Protein Identifizierung und Quantifizierung PDF

Protein Identifizierung und Quantifizierung  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie  Protein Identifizierung 1950er  Komplette Sequenzierung auf Proteinebene  Insulin (Sanger) 1970er  Teilsequenzen auf Proteinebene  Design von Oligonukleotiden als ”...

Protein Identifizierung und Quantifizierung  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie  Protein Identifizierung 1950er  Komplette Sequenzierung auf Proteinebene  Insulin (Sanger) 1970er  Teilsequenzen auf Proteinebene  Design von Oligonukleotiden als ”Probes”  Screen von cDNA Bibliotheken  Komplette Sequenzierung auf DNA Ebene 1980er  Teilsequenzen auf Proteinebene  Design von Oligonukleotiden als “Primer”  PCR von cDNA  Komplette Sequenzierung auf DNA Ebene 1990er  Teilsequenzen auf Proteinebene  Datenbank Suche  Analyse der Protein Primärstruktur Aminosäure Sequenz und Post-translationale Modifikationen Bestimmen Protein Funktion  Primärstruktur Aminosäuresequenz + Post-translationale Modifikationen Bramwell D, Laval S, McLeod J. Drug Discovery World Winter 2019/20  Proteom Komplette Liste aller PROTEine, die vom GenOM exprimiert und anschliessend post-translational modifiziert werden Gesamtheit aller Proteine zu einem Zeitpunkt in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle  Proteom Biologie Identifizierung Post-Translationale Modifikationen Zelluläre Lokalisierung Protein-Protein Interaktionen Quantifizierung Aktivität und Funktion Dynamik Statisches Genom Dynamisches Proteom  Protein Turnover Gleichgewicht Aminosäuren Transkriptom Metabolom Synthese Abbau Protein Pool Expansion Aminosäuren Aminosäuren erhöhte unveränderte verminderter unveränderter Synthese Synthese Abbau Abbau Protein Protein Pool Kontraktion Aminosäuren Aminosäuren unveränderte erhöhter verminderte unveränderter Synthese Abbau Synthese Abbau Protein Protein  Warum Proteomik? Proteine definieren Funktion von Zellen, Geweben, Organismen  Genom => what could happen  Transkriptom => what might be happening  Proteom => what is happening  Warum Proteomik? Komplexität: nicht abhängig von der Anzahl der Gene Saccharomyces cerevisiae 6,294 Arabidopsis thaliana 25,498 Caenorhabditis elegans 19,099 Drosophila melanogaster 13,061 Homo sapiens < 21,000 Ein Gen => Mehrere “Proteoformen” Bludau I, Aebersold R. Nature Rev Mol Cell Biol 21:327–340 (2020) Humangenom: Transkriptom: ~ 100.000 RNA Proteom => >1.000.000 Proteine  Warum Proteomik? Korrelation zwischen mRNA und Protein Abundanz Nusinow et al., 2020, Cell 180, 387–402  Genomik vs. Proteomik  alle möglichen “features” bekannt feature = RNA  alle möglichen “features” messbar  PCR Amplifizierung möglich  kein Signal => nicht präsent  Analyse von grosser Probenzahl möglich feature = Protein  nicht alle möglichen “features” bekannt  nicht alle möglichen “features” messbar  keine Amplifizierung möglich  kein Signal => nicht präsent/nicht detektiert  meist Analyse von kleiner Probenzahl  Protein Identifizierung Proben Vorbereitung  Spaltung der Disulfidbrücken  Spaltung des Proteins in Peptidfragmente (enzymatisch oder chemisch)  Sequenzierung kurzer Sequenzabschnitte  Datenbankanalyse. Protein Disulfidbrücken Intrachenar und Interchenar  Proben Vorbereitung Spaltung der Disulfidbrücken Oxidation Reduktion Cystin Cystein  Proben Vorbereitung Alkylierung der Cystein Thiolgruppe  Protein Disulfidbrücken Diagonal SDS Gelelektrophorese nicht reduzierender Puffer - + - reduzierender Puffer (DTT) +  Protein Identifizierung Bottom-Up vs. Top-Down Proteomik Analyse von “Surrogat Peptiden” vs. “Intakte Proteine” Protein Fragmente = Peptide Intaktes Protein  Proben Vorbereitung Enzymatische Spaltung des Proteins in Peptidfragmente C-terminale Spaltung nach Lysin und Arginin mit Trypsin  Enzymatische Spaltung des Proteins in Peptidfragmente Trypsin  Hohe Spezifität – spaltet Lys und Arg Reste C-terminal  Sehr robust (aktiv in Harnstoff Lösungen, etc.)  Ausnahme: Pro Rest folgt Lys oder Arg => keine Spaltung  C-terminaler Lys/Arg Rest hat basischen Charakter => gut für Fragmentierung im Massenspektrometer  Mehrzahl der Peptidfragmente haben 7-20 Aminosäuren  Protein Identifizierung  Sanger Methode  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie  Protein Identifizierung Sanger Methode zur Bestimmung der Aminosäuresequenz  Derivatisierung der N-terminalen Aminosäure mit 2,4-Dinitro-1-fluorbenzol  Generierung von Peptidfragmenten mittels total und partieller Hydrolyse Frederick Sanger – Wikipedia  Protein Identifikation  Sanger Methode  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie  Edman Abbau … Phenylthiohydantoin-derivatisierte Aminosäure 1 Phenylthiohydantoin-derivatisierte Aminosäure Standards Sequenzierung mit Hilfe des Edman Abbaus Unvollständige Abspatung der N-terminalen Aminosäure  Protein Identifikation  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie Massenspektrometrie Bestimmung der Molekülmasse freier gasförmiger Ionen im Hochvakuum  Massen Spektrometrie Trennung nach Masse / Ladung (m / z) Probe + _ Ionenquelle Massenanalysator Detektor Erzeugung gasförmiger Ionen Autrennung nach Masse (m) und Ladung (z) Erzeugung von Sekundärelektronenstrom Überführung in geladenen Zustand im magnetischen/elektrischen Feld mit Photomultiplier Massenspektrometrie Bestimmung der Molekülmasse freier gasförmiger Ionen im Hochvakuum Wie können Protein und Peptid Moleküle in die Gasphase überführt werden? => Schonende Ionisierung! Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)  Matrixsubstanz absorbiert Laserenergie  Teilweise Übertragung von Energie auf Proteine führt zur Desorption  Matrixsubstanz wirkt als Brönstedtsäure, was zur Protonierung der Proteine führt  Electrospray Ionization (ESI) Dispersion von Flüssigkeit in viele kleine geladene Tröpfchen mit Hilfe eines elektrostatischen Feldes  Time Of Flight (TOF) Massen Analysator  Beschleunigung der Ionen durch elektrostatisches Feld  Ionen mit unterschiedlichen m/z haben gleiche Ekin => unterschiedliche v  Messung der Zeit (μs) von Start bis Eintreffen am Detektor Time Of Flight (TOF) Massen Analysator m 2Vt2 = z L2 m = Ionenmasse z = Ionenladung V = Spannung L = Flugrohrlänge t = Flugzeit  Quadrupole Massen Analysator  Massenfilter, der aus 4 Metallelektroden besteht  Kombination von Wechsel- und Gleichspannung  Ionen wandern auf oszillierender Bahn und können passieren  Scannen über den gesamten Massenbereich durch Erhöhung der Gleichspannung und Amplitude des Wechselfeldes m2 m1 m4 m3 m2 m1 m4 m3 Scanning  Peptid Massen Spektren sind Komplex!!! Unterschiedliche Ladung der Peptidionen Komplexe Peptid Massenspektren Trennung nach Masse / Ladung (m/z) ADFKTNMRPLYK 1700 H2N-ADFKTNMRPLYK + H+ + H3N-ADFKTNMRPLYK 1700 + 1 / 1 = 1701 Peptid Ladungszustand + 1700 + 2 / 2 = 851 H3N-ADFKTNMRPLYK H3N +  Peptid Ladungszustand 1700 + 3 / 3 = 567.66 H3N-ADFKTNMRPLYK + H3N H3N + +  Multiple Ladungszustände Berechnung von Protein Ladung und Masse z[i] = Ladung Peak i p[i] = m/z Wert Peak i p[i+1] = m/z Wert Peak i+1 M = Masse p[i+1] 1 z[i] = p[i+1]-p[i] 2 M = p[i] x z[i] - z[i]