pequenas moléculas químicas ou sinalizadoras, através de membranas bacterianas. Este sistema de linguagem permite a coordenação do comportamento bacteriano em relação ao meio ambiente regulando a expressão de genes especializados, em resposta à densidade populacional, além da intervenção em diversos processos fisiológicos como a diferenciação celular e fluxo de nutrientes, a bioluminescência, indução de fatores de virulência em patógenos de plantas e animais, biossíntese de antibióticos e a formação de biofilmes.  Cerca de 65% das infeções bacterianas acontecem em biofilme: as células em biofilme estão protegidas da ação dos antimicrobianos e das defesas do hospedeiro Alguns exemplos de microrganismos que produzem biofilmes:  Candida albicans  Staphylococcus coagulase negativa  Enterococcus spp  Klebsiela penumoniae  Pseudomonas aeruginosa  Staphylococcus aureus Biorremediação Processo em que se utilizam microrganismos para limpar o meio ambiente e na maioria dos casos promovendo a formação de biofilmes. Adriana Carreira 27 Os microrganismos removem ou degradam lixos perigosos devidos a acidentes ecológicos, por exemplo, derramamento de óleos nocivos, crudes e outros compostos contendo hidrocarbonetos, alcatrão, etc. Objetivo final: preservação do ambiente e das espécies fig. 28 – exemplo de biorremediação  Comunidades microbianas mistas: no ambiente, os microrganismos vivem em associação; os desperdícios metabólicos de umas espécies servem de nutrientes para outras. Em laboratório é difícil criar todo este ambiente! Crescimento bacteriano em laboratório Meios de cultura São o material nutritivo para o crescimento dos microrganismos em laboratório. Podem ser classificados quanto: À consistência:  Meios líquidos – caldos  Meios sólidos  Em caixa 28 Adriana Carreira   Em tubo:  Direito  Inclinado  Semi-inclinado ¬ Usa-se agar para a solidifação dos meios. Agar  Polissacarídeo complexo derivado das algas marinhas  Liquefaz a 100°C  Solidifica a temperaturas inferiores a 40°C À função:  Meios quimicamente definidos ¬ Conhece-se exatamente a sua composição ¬ Servem para suprir as necessidades nutricionais dos microrganismos quando estas são conhecidas  Meios complexos e enriquecidos ¬ Meios que cumprem as exigências vitais de determinado microrganismo ¬ Têm uma composição química indefinida uma vez que integram:  Peptona – proteínas que foram hidrolizadas  Extratos – vegetais, de carne ou leveduras; são componentes solúveis na água (vitaminas, sais minerais e outros nutrientes)  Exemplos: 1. Gelose de sangue 2. Gelose de chocolate – contém glóbulos vermelhos lisados 3. Gelose nutritiva  Meios de cultura especiais ¬ Meios seletivos ou de isolamento  Meios que promovem o crescimento dos microrganismos que interessam e suprimem o crescimento dos outros que não interessam  Exemplos: 1. Gelose MacConkey ¬ Meio de isolamente para enterobactérias (bactérias presentes no intestino) ¬ Características:  Cristal de violeta – inibe o crescimento de bactérias de Gram positivo  Sais biliares – inibidor da maioria das bactérias não intestinais 2. Gelose de Chapman ¬ Meio de isolamento para estafilococos Adriana Carreira 29  ¬ Características:  7,5% de NaCl – inibe o crescimento de outras bactérias 3. Gelose de Thayer-Martin ¬ Meio de isolamento para Neisseria gonorrhoeae ¬ Características:  Antibióticos – inibem fungos, bactérias de Gram positivo e negativo 4. Gelose Sabourad ¬ Meio de isolamento para fungos ¬ Características:  pH 5,6 – inibe o crescimento da maioria das bactérias  A maioria destes meios também é diferencial: Meios diferenciais – contêm substâncias que as bactérias modificam de um modo reconhecível  Exemplos: 1. Gelose MacConkey ¬ Substrato: Lactose ¬ Modo de leitura: indicador de pH – vermelho neutro 2. Gelose Chapman ¬ Substrato: manitol ¬ Modo de leitura: indicador de pH – vermelho de fenol 3. Gelose sangue ¬ A presença de sangue permite a determinação da hemólise (destruição das hemácias), que é um critério básico para a orientação da identificação de bactérias; observação de hemolisinas ¬ Tipos de hemólise:  Hemólise α – hemólise incompleta; aparece um halo esverdeado à volta da colónia Exemplo: Streptococcus pneumoniae – agente etiológico de pneumonias e meningites  Hemólise β – hemólise total; surge um halo claro ao redor da colónia 30 Adriana Carreira  Exemplo: Streptococcus pyogenes – agente etiológico da faringite estreptocócica, escarlatina e febre reumática  Hemólise γ – sem hemólise; meio inalterado Exemplo: Enterococcus faecalis – habitante normal das fezes ¬ Meios eletivos/ caldos de enriquecimento  Meios que pela sua composição favorecem o crescimento de uma espécie em detrimento de outras num determinado tempo  Exemplos:  Caldo selenito  Caldo GN Salmonella sp e Shigela sp  Caldo tetrationato  Água peptonada alcalina – Vibrio cholerae Cuidados a ter:  Todos os meios, instrumentos, vidros e plásticos devem estar estéreis aquando a sua utilização;  É necessário trabalhar sempre em condições de assepsia que devem ser escolhidas consoante o grau de perigosidade do microrganismo esperado  Na obtenção de culturas puras, ter em consideração:  Reação tinturial  Produto em que se encontra:  Muito contaminado e poucos microrganismos que interessam  Muito contaminado e com bastantes microrganismos que interessam  Pouco contaminado  Características dos microrganismos a isolar  Uso da Técnica de Esgotamento do Produto por Extensão à Superfície do Meio Sólido – aplicada em gelose e consiste em isolar a estirpe desejada por arrastamento sucessivo do inóculo com a alça de platina, fazendo várias estrias na superfície do meio de cultura  Objetivo: obtenção de colónias isoladas – uma colónia isolada tem 99% de hipóteses de ser uma colóniaiv pura Cultura pura Definição: população de microrganismos descendentes de uma única célula. Utilizada para identificação e no estudo das funções dos microrganismos. Adriana Carreira 31   Preservação das culturas puras dos microrganismos:  Curtos períodos de tempo  Refrigeração  Longos períodos de tempo  Congelamento  Liofilização – técnica de secagem fig. 29 – técnica de esgotamento do produto por extensão à superfície do meio sólido – obtenção de colónias puras. Crescimento bacteriano Refere-se ao aumento do número de células bacterianas e NÃO a um aumento do tamanho da célula individualizada (NOTE-SE que para que haja esse crescimento em número de células, numa primeira fase, há crescimento do tamanho da célula individualizada) fig. 30 – a maioria das bactérias divide-se por divisão binária; muito poucas dividem-se por gemulação. 32 Adriana Carreira Curva de crescimento Quando as bactérias são inoculadas em meio líquido (sistema fechado) e a população é contada em intervalos de tempo, podemos contruir um gráfico qe mostra o comportamento dessa população no tempo. A C B D fig. 31 – A – fase de latência (I – fase de adaptação do microrganismo no novo ambiente: crescimento nulo; II – fase de aceleração: crescimento positivo); B – fase exponencial (III - crescimento exponencial: taxa constante e máxima; IV – fase de desaceleração: diminuição da taxa); C – fase estacionária (V – a população não aumenta: taxa nula); D – fase de declínio ou morte (VI – diminuição das células viáveis). Adriana Carreira 33 Fases de Crescimento: A. Fase lag ou fase de latência  Fase de adaptação Quando se colocam as células num meio novo elas têm de se adaptar e por esse motivo não começam logo a dividir-se. No entanto as células não estão adormecidas. É um período de actividade metabólica intensa envolvendo a síntese de várias moléculas. Pode durar zero horas até vários dias dependendo das espécies e das condições ambientais.  Fase de aceleração A seguir à fase de latência, há uma fase de aceleração associado a um aumento de μ até este atingir o valor constante na fase seguinte. B. Fase exponencial  Fase exponencial Os microrganismos estão a crescer e a dividir-se à velocidade máxima possível, dependendo do seu potencial genético, da natureza do meio de cultura e das condições ambientais em que estão a crescer. A taxa de crescimento é constante, isto é, os microrganismos estão a dividir-se e duplicando em número, em intervalos regulares. O crescimento exponencial é um crescimento equilibrado. A população é uniforme em termos fisiológicos e químicos, e por esse motivo os estudos bioquímicos e fisiológicos são feitos nesta fase. Em geral, a maioria das bactérias é mais susceptível aos agentes antimicrobianos nesta fase.  Fase de desaceleração Fase associada a uma diminuição de μ até este atingir um valor nulo e entrar em fase estacionária. C. Fase estacionária  Fase estacionária O crescimento populacional cessa e a curva de crescimento torna-se horizontal. O número de mortes balança com o número de novas células e a população estabiliza. As atividades metabólicas das células individuais sobreviventes também diminuem. O esgotar de nutrientes, a acumulação de produtos tóxicos, as mudanças de pH podem ter um papel preponderante neste cessar de crescimento. Em geral, as células tornam-se mais resistentes às condições adversas no intuito de poderem sobreviver mais tempo. D. Fase de morte  Fase de declínio ou morte O número de mortes excede o número de novas células. Esta fase está associada a uma diminuição exponencial da densidade populacional, quer dizer que uma proporção constante de células morre em cada hora. Morte é definida como a perda irreversível da capacidade de divisão celular. 34 Adriana Carreira Matemática do crescimento A taxa específica de crescimento (μ) e o tempo de geração ou duplicação (g) durante a fase exponencial são indespensáveis para o microbiólogo. Estes valores são influenciados por:  Microrganismos presentes  Condições ambientais  Composição do meio de cultura Tempo de geração ou tempo de duplicação (g) Os microrganismos dividem-se por divisão binária. Durante a fase exponencial, cada microrganismo divide-se em intervalos constantes. n fig. 32 – a população duplica em cada geração; o aumento da população é sempre 2 em que n é o número de gerações. O aumento populacional é exponencial. Isto pode ser traduzido numa equação: = ×2 = = = ú çõ Para retirar o valor de n, temos de transformar a equação em: ln = ln + × ln 2 e = ⇔ = , Adriana Carreira 35  = − çã − ú çõ Taxa específica de crescimento ( μ) Em crescimento exponencial, o aumento do número de células num determinado tempo é proporcional à população microbiana presente nesse tempo. Esta constante de proporcionalidade é μ – representa um índice de velocidade de crescimento. fig. 33 – exemplo da taxa específica de crescimento de bactérias em meio líquido. (a) – função exponencial representada pela fórmula: = × ( − ; − ). Logaritmizando a expressão anterior obtemos: = , que corresponde ao declive da recta representado na situação (b). Relação: taxa específica de crescimento (μ) e tempo de geração ou duplicação (g) = e =2 , = ( ) = ⇔ = ⇔ =  Quanto maior o μ, mais rapidamente se devide a população, maior é o número de gerações que ocorrem no mesmo período de tempo e menor é o g. 36 Adriana Carreira   O cálculo dos valores de μ e g de um dado organismo, em condições de cultura diferentes é útil para:  Selecionar as condições de cultura óptimas para o crescimento do microrganismo  Estudar o efeito que uma dada alteração das condições ambientais exerce sobre o crescimento desse microrganismo. Medição do crescimento microbiano Para a quantificação do crescimento de microrganismos unicelulares usam-se metodologias para a determinação:  Variações no número de células  Variação da massa Determinação do número de células  Métodos diretos: contagem de células totais ao microscópio ou em contadores eletrónicos Contagem ao microscópio fig. 34 – exemplo de câmaras de contagem: Neubauer, Petroff-Hausser...  Vantagens e desvantagens: ¬ Uso de câmaras de contagem de células ¬ Método barato ¬ Não se distingue células vivas de células mortas ¬ Pequenas células podem ser observadas ¬ Células móveis têm de ser imobilizadas antes da observação ¬ Baixa precisão ¬ Não se usam suspensões de células de baixa densidade ¬ Amostras não coraas devem ser contadas em microscópio de contraste de fases Contagem eletrónica Serve para contabilizar protozoários, algas e leveduras não filamentosas Adriana Carreira 37   Vantagens e desvantagens: ¬ Uso de contadores eletrónicos ¬ Avaliação do tamanho e número de células ¬ Não distingue entre células viáveis e mortas ¬ Não é útil para contar bactérias ¬ Causas de erro: partículas de pó,...  Métodos indirectos: determinação do número de células viáveis: contagem em placa (contagem de colónias) Contagem de células viáveis Célula viável – célula capaz de se dividir e originar duas células-filhas e formarem colónias quando transferidas para outro meio Fundamento: determinar o número de células na amostra capaz de formar colónias num meio gelosado adequado  A contagem é expressa em UFC - unidades formadoras de colónias Obs.: ¬ Na maioria dos casos as amostras têm que ser diluídas de forma a obter 30-300 colónias por placa ¬ Placas em duplicado ¬ Sensível e moroso ¬ Aplicado em micobriologia alimentar, águas e ambiente ¬ Fazendo uso de meios seletivos e condições de crescimento bem definidas pode-se contar um tipo particular de célula numa mistura de microrganismos fig. 35 – métodos de contagem do número de células viáveis: A – método por espalhamento; B – método por incorporação 38 Adriana Carreira fig. 36 – membranas filtrantes – após filtração colocar a membrana filtrante sobre o meio sólido (PCA); incubar; proceder à contagem de colónias Determinação da massa celular  Métodos diretos: determinação do peso seco Determinação do peso seco Utilização: culturas filamentosas ou que formem agregados Desvantagens: necessidade de grandes volumes de cultura; muito moroso Metodologia: centrifugar, lavar, secar muito bem em estufa e pesar as células. Alternativa: pesar o filtro até peso constante; filtrar a cultura, secar e pesar  Métodos indiretos: determinação de parâmetros que se relacionam com a concentração celular Turbidimetria  Método de determinação da massa celular Método simples, rápido que recorre à determinação da densidade óptica – absorvância (quantidade de luz não dispersa por uma suspensão de células quando expostas a um feixe de luz)  Quanto maior a concentração de células na suspensão, maior a densidade óptica/ quanto mais turva for uma suspensão, mais luz é espalhada Comprimentos de onda utilizados: 540 nm (verde); 600 nm (laranja); 660 nm (vermelho). Adriana Carreira 39 Unidades: 1. Neflómetro: klett  Desvantagens: i. Número de células pequeno ii. Não tem sensibilidade 2. Espectrofotómetro: absorvância ou densidade óptica (D.O)  Desvantagens: i. Não há linearidade entre a massa e a D.O ii. Número de células elevado Turbimetria Vantagens Desvantagens Apropriado para microrganismos unicelulares Não distingue células viáveis de células mortas Mais utilizado Menos sensível que a contagem de células viáveis Fácil execução Não servem para suspensões pouco turvas Rápido (≈10 milhões de células por ml (107 células/ml) Não destrói a amostra são necessários para utilizar este método) fig. 37 – turbidimetria:a turvação é proporcional à massa celular presente na amostra NMP – número mais provável Fundamento: O método do NMP permite calcular o número de um microorganismo específico numa amostra de água, utilizando tabelas de probabilidade 40 Adriana Carreira Objetivo: diluir sucessivamente a amostra num meio líquido seletivo e determinar o ponto em que diluições subsequentes não terão células Leitura: observar em que tubos existe crescimento; comparar os resultados com tabelas fornecidas para este tipo de metodologia Vantagens: muito utilizado na determinação do número aproximado de coliformes em amostras de água fig. 38 – método do NMP (número mais provável) Factores ambientais que afetam o crescimento bacteriano O crescimento dos microrganismos é amplamente afetado pela natureza física e química do seu ambiente ou habitat. O conhecimento das influências ambientais ajuda no controlo do crescimento microbiano e no estudo da distribuição ecológica dos microrganismos. Fatores: ¬ Temperatura Um dos fatores mais importantes que afeta o crescimento dos microrganismos pois, em geral, a temperatura destes varia com a temperatura do seu habitat. Esta pode ter um efeito positivo ou negativo no crescimento. O crescimento bacteriano pode ocorrer numa gama de temperaturas entre -15°C - 120°C. Os microrganismos unicelulares são particularmente sensíveis a este factor. Adriana Carreira 41 Temperaturas cardiais Nome dado a três temperaturas que são geralmente características de cada tipo de microrganismo mas não são valores rigorosamente fixos uma vez que podem ser modificados por outros factores ambientais. Refletem ao intervalo de temperatura e a temperatura média do habitat de um dado microrganismo.  Temperatura mímina Temperatura abaixo do qual a espécie não cresce  Temperatura óptima Temperatura em que a espécie cresce melhor  Temperatura máxima Temperatura mais alta a que a espécie consegue crescer fig. 39 – temperaturas cardiais Segundo a temperatura óptima de crescimento, os micorganismos podem classificar-se em 4 grupos:  Psicrófilos – com uma Tóp baixa (extremófilo) Tóp entre -5°C e 15°C Encontram-se em ambientes gélios (ex.: Ártico, Antártida,...) Exemplos: ¬ Alga Chlamydomonas nivallis ¬ Géneros: ¬ Pseudomomas ¬ Vibrio ¬ Alcaligenes ¬...  Psicrotróficos/Psicrófilos facultativos 42 Adriana Carreira  Tóp 20°C - 30°C Fonte importante na deterioração dos alimentos Exemplo: ¬ Pseudomonas fluorescencs ¬ Bacillus psychrophilus  Mesófilos – com uma Tóp média Tóp entre os 25°C e os 45°C Bactérias patogénicas Exemplo: ¬ Escherichia coli ¬ Staphylococcus aureus ¬ Pseudomonas aeruginosa ¬ Bacillus subtilis ¬ Rhododpirillum rubrum ¬...  Termófilos – com uma Tóp elevada Tóp entre os 45°C e os 70°C Habitam nas fontes de águas termais e pilhas de compostagem Exemplo: ¬ Bacillus stearothermophilus ¬ Thermus aquaticus  Hipertermófilos – com uma Tóp muito elevada (extremófilo) Tóp superior a 70°C Habitam em fumarolas e nos fundos oceânicos Em geral, membros das Archaea Exemplo: ¬ Pyrococcus abyssi ¬ Pyrodictium occultum fig. 40 – taxa de crescimento em função da temperatura; temperaturas óptimas. ¬ pH Adriana Carreira 43 A maioria dos ambientes naturais variam entre pH 5-9. Os microrganismos podem crescer numa variação de 2 a 3 unidades de pH contudo, este fator afeta marcadamente o crescimento microbiano. Cada espécie tem um intervalo de pH assim como um valor de pH óptimo à qual a taxa específica decrescimento é maxima. fig. 41 – escala de pH Segundo o pH óptimo de crescimento, os micorganismos podem classificar-se em 3 grupos: I. Acidófilos pHóp entre 0 e 5,5 A maioria dos fungos preferem meios ácidos (pH 4~6) Exemplos: a) Thiobacillus sp b) Alguns géneros pertencentes às Archaea II. Neutrófilos pHóp 5,5~8,0 Maioria das bactérias e dos protozoários III. Alcalófilos pHóp 8,5~11,5  Alcalófilos extremos pHóp >10 Exemplos: a) Bacillus alcalophilus Os microrganismos alteram frequentemente o pH dos seus habitats através da produção de ácidos ou bases resultantes do seu metabolismo. De forma a prevenir a inibiação do crescimento, por alterações acentuadas no pH, recorre-se à inclusão de tampões nos meios de cultura. Um dos tampões mais frequentemente usado é o de fosfato (KH2PO4). 44 Adriana Carreira  ¬ Disponibilidade de água A disponibilidade de água é um factor que afeta o crescimento uma vez que a maior parte dos microrganismos se desenvolve em meios líquidos e que a água é um dos principais constituintes celulares. A disponibilidade de água é expressa pelo valor da actividade de água (aw). P a = , 0