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Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa 2010-2011 Biologia Celular Baseado nas aulas teóricas, na sebenta já existente (principalmente), no The Cell, Biologia Celular e Molecular, Molecular Cell Biology...

Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa 2010-2011 Biologia Celular Baseado nas aulas teóricas, na sebenta já existente (principalmente), no The Cell, Biologia Celular e Molecular, Molecular Cell Biology Pedro Jogo 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA Aula 1 1) Fundamentos da Biologia Celular a) Panorâmica Geral das células i) Dos procariotas aos eucariotas  Primeira célula surge há 3,8 biliões de anos, aproximadamente 750 milhões de anos após a formação da Terra;  Surgiu RNA com capacidade de auto-replicação, evoluindo posteriormente as relações entre os aminoácidos e o RNA, sendo o RNA “substituído” pelo DNA;  Contudo, a primeira célula propriamente dita deverá ter consistido em RNA isolado do meio exterior por uma membrana fosfolípidica;  Existiram evoluções e mudanças externas à célula e levou à formação dos procariotas e, posteriormente, dos eucariotas;  Os eucariotas deverão ter surgido por uma endossimbiose entre células e bactérias. Factos que apoiam: mitocôndrias e cloroplastos têm DNA próprio, têm um tamanho semelhante a bactérias, apresentam divisão por cissiparidade sintonizada com a replicação do DNA mitótico Característica Procariotas Eucariotas Núcleo Ausente Presente Diâmetro ≈ 1 µm 10 – 100 µm Citosqueleto Ausente Presente Organelos citoplasmáticos Ausente Presente 6 6 7 9 N.º de pares de bases do DNA 1 X 10 a 5 X 10 1.5 X 10 a 5 X 10 Cromossomas Molécula de DNA circular Múltiplas moléculas de DNA lineares As células procariotas têm uma organização interna muito simples; (A) Micrografia electrónica de uma secção fina de E. Coli; (B) Micrografia electrónica de uma célula do plasma, um glóbulo branco que segrega anticorpos; 2  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 ii) Noção de tamanho e superfície em sistemas biológicos É preciso achar a melhor relação superfície volume de modo a, por um lado, não comprometer a sobrevivência da espécie, por outro, melhorar a competitividade entre outras espécies iii) Compartimentação: os organitos Estrutura das células animal e vegetal. Ambas estão rodeadas por uma membrana plasmática que contém um núcleo, um citosqueleto, e muitos organelos citoplasmáticos em comum. As células vegetais são rodeadas por uma parede celular e contém cloroplastos e largos vacúolos iv) Sistema endomembranar  Compreende todas as membranas existentes na célula, cuja distribuição ajuda a compartimentar o citoplasma;  Este sistema inclui a membrana nuclear, a Representação do retículo membrana citoplasmática, o retículo endoplasmático rugoso e liso endoplasmático, o complexo de Golgi, os lisossomas e os vacúolos; 3 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA b) Ferramentas da Biologia Celular i) Microscopia fotónica (1) Vulgar: a luz passa através da célula e a distinção das diferentes partes depende do contraste resultante da absorção dos diferentes componentes da célula. Daí corar as amostras. (2) Confocal: a imagem obtida é filtrada pois estamos a falar de um tipo de microscopia de fluorescência onde existe muita “sobreposição” de cores. A imagem fica, assim, mais nítida ao filtrar alguns raios. (3) DIC (Differencial Interference Contrast): evidencia apenas o contorno de grandes organelos como o núcleo ou os vacúolos. Tira partido dos índices de refracção para formar a imagem. (4) TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence): usado para mostrar interacções entre simples moléculas e a membrana celular ou até mesmo para observar moléculas. Tira partido do índice de refracção e do ângulo crítico da luz. (5) FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy): consiste num feixe laser que é reflectido por um espelho dicróico na objectiva no microscópio. O feixe vai variando a sua intensidade e quando as partículas existentes florescem, essa radiação atravessa o espelho dicróico chegando ao detector. Pode ser feita uma análise fluorescência vs tempo de rastreamento. (6) LSM (Laser Scanning Microscopy): permite obter imagens de determinadas profundidades, ou seja, “às fatias”, com a ajuda de um laser que é posteriormente focado. A imagem, ao ser reflectida, é conduzida a um detector que gera um sinal eléctrico que permite a reconstrução da imagem. (7) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer): podem-se obter imagens de localização de proteínas com uma resolução espacial além dos limites do microscópio convencional. (8) FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching): técnica óptica capaz de quantificar a difusão lateral de uma “fatia de moléculas” marcadas fluorescentemente ou para examinar células isoladas. (9) FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy): técnica de imagiologia para produzir uma imagem baseada nas diferenças de decaimento na fluorescência. (10)PFM (Photonic Force Microscope):a luz dispersa e aquela que é alterada pela amostra são recebidas por uma lente e projectada num QPD (Quadrant Photo-Diode. A interferência entre a lente e o QPD emite sinais que permitem localizar tridimensionalmente os vários locais de refracção da amostra e reconstruir a imagem a três dimensões. 4  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 ii) Microscopia electrónica (resolução cem vezes melhor que a fotónica) (1) TEM (Transmission Electron Microscopy): um feixe de electrões é transmitido por uma amostra ultrafina. A interacção dos electrões com a amostra é ampliada e focada num dispositivo de imagem. (2) SEM (Scanning Electron Microscope): consegue-se obter uma imagem em três dimensões, graças à “interpretação” feita de acordo com a energia dos electrões. (3) cryoEM (Cryo-Electron Microscopy): permite, através de microscopia electrónica, ver as amostras sem qualquer tipo de fixação, mas sim a temperaturas baixas, sendo para isso preservadas em azoto líquido. Permite também observar o interior da célula pois a criopreservação gera o afastamento da membrana celular. iii) Fraccionamento subcelular: através da centrifugação diferenciada obtêm-se sedimentos de várias partes da célula. O objectivo é isolar organelos de células eucariotas. iv) Cultura de células: fibroblastos e HeLa (tipo de células de uma linha imortal) são células muito utilizadas em culturas celulares. v) Viroses: muito utilizadas para colocar pedaços de DNA ou RNA em células que se estão a estudar. vi) Microinjecção: processo mecânico no qual uma agulha de 0.5 a 5 micrómetros de diâmetro penetra na membrana celular ou envelope celular. vii) Engenharia genética: utilizada de modo a possibilitar a expressão de um gene num ser vivo para aumentar a sua utilidade. c) Células como modelos experimentais i) E. coli e outras bactérias: utilizadas para o estudo de muitos aspectos fundamentais da bioquímica e da biologia molecular. São úteis pois o seu crescimento pode ser controlado mediante determinadas condições laboratoriais e devido ao seu rápido crescimento. ii) Leveduras: utilizadas para o estudo de aspectos fundamentais da biologia das células eucarióticas. O seu crescimento é rápido e o facto de serem eucarióticas permite aproximar conclusões tiradas das leveduras a outras células eucarióticas. iii) Dictyostelium discoideum: é um eucariota primitivo que durante o seu ciclo de vida para de uma colecção de amibas unicelulares para um conjunto multicelular e, posteriormente, para um corpo frutificante. São utilizadas devido ao seu curto ciclo de vida. iv) Caerhabditis elegans: é um nematóide (verme) que devido à sua simplicidade e fácil reprodução em laboratório se tornou útil para estudar processos relativos à multicelularidade. 5 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA v) Drosophila melanogaster: mais conhecida por mosca-da-fruta, tem elevada importância em laboratório pois são utilizadas para experiências de engenharia genética. A facilidade de manter em laboratório e o curto ciclo de vida são factores favoráveis à sua utilização. vi) Arabidopsis thaliana: é uma planta utilizada para o estudo do desenvolvimento das plantas devido à facilidade com que se reproduz em laboratório e à sua pequena complexidade. vii) Vertebrados: apesar da dificuldade em estudá-los, principalmente devido à sua complexidade, interessa estudá-los pois estão mais perto (em termos de complexidade) do organismo humano e um interessa intrínseco é compreendermos o nosso organismo. viii) Xenopus laevis: é uma rã cujos ovos são anormalmente grandes (cerca de 1 mm cada) e, por isso, todas as fases de desenvolvimento ocorrem no exterior da mãe, podendo ser acompanhadas. Além disso, consegue-se obter um elevado número de ovos facilmente. Este possibilita a execução de estudos a nível dos mecanismos moleculares de controlo do desenvolvimento, da diferenciação e da divisão de células de embriões. ix) Zebrafish: é um peixe que facilmente se mantém em laboratório e que facilmente se reproduz. O embrião desenvolve-se fora da mãe e é transparente, podendo ser observado. Promete ser a ponte entre os invertebrados simples e os humanos. x) Medakafish: é um peixe que tem um curto período de gestação e são muito proliferativos em termos reprodutivos. Facilmente se fazem medakafish transgénicos, daí a sua utilização. xi) Ovos de galinha: o desenvolvimento embrionário da galinha e do homem têm muitas semelhanças e pelo facto do desenvolvimento do embrião da galinha se dar externamente à mãe, é possível estudá-lo e tirar conclusões aplicáveis ao homem. xii) Ratos transgénicos: a título de exemplo, num ser em que tenha sido perdida uma parte do corpo (ex: orelha), é possível recolher os genes que codificam essa parte e introduzi-los num rato. Esse rato irá produzir um órgão em muito semelhante ao do ser original 6  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 Aula 2 2) Membranas biológicas a) Introdução  Uma célula viva e o seu mecanismo de auto-replicação estão delimitados pela membrana celular – uma fina camada de lípidos que não pode ser vista directamente ao microscópio óptico. Todas as células do planeta usam a membrana para separar e proteger os seus constituintes químicos do ambiente exterior. Sem membranas não existiram células e, com consequência, não existiria vida. Assim, é de considerar que a primeira célula surgir simultaneamente com a capacidade de separar uma série de compostos químicos do meio que o rodeia.  A membrana celular tem uma forma simples: a sua estrutura é baseada numa dupla camada de lípidos com cerca de 5 nm de espessura. As suas propriedades é que são curiosas: serve de (e principalmente) barreira (prevenindo o conteúdo de escapar e misturando o meio circulante) mas também (de modo a permitir a sobrevivência e crescimento da célula) permite a troca de nutrientes e produtos de excreção entre o meio intracelular e o meio extracelular. Para permitir isto, a membrana é perfurada por canais e bombas altamente selectivos que permitem a entrada de certas substâncias enquanto outras saem. Além disto, existem moléculas proteicas que actuam como sensores, permitindo dar resposta a alterações do meio envolvente. Também as propriedades mecânicas da membranas são de destacar: quando a célula cresce ou altera a forma, também a membrana o faz (aumentando a área por adição de nova membrana sem perder a sua continuidade). Se a membrana for perfurada, ela não rompe como um balão ou permanece dividida: ela veda rapidamente a perfuração.  A bactéria mais simples tem apenas uma única membrana (membrana plasmática) enquanto as células eucarióticas incluem uma profusão de membranas que delimitam os compartimentos intracelulares. Estes compartimentos são construídos pelo mesmo princípio da membrana plasmática, servindo também de barreiras selectivas. Estas membranas mantêm as diferentes características relativamente à composição e função dos vários organelos. Estas membranas internas não servem apenas de barreiras mas também têm diferenças subtis entre elas, especialmente a nível das proteínas constituintes de cada uma. 7 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA b) Breve história dos estudos da estrutura da membrana plasmática  Anos 20 E. Gorter e F. Grendel descobriram que os lípidos, nas membranas biológicas, se organizam em bicamada. Verificaram também que a quantidade de lípidos da membrana plasmática é igual ao dobro das dimensões superficiais da mesma (no caso da experiência, de glóbulos vermelhos)  Anos 40 H. Davson e J. F. Danielli reforçam a interpretação de Gorter e Grendel mas adicionando uma camada de proteínas de ambos os lados da membrana  Anos 60 Por difracção de raios X e por microscopia electrónica de transmissão concluiu-se que na membrana os lípidos mais abundantes são os fosfolípidos, seguidos pelo colesterol e pelos glicolípidos  1972 Nicolson e Singer postulam o modelo do mosaico fluido, em que um mosaico de moléculas proteicas está colocado numa camada fluida de lípidos c) Estrutura A organização estrutural das membranas biológicas é comum na maior parte das células:  Bicamada lipídica: de natureza antipática (impermeável à água e a moléculas solúveis em meios aquosos) com proteínas associadas  Proteínas: estruturas termodinamicamente estáveis, cuja manutenção não requer a hidrólise de ATP. São responsáveis por muitas funções especializadas e podem atravessar inteiramente a espessura da bicamada ou podem estar associadas apenas a um dos seus folhetos d) Constituição i) Lípidos Os lípidos constituem cerca de 50% da massa de maior parte das membranas biológicas.  Membranas plasmáticas: 50% lípidos, 50% proteínas  Membranas mitocondriais: 25% lípidos, 75% proteínas → reflecte a abundância de complexos proteicos envolvidos no transporte de electrões e fosforilação oxidativa (1) Fosfolípidos (mais abundantes) Estas moléculas combinam duas propriedades importantes: cabeça hidrofilíca (grupo fosfato) e duas caudas hidrofóbicas (ácido gordo). Uma propriedade importante dos fosfolípidos da bicamada lipídica é o seu comportamento como fluido bidimensional que permite a livre rotação e o movimento lateral (difusão lateral). Também pode ocorrer (raramente) o movimento de flip-flop em que dois fosfolípidos de folhetos diferentes trocam de posição. 8  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 Observação: Em soluções aquosas, os fosfolípidos formam espontaneamente bicamadas. A isto está associada a formação de lipossomas (que têm uma verdadeira bicamada) e não de micelas (que não têm uma verdadeira bicamada). (a) Glicerofosfolípidos (i) Fosfatidilcolina – não apresenta carga a pH fisiológico (ii) Fosfatidiletanolamina – não apresenta carga a pH fisiológico (iii) Fosfatidilinositol – menor quantidade, apresenta carga negativa, importante nos “rafts” (iv) Fosfatidilserina – apresenta carga negativa (b) Esfingomielina – não apresenta carga a pH fisiológico 9 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA (2) Colesterol (segundo mais abundante)  Inserem-se na bicamada com o seu grupo hidroxilo polar perto da cabeça hidrofóbica dos fosfolípidos  Aumenta a rigidez da membrana através da interacção dos anéis de hidrocarbonados do colesterol com as regiões das cadeias de ácidos gordos dos fosfolípidos adjacentes  Assume importância nos “rafts” ↑ rigidez → ↓ permeabilidade → ↑ tolerância a baixas temperaturas Nota: as membranas procarióticas não têm colesterol (3) Glicolípidos  Os glicolípidos apenas se encontram no folheto exoplasmático da membrana celular das células eucarióticas.  Não têm capacidade de fazer movimento flip-flop  Podem actuar como receptores específicos de moléculas presentes fora da célula ou terem efeito protector  Podem ligar-se a componentes de natureza intercelular  Os principais são: glicose, galactose, manose, fucose, N-acetil-glucosamina, ácido sálico  Assumem importância nos “rafts” Rafts: agregados de esfingolípidos (esfingomielina e glicolípidos) e colesterol que se move lateralmente na membrana, formando domínios; não têm funções no processo de movimentação das células e são importantes na sinalização celular 1.Non-raft membrane; 2.Lipid raft; 3.Lipid raft associated transmembrane protein; 4.Non-raft membrane protein; 5.Glycosylation modifications (on glycoproteins and glycolipids); 6.GPI-anchored protein; 7.Cholesterol; 8.Glycolipid 10  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 ii) Proteínas  Constituem 25% a 75% da massa de várias membranas de uma célula  Desempenham numerosas funções como a formação de canais de passagem, transporte activo de iões e pequenas moléculas, expressão de receptores envolvidos na actividade celular ou em fenómenos de endocitose, a ancoragem da membrana a elementos do citosqueleto, etc.  Possuem movimento de rotação e difusão lateral mas não de flip-flop (1) Integrais (a) Transmembranares: grande dificuldade de separação (b) Ligadas a lípidos: ligação covalente mais forte (2) Periféricas (a) Ligadas a proteínas o Ligação não covalente, logo, muito fraca o Separam-se por métodos simples o A camada lípidica, embora removidas proteínas, mantém-se intacta e) Funções das proteínas Podem desempenhar diversas funções nomeadamente de transportadores, receptores, enzimas, ligação ao citosqueleto, interacção celular, etc. f) Propriedades da bicamada i) Fluidez Corresponde ao movimento lateral a que os fosfolípidos e proteínas estão sujeitos ao longo do plano de cada um dos dois folhetos da bicamada. O arranjo geométrico das extremidades hidrofóbica dos fosfolípidos condiciona o seu movimento de lateralidade no plano das membranas, bem como a sua fluidez, 11 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA alterando também a temperatura a que é preciso descer para induzir a transição de fase líquida para fase cristalina da membrana. Os fosfolípidos saturados apresentam uma difusão lateral mais rápida na membrana e atingem uma transição de fase a temperaturas menos baixas que os fosfolípidos insaturados  Composição em lípidos ↓esfingolípidos + ↓colesterol + ↑glicerofosfolípidos → ↑ fluidez  Estrutura das caudas dos fosfolípidos ↑ grau de insaturação + ↓ comprimento → ↑ fluidez  Temperatura ↑ temperatura → ↑consistência fluida ii) Assimetria Deve-se à diferença de composição molecular entre as duas camadas da membrana, pois os fosfolípidos e as proteínas não se encontram distribuídos de forma equivalente nos dois folhetos da membrana, estando os glicolípidos presentes apenas no folheto exoplasmático da bicamada fosfolipídica. Constituintes predominantes Face exoplasmática Face protoplasmática Esfingomielina Fosfatidilserina Fosfatidilcolina Fosfatidilinotisol Glicolipidos Fosfatidiletanolamina Nota: o colesterol apresenta-se em proporções idênticas em ambas as faces iii) Impermeabilidade A bicamada fosfolipidica tem uma permeabilidade selectiva 12  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 g) Técnica de criofractura  A criofractura dá-se pelo congelamento rápido de uma célula ou tecido que será fracturado de seguida  A fractura tende a ocorrer nas regiões com ligações mais fracas: interacções hidrofóbicas  Rompe-se a bicamada em duas monocamada: P e E  Faz-se um molde das regiões fracturadas com metal pesado (ex: platina) e destrói- se o material biológico  Os moldes são examidados ao microscópio electrónico e mostram saliências correspondendestes ás proteínas transmembranares, comprovando a sua existência  A maioria das proteínas fica na face P  Proteínas integrais: o Atravessam o plano hidrofóbico da membrana e são observadas nas faces de fractura o Segmentos membranares das proteínas integrais organizam-se, habitualmente, em hélices do tipo α (ou cadeias polipéptidicas que se curvam sobre si próprias formando um poro – β-barril) o Contêm segmentos hidrofóbicos na sua molécula e porinas (proteínas que formam canais na membrana externa de algumas bactérias) o São de purificação mais difícil que as proteínas periféricas. o O seu isolamento requer uma ruptura da bicamada fosfolípidica o Tratando com detergente → Ligam-se às regiões hidrofóbicas destas proteínas → Separando as extremidades não polares → Forma micelas  Proteínas periféricas: o Não atravessam o plano hidrofóbico da membrana e são observadas nas superfícies de membranas intactas o A sua purificação é mais fácil: basta preparar soluções de salinidade elevada, não sendo, portanto, requerida disrupção prévia da bicamada fosfolípidica o Temos as glicoproteínas e as proteínas ligadas a lípidos (GPI) – têm um comportamento semelhante às proteínas integrais. 13 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA h) Movimento das proteínas i) Mosaico fluído Denominação utilizada para fazer referência ao conceito actual de estrutura dinâmica das membranas biológicas, onde estas apresentam na sua estrutura proteínas inseridas na bicamada lípidica. O movimento por difusão lateral das proteínas e dos lípidos dá um suporte para este modelo. Foi apresentado por Singer e Nicolson em 1972. Modos de comprovar o modelo:  Fusão o Marcação fluorescente com anticorpos específicos para o reconhecimento de proteínas membranares humanas e de rato o Fusão de células humanas e de rato num meio de cultura que permita a formação de células híbridas humano-rato o Imediatamente após, ocupam locais diferentes e separados na membrana o Algum tempo depois, estavam misturadas, mostrando o livre movimento das proteínas na membrana plasmática  FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) o Marcar todos os lípidos com fluorescência, “queimar” (“bleach”) uma área e verificar que algum tempo depois já estavam misturados 14  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 ii) Domínios As células têm modos particulares de confinar a proteínas da membrana plasmática a uma localização específica, criando regiões especializadas a que se chamam domínios membranares, podendo existir na superfície da célula ou na superfície de organelos (1) Células epiteliais  O domínio apical e o domínio basolateral têm função e composição diferentes. (2) Rafts Tal como já mencionado, raft é um agregado de esfingolípidos (esfingomielina e glicolípidos) e colesterol que se move lateralmente na membrana, formando domínios; não têm funções no processo de movimentação das células e são importantes na sinalização celular  Os rafts apresentam composição e função diferentes de outras partes da membrana logo, são considerados domínios  O principal composto que difere dos rafts para a restante membrana é o colesterol iii) Funções Devido à existência de vários domínios, a membrana apresenta várias funções: Isolamento Reacções enzimáticas Compartimentação intracelular Ancoragem para o citosqueletp Transporte Reconhecimento celular Receptores para sinalização celular Motilidade 15 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA Aula 3 3) Transporte através de membranas celulares a) Introdução A nossa unidade básica da vida, a célula, precisa de produzir energia de modo a dar procedimento às várias actividades metabólicas que mantêm a nossa homeostasia. Para tal é imperativo que, por um lado, seja transportada matéria-prima para o interior de modo a produzir a energia (cuja molécula base para nós é o ATP) e, por outro, sejam transportados para o exterior produtos de excreção de modo a manter a homeostasia da própria célula. De modo a compreender o funcionamento da própria célula, devemos estudar o modo como se dá o transporte das matérias-primas e dos produtos de excreção. Os vários tipos de transporte aparecem resumidos no seguinte esquema: Difusão Simples Moléculas pequenas e sem Transporte carga "carrier proteins" Passivo Moléculas grandes e polares, A favor do gradiente iões Difusão facilitada Canais iónicos Moléculas grandes e polares, iões Bombas iónicas Activo Contra gradiente Simporte e antiporte Nota: os transportes através da membrana permitem a existência de gradientes de carga e gradientes de concentração  A permeabilidade selectiva das biomembranas para pequenas moléculas permite que a célula mantenha a sua composição interna: o Apenas pequenas moléculas sem carga atravessam a bicamada fosfolípidica (moléculas apolares, por exemplo O2 e CO2) o Pequenas moléculas apolares não carregadas, por exemplo H2O 16  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  O transporte das moléculas pequenas e sem carga é feito por difusão simples (T.P) o As moléculas de maiores dimensões, polares e não carregadas (por exemplo, a glicose), não podem passar. O mesmo acontece com os iões (difusão facilitada de menor eficácia)  Apesar dos iões e a maior parte de moléculas polares não conseguem atravessar a biomembrana por difusão, o facto é que várias moléculas como a glicose aparecem dentro da célula. Ou seja, atravessaram a membrana. Este transporte ocorre por acção de proteínas transmembranares específicas, que funcionam como transportadoras. Tais proteínas transportadoras determinam a permeabilidade selectiva da biomembrana e possuem um papel muito importante no funcionamento da membrana.  Existem várias regiões de cruzamento na membrana que formam uma passagem através da bicamada lipídica permitindo que as moléculas polares ou carregadas atravessem a membrana através de um poro proteico sem interagir com as cadeias hidrofóbicas dos ácidos gordos dos fosfolípidos da membrana.  Essas proteínas transportadoras podem ser de dois tipos que mais à frente serão abordadas: as proteínas de canal (“channel proteins”) e as “carrier proteins”. b) Transporte passivo  Não ocorre consumo de energia  A favor do gradiente, ou seja, do mais concentrado para o menos concentrado (se as células forem neutras) i) Difusão simples  Atravessam a membrana (dissolvem-se e difundem-se directamente, sem proteínas transportadoras  Não tem especificidade 17 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA ii) Difusão facilitada (1) Carrier proteins – proteínas transportadoras  Ligam-se selectivamente a pequenas moléculas específicas (por exemplo, a glicose) e transportam-nas  Funcionam como enzimas para facilitar a passagem de moléculas específicas através das membranas  Ao ligarem-se sofrem mudanças conformativas que abrem os canais através dos quais a molécula pode passar a ser libertada para o outro lado (2) Channel proteins – canais iónicos  Permitem a passagem de vários iões inorgânicos através das membranas  Permitem um transporte rápido e altamente selectivo  Quando abertos, formam pequenos poros através dos quais iões do tamanho e carga apropriados podem passar por difusão simples  Podem ser selectivamente abertos ou fechados em resposta a sinais extracelulares  Os motivos de fecho são os da imagem acima: voltagem (diferenças de potencial), ligação de um ligante ou por stress 18  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 iii) Selectividades dos canais de Na+ e K+  Os canais de Na+ são cerca de dez vezes mais permeáveis ao Na+ do que ao K+ Explicação: o canal de Na+ será estreito o suficiente para dificultar a passagem de K+ mas não de Na+  Os canais de K+ são cerca de mil vezes mais permeáveis ao K+ do que ao Na+ Explicação: apesar de ter poros apertados, era de esperar que, pelo menos, o ião de Na+ passasse pelo canal. Contudo, este canal possui um filtro selectivo com grupos carbonilo (C=O). Isto faz com que quando um ião de K+ entra no filtro selectivo o grupo carbonilo interaja com o K+ hidratado, desidrate-o e permita a entrada do ião K+ desidratado através do poro. Em contraste, o ião Na+ mantém-se ligado à água, sendo demasiado grande para passar o poro. iv) Técnica patch-clamp  Esta técnica permite o estudo dos canais iónicos  Recorre-se a uma micropipeta com um diâmetro aproximado a 1 µm para isolar uma pequena parte da membrana, permitindo a passagem de iões através de um único canal que está a ser analisado, aumentando a precisão dos estudos à actividade dos canais iónicos 19 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA c) Gradientes iónicos e potenciais de membrana  O fluxo de iões através da membrana faz-se de acordo com o gradiente electroquímico: o Concentração o Potencial  A equação de Nernst dá-nos quantitativamente a relação entre a concentração de iões e o potencial da membrana Potencial de equilíbrio: V – potencial de equação (V); R – Constante de gases; T- Temperatura absoluta; F – Constante de Faraday; Co – concentração dos iões no exterior; Ci – concentração dos iões no interior  Nas células em repouso há um potencial de membrana  Todas as células, incluindo nervos e músculos, contêm bombas de iões que usam energia proveniente da hidrólise do ATP para o transporte activo de iões através da membrana plasmática  O transporte de iões resulta no estabelecimento de um gradiente eléctrico através da membrana (normalmente 60 mV) d) Canais iónicos: células nervosas  A condução do impulso nervoso é um dos casos em que o transporte de iões através da membrana (neste caso do axónio) é bem patente 20  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  Segue-se uma descrição da transmissão do impulso nervoso ilustrado no gráfico acima  Os potenciais de acção são geralmente mediados por canais de Na+ activados por voltagem e) Células nervosas e musculares 21 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  A despolarização de regiões adjacentes da membrana plasmática permite a propagação de sinais eléctricos pelos axónios, resultando numa rápida transmissão  A chegada de potenciais de acção ao terminal de muitos neurónios desencadeia a libertação de emissores (por exemplo, a acetilcolina – faz passagem de um sinal entre células em sinapse)  Os neurotransmissores são libertados pelas células pré-sinápticas e ligam-se aos receptores das membranas pós-sinapticas, provocando a abertura dos poros dos canais iónicos (por exemplo, o receptor de acetilcolina de uma célula muscular)  A ligação da acetilcolina abre o canal iónico que é permeável tanto para iões Na+ como para K+ e permite um rápido fluxo de Na+ que despolariza a membrana da célula muscular e activa o potencial de acção  Esta alteração leva à activação do canal de Ca2+ por voltagem, levando a um aumento da concentração de Ca2+ num meio intracelular que sinaliza uma contracção i) O receptor acetilcolina  Quando fechado, o poro do canal está bloqueado por cadeias hidrofóbicas do aminoácido num local chamado gate  Quando a acetilcolina se liga, induz uma alteração conformacional de tal modo que as cadeias hidrofóbicas saem do gate, podendo haver passagem de iões carregados.  O canal continua impermeável a iões com carga negativa porque tem um revestimento com iões negativos f) Transporte activo Transporte activo  Move solutos contra os seus gradientes electroquímicos: necessita de energia Hidrólie de ATP  O transporte activo depende da energia do ATP Ex: Bombas iónicas (Adenosina Tri-Fosfato), que ocorre em bombas Gradientes iónicos iónicas, ou da energia que resulta do fluxo Ex: Simporte e antiporte electroquímico de iões que passam a favor do gradiente, que ocorre por simporte e antiporte 22  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 i) Bombas iónicas  Muitas vezes, a célula tem de transportar moléculas contra o seu gradiente de concentração  De modo a contrariar a direcção energeticamente favorável, temos de usar energia proveniente do ATP para contrariar o gradiente.  Um bom exemplo de uma bomba iónica é a de Na+/K+ (1) Bomba iónica de Na+/K+  A concentração de Na+ é aproximadamente dez vezes superior no interior da célula, sendo a de K+ superior no interior.  Estes gradientes são mantidos pelas bombas de Na+/K+ contra o gradiente  Os iões se sódio ligam-se à zona de afinidade no interior da célula  Ocorre a hidrólise do ATP e a fosforilação da bomba, havendo uma alteração conformacional e ficando o ião de sódio para o exterior, diminuindo a sua afinidade  Os iões de sódio vão para o meio extracelular e os iões de potássio ligam- se à bomba  Esta ligação leva a uma alteração conformacional, colocando o ião potássio no interior da célula e diminuindo a sua afinidade com a bomba  A bomba tem três locais de ligação para o ião Na+ e dois para o ião K+. Ou seja, saem 3 iões de sódio e entram 2 de potássio por 1 molécula de ATP  Estima-se que o consumo de 25% do ATP das células animais se deva a esta bomba 23 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA (2) Equilíbrio osmótico  Em muitos animais, a bomba de Na+/K+ mantém o equilíbrio osmótico e o volume da célula  Devido às diferenças de pressão osmótica originada por outros compostos (moléculas orgânicas, etc.), é necessário encontrar um equilíbrio, caso contrário a célula romperia  Assim, a bomba de Na+/K+ é muitas das vezes a responsável por manter o equilíbrio osmótico ii) Simporte e antiporte (1) Simporte  Diferentes moléculas são transportadas na mesma direcção (por exemplo, a glicose e o ião sódio na membrana aplical do intestino)  As células epiteliais do domínio apical usam o transporte activo para passagem de açucares dietéticos e aminoácidos  No caso da glucose, ocorre um transporte que coordena o transporte de dois iões Na+ e uma molécula de glucose para o interior da célula  Não há consumo de energia uma vez que a energia proveniente do gradiente electroquímico do ião Na+ é a suficiente para mediar este transporte  Posteriormente, a glucose é libertada para baixo do tecido conjuntivo que, por conter capilares sanguíneos na superfície basolateral do epitélio intestinal, é transportado por difusão facilitada, diminuindo o gradiente de concentração 24  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 (2) Antiporte  Há transição de duas substâncias diferentes em direcções opostas  Um exemplo disto é o transporte de iões Ca2+ e Na+ nas células cardíacas  O Ca2+ é exportado das células não só pelas suas bombas iónicas mas também por Na+/Ca2+ antiporte, que transporta Na+ para o interior da célula e Ca2+ para o exterior iii) Transporte através dos epitélios  No epitélio intestinal e no epitélio estomacal ocorrem vários tipos de transporte, salientamos estes dois pois são aqueles que nos permitem a obtenção dos nutrientes para manter a homeostasia 25 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA Aula 4 4) Citosqueleto – microtúbulos e filamentos intermédios a) Introdução Como já dito, os organelos das células eucarióticas conferem-lhe um elevado nível de organização. Mesmo assim, um nível de organização superior é atingido graças ao citosqueleto, que consiste numa rede de filamentos proteicos que se estendem pelo citoplasma de todas as células eucarióticas. Estes servem de mecanismo estrutural para a célula, sendo um factor determinante no tamanho das células, na posição dos organelos e da organização do citoplasma em geral. Para além disto, o citosqueleto é responsável pelo movimento da célula (não só da célula em si mas também todo o transporte interno de organelos e outras estruturas pelo citoplasma). O citosqueleto é composto por três tipos de filamentos proteicos: filamentos de actina (microfilamentos), filamentos intermédios e microtúbulos, estando eles ligados aos organelos e à membrana plasmática por uma variedade de proteínas acessórias. b) Microtúbulos (terceiro componente principal)  Estruturas cilíndricas rígidas de centro oco com aproximadamente 25 nm, sendo observados na célula sob a forma de feixes paralelos  Constituídos por uma única proteína globular (tubulina) de α-tubulina e β-tubulina  Os dímeros de α-tubulina e β-tubulina formam uma 26  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 parede constituída por 13 protofilamentos alinhados longitudalmente  São estruturas polarizadas com duas extremidades distintas: a positiva (onde se dá o crescimento e uma associação de dímero) e a negativa (onde se dá o encurtamento e uma dissociação de dímeros)  A polimerização ou despolimerização (extremidade positiva e negativa, respectivamente) depende da concentração dos dímeros de tubulina e da ligação do dímero ao GTP (Guanosine triphosphate)  O GTP liga-se à β-tubulina favorecendo a polimerização. Contudo, se o GTP for hidrolisado para GDP verifica-se o enfraquecimento da afinidade da ligação da tubulina com as proteínas adjacentes, levando à despolimerização Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1203.html  A polimerização dos microtúbulos desempenha um papel fundamental na determinação do movimento ao longo dos microtúbulos, podendo dizer-se que apresentam uma instabilidade dinâmica devido á forma imprevisível como tendem a polimerizar e despolimerizar 27 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA Devido à instabilidade dinâmica já abordada, a maioria dos microtúbulos estaria frequentemente desagregados. Contudo, este comportamento consegue ser controlado por interacções dos microtúbulos com MAPs (Microtubule Associated Proteins).  Têm a função de estabilizar os microtúbulos, diminuindo a concentração crítica necessária à formação dos microtúbulos e favorecendo a taxa de adição de tubulina em relação à sua taxa de dissociação  Verificou-se a existência de quatro tipos de proteínas MAP o Presentes nos neurónios  MAP-1  MAP-2  Tau o Presentes em todas as células não-neuronais dos vertebrados  MAP-4  Na maioria das células os microtúbulos estendem-se a partir do centro organizar de microtúbulos (MTOC – Microtubule Organization Centre)  Nas células animais propagam-se através do centrossomo  O centrossomo tem um papel determinante e essencial na organização intracelular dos microtúbulos - é o centro de iniciação da formação dos microtúbulos, localizando-se nele as extremidades negativas dos microtúbulos  A importância do centrossoma deve-se a um polipéptído chamado γ-tubulina  O centrossoma, para além da γ-tubulina, também é constituído por um par de centríolos orientados perpendicularmente a circundados pelo material pericentriolar 28  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  Os microtúbulos são responsáveis por uma grande variedade de movimentos na célula: transporte intracelular, posicionamento de vesículas da membrana e de organelos, separação dos cromossomas durante a mitose e movimento dos cílios e dos flagelos  O movimento ao longo dos microtúbulos está dependente de duas grandes famílias de proteínas motoras: as cinesinas e as dineinas, deslocando-se ao longo dos microtúbulos em sentidos diferentes  As cinesinas deslocam-se no sentido da extremidade positiva (do centrossomo para a periferia)  As dineínas deslocam-se no sentido da extremidade negativa (da periferia para o centrossoma) Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1204.html  Os cílios e os flagelos são projecções da membrana plasmática constituídas por microtúbulos, sendo responsáveis pelo movimento de várias células eucarióticas  Os cílios e os flagelos são semelhantes a nível do diâmetro (aproximadamente 0.25 µm) mas diferem a nível do comprimento: os cílios com cerca de 10 µm e os flagelos podem atingir os 200 µm  A estrutura principal de ambos designa-se axonema, sendo constituído microtúbulos e dineínas 29 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  O seu arranjo baseia-se num par central de microtúbulos rodeado por nove dímeros de microtúbulos, estando os pares de microtúbulos exteriores associados entre si e ligados radialmente ao par central por uma proteína chamada nexina  A extremidade negativa dos microtúbulos que formam os cílios e os flagelos aderem à célula através do corpo basal, cuja estrutura é semelhante à do centríolo  O movimento dos cílios e dos flagelos resulta do deslizamento entre os dímeros de microtúbulos do axonema promovido pelas dineínas do axonema  Os cílios oscilam num movimento de trás para a frente (responsáveis pelo transporte de flídos e mucos ao longo da superfície de tecidos epiteliais dos animais) e os flagelos possuem movimento ondulatório (deslocamento de vários protozoários e também dos espermatozóides) 30  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  A capacidade dinâmica dos microtúbulos verifica-se também ao nível da mitose: o arranjo de microtúbulos desfaz-se e a tubulina é reorganizada segundo um novo padrão (o fuso mitótico).  De modo a ocorrer esta reestruturação, ocorre a duplicação do centrossomo, existindo dois centros organizadores distintos em pólos opostos da célula  Em interfase, dá-se a duplicação do centrossomo. Em prófase, a ascensão polar dos diferentes centrossomos, gerando dois pólos do fuso mitótico  O fuso mitótico é formado por três tipos de microtúbulos o Cinetocoros: aderem aos cromossomas condensados ao nível do centrómero, desempenhando um papel fundamental na separação dos cromossomas o Polares: não aderem aos cromossomas mas partem dos dois centrossomas e sobrepõem-se no centro da célula o Astrais: partem do centrossomo em direcção à periferia da célula, junto à membrana celular  Os cromossomas alinham-se na placa equatorial e separam-se devido à ascensão polar, feita pelas proteínas motoras associadas aos microtúbulos  Devido ao papel que os microtúbulos têm, substâncias que afectam a junção dos microtúbulos são úteis não só como ferramenta experimental mas também no tratamento do cancro o Colchicina e colcemida: ligam-se à tubulina e inibem a polimerização dos microtúbulos, podendo bloquear a mitose o Vineristina e vimblastia: usadas na quimioterapia do cancro, inibem de um modo selectivo a divisão de células o Taxol: estabiliza os microtúbulos em vez de inibir a sua formação, bloqueando a divisão celular. É utilizado como agente anticancerígeno e como ferramenta em experiências o Nocodazol: inibe a polimerização dos microtúbulos c) Filamentos intermédios  Constituintes do citosqueleto com diâmetro entre os microtúbulos e os microfilamentos: entre os 8 e os 11nm  Estão presentes na maioria das células eucarióticas, sendo os elementos mais estáveis do citosqueleto e os menos solúveis de toda a célula  Formam uma rede perinuclear que se estende desde o núcleo até à membrana plasmática e podem ocorrer em pequenos feixes ou aglomerados de feixes compactos (por exemplo, nas células epiteliais) 31 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  As proteínas que os constituem são fibrosas, possuindo um domínio central em hélice α e as suas extremidades apresentam duas porções globulares cujas dimensões e sequências são variáveis, conferindo às diferentes estruturas características específicas, originando diferentes tipos de filamentos intermédios  O domínio central é comummente composto por cerca de 310 a 350 aminoácidos, sendo o responsável pela manutenção de uma estrutura idêntica entre os diferentes tipos de filamentos  Os diferentes tipos de filamentos intermédios resultam de diferentes proteínas que os constituem o Tipo I:essencialmente constituído por citoqueratinas ácidas, presentes nas células epiteliais o Tipo II: essencialmente constituído por citoqueratinas básicas ou neutras, presentes nas células epiteliais o Tipo III: constituído por vimentina (células do mesênquima), desmina (células musculares), proteína ácida fibrilar glial (células gliais e astrócitos) e periferina (neurónios do sistema nervoso periférico) o Tipo IV: constituído por proteínas dos neurofilamentos (NF-L, NF-M, NF-H) presentes no tecido nervoso periférico maduro e têm a importante função de conferir suporte e estabilidade mecânica aos outros componentes do citosqueleto no axónio das células nervosas, principalmente nos neurónios motores. Também é constituído pela α internexina (presente no tecido nervoso em crescimento) o Tipo V: constituído por lâminas nuclear A, B e C, presentes no invólucro nuclear e exclusivas do núcleo o Tipo VI: constituído por nestinas, proteínas das células neuroepiteliais 32  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  Na formação de um filamento o Um monómero emparelha com outro, dando origem a um dímero que mantém as regiões homólogas emparelhadas na forma helicoidal o Os vários dímeros alinham-se dois a dois de modo antiparalelo, formando um tetrâmero, composto por quatro cadeias polipéptidicas o Um tetrâmero corresponde a um protofilamento e apresenta 2 a 3nm o Quando quatro protofilamentos se enrolam entre si sob a forma helicoidal dão origem a protofibrilas que, por sua vez, originam filamentos intermédios (10nm) quando se associam quatro a quatro  Os filamentos intermédios desempenham variadas funções relacionadas com a resistência mecânica das células e da própria membrana plasmática nos locais de contacto com outras células, participando também na organização das células aquando a formação de tecidos, bem como no transporte de macromoléculas e vesículas. São importantes para a estabilidade estrutural e posicionamento do núcleo e também na própria arquitectura da célula e dos tecidos  Para desempenhar estas funções, os filamentos intermédias associam-se e/ou interagem com outras estruturas o Junções de adesão (desmossomas e hemidesmossomas) responsáveis pela arquitectura e estabilidade estrutural da célula, bem como pela resistência a tracções e estabilidade estrutural dos tecidos e das ligações entre o epitélio e o mesênquima subjacente 33 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA o Os filamentos intermédios parecem estar indirectamente envolvidos na ligação que é estabelecida entre os vários organelos, nomeadamente entre a mitocôndria e o núcleo. A ligação entre o núcleo e a membrana plasmática é também feita através dos filamentos intermédios e acredita- se que estes estejam na base da transmissão de sinais da superfície celular para o núcleo. Os filamentos que se inter-relacionam com o núcleo são maioritariamente filamentos intermédios constituídos por vimentina.  Existem também proteínas associadas aos filamentos intermédios (IFAP) o Ligações cruzadas entre os filamentos (estando também associadas com a especificidade tecidular): as filagrinas e loricrina (dos epitélios). 34  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 o Ligações entre os filamentos e outros componentes celulares: desmoplaquinas (proteínas que se encontram nas placas dos desmossomas) e lâmina B (invólucro nuclear) o Ligações entre os filamentos e a membrana: anquirina e espectrina, ou mesmo ocorrer directamente sem interferência das proteínas referidas  Muitas doenças do foro oncológico, bem como doenças da pele (epidermólise bolhosa simples), músculos e sistema nervoso (esclerosa amiotrófica lateral) estão relacionadas com alterações nos filamentos intermédios ou das suas ligações a outros componentes celulares. Assim, uma vez que as proteínas associadas aos filamentos intermédios são dotadas de uma distribuição muito característica, tornam-se úteis na detecção de muitas doenças, bem como na escolha do tratamento mais adequado 35 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA Aula 5 5) Citosqueleto – Filamentos de actina (microfilamentos)  O principal constituinte do citosqueleto é, na maioria das células, a actina. Através de finos e flexíveis filamentos de actina (microfilamentos) de 7nm de diâmetro e vários micrómetros de comprimento  São particularmente abundantes junto à membrana plasmática de modo a agir enquanto suporte mecânico da célula e possibilitando a migração de células (movimento celular), a internalização de partículas (endocitose/fagocitose) e a divisão celular. São ainda importantes no tráfego intracelular, na contracção muscular, na sinalização intracelular e comunicação entre células, nas microvilosidades e na citocinese  Constituídos por proteínas globulares com 375 aminoácidos  Apresentam locais de ligação que permitem a formação de longas cadeias de filamentos de actina, segundo um padrão de hélice de dupla cadeia, levando à formação de uma cadeia polar (gerando um pólo positivo e um pólo negativo) que confere propriedades fundamentais que permitem um arranjo específico dos filamentos de actina e um movimento da miosina numa única direcção  O ciclo dinâmico de actina comporta várias fases o Polimerização da actina: formação de agregados de 3 monómeros o Crescimento da cadeia: ocorre de forma reversível em ambas as extremidades (treadmilling), sendo que a extremidade positiva cresce 5 a 10 vezes mais depressa que a extremidade negativa o Ligação dos monómeros a ATP: pode ou não ocorrer mas, caso ocorra, favorece a polimerização; o ATP é mais tarde hidrolisado, formando ADP, que enfraquece a ligação química e leva a um novo arranjo do filamento Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1201.html 36  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  A taxa pela qual os monómeros livres são polimerizados é proporcional às suas concentrações existindo, portanto, uma concentração crítica ma qual a taxa de polimerização é idêntica à de despolimerização  Se a concentração de monómeros livres de actina for superior à concentração crítica, a cadeia cresce. Caso contrário, decresce  Alterações de forma e movimento celular são, grandemente, possibilitados pelo descrito. Contudo, há outras proteínas que se ligam aos filamentos de actina e influenciam a sua polimerização: o Citocalasina: liga-se à extremidade positiva do filamento de actina, impedindo a adição de monómeros livres de actina, inibindo, assim, qualquer movimento celular o Faloidina: liga-se fortemente aos microfilamentos impedindo a dissociação destes em monómeros de actina  Verificou-se que a síntese de filamentos de actina in vitro é muito mais lenta do que a nível celular e isolaram-se outras proteínas (actin-biding proteins): o Cofilina: liga-se aos filamentos de actina e promove a dissociação de monómeros na extremidade negativa, permanecendo posteriormente a cofilina ligada aos monómeros de actina com ADP, impossibilitando a incorporação destes no filamento o Profilina: liga-se aos monómeros de actina e trocam o ADP por ATP, promovendo a polimerização o Arp2/3: proteína que serve de local de nucleação para iniciar o arranjo de novos filamentos Nota: a acção destas proteínas é regulada por sinalização celular como resposta a estímulos exteriores  Padrões de organização dos filamentos de actina o Feixes de actina: os filamentos estão estreitamente ligados segundo planos paralelos. As proteínas envolvidas (proteínas empacotadoras de actina) são pequenas e rígidas, obrigando os filamentos de actina a ficarem próximos e alinhados, existindo dois tipos  Padrão segundo planos paralelos bastante próximos uns aos outros Nestes filamentos todos têm a mesma polaridade com a extremidade negativa ligada à membrana plasmática. Um exemplo de proteína envolvida nestes feixes é a fimbrina, que se liga como um monómero à actina e mantém juntos dois filamentos Ex: microvilosidades: proteínas empacotadoras: vilina e fimbrina; Ligação à membrana plasmática: braços laterais compostos por associações de calmodulina; extremidade negativa: ancorada ao córtex da actina, que interliga e estabiliza as vilosidades 37 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  Padrão mais fraco, sendo realizadas acções de contracção Estes padrões verificam-se no anel contráctil na citocinese, devendo-se à distância que separam os diferentes filamentos de actina. A proteína mediadora é a α-actinina o Redes de actina: os filamentos estão organizados segundo um padrão ortogonal que gera uma malha tridimensional 38  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  As proteínas envolvidas são flexíveis e podem ligar filamentos perpendiculares  São mantidos por proteínas que se ligam aos filamentos de actina, como a filamina – estas proteínas têm dois locais de ligação à actina e uma estrutura bastante flexível em forma de V  Os filamentos de actina encontram-se preferencialmente junto das regiões periféricas das células, junto das membranas plasmáticas, associada a proteínas, denominando-se córtex e estando envolvido em várias actividades da superfície celular  Ao contrário de algumas células que não têm de se ligar à matriz extracelular (ex: glóbulos vermelhos), outras têm de efectuar essa ligação (ex: fibroblastos), existindo locais próprios para essa ligação. Essa ligação é viabilizada pelas por uma proteína chamada integrina, em locais discretos (focos de adesão) e os filamentos de actina produzidos no interior da célula para que a membrana se estenda e possa atingir a matriz são chamadas de fibras de stress  Mas as ligações não se fazem só com a matriz extracelular: há ligações célula- célula (junções de adesão). Nestes casos, a proteína transmembranar é a caderina que, por sua vez, formam proteínas citoplasmáticas (cateninas) que se associam aos filamentos de actina 39 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  Os filamentos de actina estão geralmente associados a miosina e são responsáveis por uma série de movimentos celulares (miosina: protótipo de molécula motora que transforma o ATP em energia cinética, tal como na contracção muscular)  Alguns músculos são constituídos por células longas cujo citoplasma é constituído por miofibrilas (feixes cilíndricos com dois tipos de filamentos: compactos de actina e finos de actina). Assim, cada miofibrila está organizada como uma cadeia de unidades contrácteis denominadas sarcómeros  A titina e a nebulina contribuem para a estruturação e estabilidade do sarcómero: mantêm a tensão de reposo e a retracção do músculo se este for superestendido  Contracção (cada sarcómero contrai-se): o Os discos Z ficam masi próximos o Deslizamento dos filamentos de actina por entre os filamentos de miosina, para dentro da banda A e da zona H o As bandas I e a zona H praticamente desaparecem e a banda A não sofre alteração na sua largura 40  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  A miosina envolvida neste processo é a miosina II, constituída por duas cadeias pesadas idênticas e por dois pares de cadeias leves  A região globular da miosina está ligada à actina, formando pontes entre os filamentos finos e espessos. A actina encontra-se ligada ao disco Z através da sua extremidade positiva, sendo que aquando da contracção, a miosina desloca-se no sentido da extremidade positiva, transformando energia química e levando à aproximação dos filamentos finas da linha M (região central do sarcómero), gerando a contracção muscular  A contracção muscular é mediada através de impulsos nervosos que estimulam a libertação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático. Isto induz um sinal de contracção, já que este ião se liga ao complexo proteico tropomiosina/troponina, que se encontram ligados aos filamentos de actina Visitar: http://www.sinauer.com/cooper5e/animation1202.html  A miosina e a actina também desempenham um papel importante no anel contráctil que permite a citocinese, sendo fácil entender o funcionamento vendo a imagem abaixo 41 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  O movimento celular é grandemente influenciado pelos filamentos de actina, tal como a fagocitose e a distensão dos axónios de células nervosas durante o desenvolvimento do sistema nervoso  Um processo de grande importância é o deslizamento celular, envolvendo três etapas: o Emissão de projecções (pseudópodes): por processos de polimerização e interligação de filamentos de actina o Adesão ao substrato o Destacamento da extremidade posterior da célula e sua retracção Nota: em células de movimento lento, a desão envolve a formação de um foco de adesão. Nas células de maior velocidade as ligações estabelecidas são mais difusas e não tão específicas 42  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 Aula 6 6) Integrando células em tecidos a) Introdução Existem quatro tecidos básicos: nervoso, muscular, conjuntivo (menos diferenciado e preenche os espaços entre os restantes tecidos) e epitelial (cobre as superfícies internas e externas do organismo estando sobre a lâmina basal). No nosso próprio desenvolvimento, integração de células nos tecidos assume enorme relevância pois após a diferenciação de uma célula temos de a “agarra” a algum lado. Essa adesão poderá ocorrer entre células (ou seja, uma adesão célula-célula) ou com a matriz extracelular (uma adesão célula-matriz extracelular). b) Mecanismos de adesão de moléculas de superfície  As ligações entre as moléculas de superfície podem ser de três tipos: homotípica, heterotípica ou por meio de uma molécula extracelular c) Moléculas de adesão celular (CAM’s) A adesão célula-célula e célula-matriz extracelular processam-se através de moléculas de adesão celular (CAM’s). Estas possibilitam a associação de células em tecidos e permitem a troca de informações entre os meios intra e extracelular, podem estar distribuídas ao longo da membrana ou associadas em junções. 43 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA i) Caderinas (dependentes de iões Ca2+, ligam o citosqueleto de células adjacentes) São as principais responsáveis por adesões célula-célula, têm interacções homofílicas e necessitam de iões de cálcio para formar ligações estáveis e fortes, sendo importantes para a formação e manutenção de tecidos. Os tipos mais importantes são:  E-caderina (caderina endotelial): responsável pelas interacções entre células epiteliais, podendo a sua perda levar a cancro  P-caderina (caderina placentária): ligação entre células da placenta  N-caderina (caderina neural): interacções entre os neurónios Como são selectivas, têm um papel importante na embriogénese ii) Selectinas (dependentes de iões Ca2+, formam adesões transitórias) Participam em interacções heterofílicas, possuindo um domínio conservado de lectina (na extremidade virada para o meio extracelular) que na presença de cálcio se liga a oligossacáridos específicos. Existem três tipos:  L-selectinas (leucócitos): reconhece oligossacarídeos de outras superfícies celulares  P-selectinas (plaquetas): ligam-se aos oligossacarídeos dos leucócitos  E-selectinas (células endoteliais): tem o mesmo efeito que as P-selectinas Desempenham um papel importante na resposta inflamatória (medeiam as interacções transitórias entre as células dos capilares e leucócitos) durante a migração dos leucócitos para os locais inflamados do tecido: o A parede dos capilares é activada como resposta a sinais químicos dos tecidos vizinhos que estão lesados pelo que as suas células se tornam mais receptivas à adesão de neutrófilos (mediada por selectinas P e E) o Formam-se adesões transitórias que abrandam o neutrófilo o Vão rolando e acabam por activar as integrinas que se vão ligar às ICAM’s (Immunoglobulin Celular Adhesion Molecules) o Os neutrófilos param e aderem firmemente à parede o Mudam a forma e passar para o tecido lesado → diapedese 44  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 iii) Integrinas (dependentes de iões Ca2+, formam adesões transitórias) Actuam como receptores da membrana, constituindo os principais receptores para as proteínas da matriz (colagénio, fibronectina e laminina) às quais se ligam por interacções heterofílicas. São heterodímeros, têm uma subunidade α e uma β. Regulam a forma, orientação, migração e ancoramento das células á matriz participando também na sinalização células (podem activas uma cascata de quinases) iv) Imunoglobulinas (não são dependentes de iões Ca2+, formam adesões transitórias) Proteínas membranares na superfície de linfócitos que estão envolvidos na resposta imunitária, participando em interacções homofílicas e heterofílicas (ligação às integrinas). Intervêm na sinalização celular para o interior da célula. As N-CAM’s (moléculas de adesão de células nervosas) realizam ligações homofílicas levando à formação de adesões selectivas entre células nervosas durante o desenvolvimento d) Junções celulares 45 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA i) Interacções célula-célula  Formar canais e permitir a comunicação entre células adjacentes, passando a funcionar como um todo  Permitir uma forte ligação mecânica entre células (adesão celular) conferindo rigidez aos tecidos (1) Junções de ancoramento (a) Ligações de Aderência (desmossomas circulares)  Ligam o citoesqueleto de actina (na forma filamentosa) de células adjacentes através de caderinas formando uma banda que circunda completamente a célula na superfície interna da membrana  As porções extracelulares das caderinas ligam-se umas às outras enquanto a parte citosólica se liga directamente à β-catenina, estando associada à proteína P120 que estabiliza as junções. A β-catenina ainda se liga à α-catenina que, por sua vez, está ligada aos filamentos de actina e a proteínas associadas a estes filamentos como a vinculina.  Podem intervir nectinas na recruta de proteínas para formar as junções.  Conferem suporte interno às células nos tecidos epiteliais (ex: intestino), situando-se abaixo das junções apertadas, sendo responsáveis pela inibição de contacto.  Um dos oncogenes frequentemente encontrado no cancro do cólon parece ser uma versão mutada de uma proteína que normalmente interage com as cateninas. A perda de junções de aderência funcionais pode levar à metástase de tumores. Nota: Inibição de contacto - processo natural de paragem do crescimento ou divisão celular quando duas células contactam uma com a outra, através da libertação de factores inibidores que se ligam a receptores na superfície da célula, impedindo a sua proliferação para além das necessidades do organismo (b) Desmossomas pontuais São estruturas de adesão descontínuas constituídas por duas placas densas (uma mais externa e outra mais interna), na porção citoplasmática, adjacentes à célula, que suportam os filamentos intermédios. Funções:  Manter a integridade estrutural do epitélio, fazendo com que as células actuem como um todo coeso (ex: pele)  Manter a flexibilidade das células o que lhes permite resistir ao stress mecânico (ex: músculo cardíaco) 46  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 Os filamentos intermédios de queratina das células ligam-se à desmoplaquina (placa mais interna) que se liga à parte citosólica das caderinas - desmocolina e desmogleína - através da placofilina e da placoglobina (placa mais externa). As porções extracelulares das caderinas ligam-se por interacções heterofílicas. Aparecem mais frequentemente perto da zona basal da célula, sendo a sua ligação depende da concentração de Ca2+. A disrupção destes desmossomas, na pele, pode ser causada por uma doença auto-imune – Pênfigo (Phemphigus vulgaris) – em que o paciente produz anticorpos contra a desmogleína, levando ao aparecimento de bolhas. (2) Junções apertadas Funções principais:  Manter a polaridade da célula: ao ocorrer a separação do domínio apical e basal das membranas é impedida a difusão de constituintes membranares  Barreira entre compartimentos fluidos: é impedida a passagem livre de moléculas ou iões entre as células, sendo o material obrigado a passar por difusão ou transporte activo  As proteínas que participam nestas junções são as ocludinas, as claudinas e vão-se ligar a proteínas semelhantes nas células adjacentes. As nectinas podem participar na formação destas junções  São as mais fortes e localizam-se abaixo da superfície apical entre células epiteliais adjacentes em ductos e cavidades corporais (ex: intestino), formando selas em pontos intermitentes da membrana 47 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA (3) Junções comunicantes  Participam conexinas, proteínas transmembranares que ao formarem grupos de seis originam canais (conexões) que vão abrir ou fechar conforme a concentração de cálcio e o pH (o aumento da concentração de Ca2+ e a diminuição do pH intracelular fecham o canal)  Permitem a difusão livre de iões inorgânicos e de pequenas moléculas hidrofílicas entre células vizinhas  Impedem a passagem de proteínas e ácidos nucleicos  Permitem a ligação eléctrica e metabólica entre as células: os sinais iniciados numa célula podem propagar-se rapidamente para as células vizinhas  Exemplos: o o potencial de acção no músculo cardíaco passa de célula para célula permitindo a contracção rítmica do coração o nalgumas sinapses no cérebro permitem a chegada de um potencial de acção aos terminais sinápticos para depois ser transmitido para a célula pós-sináptica sem o atraso implicado na libertação de um neurotransmissor ou seja aceleram o processo) o iniciam as contracções fortes e coordenadas do músculo liso do útero antes do parto o estão envolvidas nos movimentos peristálticos do intestino e embriogénese  Os genes que codificam as conexinas podem sofrer mutações que estão na origem de vários doenças hereditárias como deficiências cardíacas congénitas e surdez congénita Nota: Plasmodesmata - conexões citoplasmáticas análogas às junções comunicantes. Em cada plasmodesma (singular), a membrana plasmática de uma célula é contínua com a da célula vizinha formando um canal entre os citoplasmas. Uma extensão do retículo endoplasmático liso passa por um poro deixando um anel de citoplasma circundado por onde passam livremente iões e pequenas moléculas. Células adjacentes mantêm-se unidas por uma espécie de “cola”, as lamelas médias, que são regiões especializadas da parede celular ricas em pectinas ii) Interacções célula-matriz A maioria das células dos animais vertebrados não consegue sobreviver se não estiver fixada à matriz extracelular. Esta capacidade é normalmente perdida quando a célula se torna cancerosa. (1) Hemidesmossomas 48  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011  Placa que liga as células epiteliais à lâmina basal da matriz formando regiões de união pontual  Possuem uma estrutura semelhante aos desmossomas mas são química e funcionalmente distintos  Nas junções os filamentos de queratina ligam-se a integrinas, através da plectina, que por sua vez se ligam à laminina (2) Adesões focais  Ligam os feixes de actina à matriz extracelular através de integrina (que está ligada a proteínas adaptadoras como a vinculina, a talina, a filamina ou a alfa-actinina), estando os feixes ancorados à porção citoplasmática da sua subunidade β  A porção extracelular das integrinas vai ligar- se a componentes da matriz: a laminina, fibronectina ou o colagénio  São contactos dinâmicos que influenciam a migração celular: quanto maior o número de adesões focais menor a mobilidade da célula  A formação de adesões focais é regulada por quinases que se ligam a integrinas e promovem a sinalização que modela o crescimento, sobrevivência e migração celular 49 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA Resumindo: 50  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 Aula 7 7) Matriz extracelular A maioria dos tecidos dos animais está numa matriz extracelular que preenche os espaços entre as células e mantém os tecidos juntos. Existe alguns tipos de tecido conjuntivo, dependendo da variedade das proteínas e polissacarídeos produzidos a) Definição Conjunto de proteínas e polissacarídeos secretados, depositados e degradados pelas células que preenche os espaços entre aquelas e entre os tecidos, mantendo-os unidos b) Interacções célula-matriz (algumas já foram faladas)  Existe uma relação bidireccional entre as células e a matriz: o tipo de células determina o tipo de matriz e o tipo de matriz influencia as funções inerentes a cada tecido  Apesar do papel essencialmente estrutural da matriz celular, ela regula fenómenos biológicos tais como a adesão, migração e proliferação celulares. Logo, funciona como meio de comunicação entre as células, modificando o seu padrão de expressão génica e influenciando a diferenciação. c) Aspectos funcionais  Organização das células em tecidos  Protecção de agentes patogénicos  Coordenação de funções celulares por activação da sua sinalização intracelular, controlando o crescimento, proliferação e expressão genética d) Compartimentos i) Intersticial  Apresenta sobretudo função estrutural ao nível do tecido conjuntivo denso (característico pela resistência e elasticidade dada pelo colagénio e elastina) e ao nível do tecido conjuntivo laxo (caracterizado por agregados de proteoglicanos que mantêm um ambiente hidratado nos tecidos) ii) Pericelular  Constituído por fibronectinas, proteoglicanos e outras proteínas multifuncionais  Responsável pela modulação do comportamento celular  Responsável por influenciar a expressão genética das células e) Constituição i) Proteínas estruturais Constituem o sistema elástico, o qual concede resistência e flexibilidade aos tecidos (1) Colagénio  Proteína mais abundante nos tecidos dos animais 51 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  Tem mais de 19 tipos diferentes  Caracteriza-se pela existência de três cadeias polipeptídicas (cadeias alfa) em torno umas das outras, formando uma tripla hélice  A unidade estrutural é uma sequência de aminoácidos Gly-X-Y (Gly é glicerina e X e Y podem ser quaisquer aminoácido mas geralmente é prolina e hidroxoprolina, respectivamente). A glicina actua ao nível do empacotamento enquanto os outros dois aminoácidos ao nível da estabilização  Têm capacidade de polimerizar espontaneamente e de uma forma ordenada (fibrilas → fibras → feixes)  Biossíntese o Sintese de cadeias alfa o Hidroxilação e glicolisação de alguns aminoácidos o Condensação das moléculas de procolagénio em vacúolos o Secreção em vesículas para o exterior da célula o Clivagem extracelular dos procolagénios o Polimerização ordenada do colagénio (2) Elastina  Componente amorfo: não exibe subestrutura, constituído sobretudo por elastina  Componente microfibrilar o Constituído por fibrilas tubulares e pelo menos 5 proteínas importantes, sendo a mais importante a fibrilina o Permite a flexibilidade e elasticidade necessárias a estruturas como os vasos, a traqueia, etc. ii) Glicosaminoglicanos (GAG’s) e proteoglicanos (substância gelatinosa hidratada)  Os GAG são polissacarídeos constituídos por unidades repetitivas de dissacarídeos (um dos dissacarídeos pode ser tanto o N-acetilglicosamino com N-acetil-glactosamino e o outro dissacarídeo é geralmente um ácido, ou o glicorónico ou o idurónico)  Os mais abundantes são o ácido hialurónico, heparina e sulfatos de condroítina, dermatano, queratano e heparano  Todos têm carga negativa (excepto o hialuronano)  Os proteoglicanos são muito diversificados, uma vez que se ligam a muitas proteínas diferentes  Têm função de retenção de água, resistência à 52  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 compressão, ligação a fibras de colagénio (originando redes) e adesão celular (promovendo a migração de territórios de células embrionárias iii) Proteínas de adesão ou multifuncionais (ligação das células à matriz)  Possuem um número variável de regiões ou domínios, tendo grande diversidade de interacções  Interagem entre si, com outros moléculas extracelulares e com receptores celulares, desempenhando um papel estrutural adesivo  O protótipo deste tipo de moléculas e principal proteína de adesão de tecidos conjuntivos é a fibronectina (glicoproteína dimérica, constituída por duas cadeias de polipeptídicas associadas através de pontes de sulfureto, possuindo pontos específicos para a ligação com o colagénio e com os GAG’s e tem um local específico reconhecido pelos receptores da superfície celular → adesão de células à matriz extracelular)  A laminina é uma glicoproteína em forma de cruz composta por três cadeias polipeptídicas (α, β, β2) que existe em abundância na lâmina basal, possuindo várias zonas de ligação aos elementos da matriz  As interacções entre as células e as proteínas de adesão dão-se por receptores de superfície celular denominados de integrinas f) Degradação da matriz A degradação está a cargo de uma série de enzimas: enzimas de serina (resíduos de serina no centro activo) e metaloenzimas (dependem de metais para terem actividade)  Fisiológica: como é exemplo o deslocamento dos neutrófilos durante a resposta inflamatória  Patológica: como é exemplo os processos de metástases 53 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA Aula 8 8) Mitocôndrias e peroxissomas a) Mitocôndrias i) Constituição, composição e a sua genética  Duas membranas diferentes: externa e interna  A região limitada pela membrana interna: por matriz mitocondrial (existem proteínas, ribossomas e DNA, que têm uma função importante no processo de respiração celular e no processo de fosforilação oxidativa)  A membrana externa delimita o espaço intermembranar, apresentando ainda canais transmembranares formados por porinas, que tornam a membrana bastante permeável à maioria das moléculas de dimensões reduzidas  A membrana interna é bastante maior que a externa, formando uma série de invaginações que se projectam para o espaço interior – cristas mitocondriais (onde existem as partículas F1, que confere assimetria à membrana, os factores de acoplamento e grande actividade enzimática)  Os principais fosfolípidos que constituem as membranas são: fosfatilcolina, fosfatiletanolamina e a cardiolipina. São constituídas por proteínas, lípidos, ácidos nucleicos e pequenas moléculas como co-factores e subtractos  A membrana externa que é constituída por 50% de lípidos e 50% de proteínas, a membrana interna, menos espessa, é constituída maioritariamente por proteínas (76% contra 24% de lípidos)  Nos lípidos destaca-se a cardiolipina (molécula que reduz a permeabilidade da membrana à passagem de protões)  Quanto às proteínas podemos destacar 3 tipos: o as intervenientes na cadeia citocromica o integradas na fosforilação oxidativa o integradas na impermeabilidade a pequenos iões e permeabilidade a metabolitos.  Possuem um genoma próprio e toda a maquinaria para a transcrição e tradução, sendo capazes de se reproduzir autonomamente (confirmando a teoria endossimbiótica)  O genoma é constituído por uma molécula de DNA circular em cadeia dupla, podendo localizar-se na matriz da mitocôndria ou na membrana interna  Verifica-se que as mitocôndrias do embrião foram herdadas exclusivamente da mãe (uma vez que o espermatozóide não contribui com praticamente nenhum citoplasma para o zigoto) sendo o DNA mitocondrial muito utilizado nos estudos forenses para determinação/confirmação da maternidade 54  FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA 2010-2011 ii) Funções A principal fonte energética das células animais é a glicose. Este composto tem de ser processado numa série de reacções – respiração celular – que tem como objectivo transformar este composto noutros mais simples que são utilizados pela célula e ao mesmo tempo produzir energia resultante da sua degradação. Assim, são necessários vários passos diferentes:  Glicólise - decorre no citoplasma. Consiste na degradação da glicose em ácido pirúvico. É designada a fase anaeróbia da respiração (exactamente igual ao processo com o mesmo nome que decorre na fermentação). Ocorre a transformação da glicolise em aldeído fosfoglicérico, depois a isomerização e, por último, a formação do ácido pirúvico. A oxidação do ácido pirúvico decorre ainda no citoplasma e produz acetilcoenzima A glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi → 2 NADH + 2 ácido pirúvico + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+  Formação de acetil- CoA : ocorre na matriz da mitocôndria. O ácido piruvico sofre descarboxilação e oxidação por acção enzimática da piruvato- desidrogenase e NAD+, reagindo com a coenzima-A, formando-se acetil-CoA, CO2 e NADHReacção global: 2 ácido pirúvico+ 2 NAD+ + 2 CoA → 2 acetil-CoA + 2 ATP + 2 CO2 + 2 H+ 55 2010-2011 FACULDADE DE FARMÁCIA DA UNIVERSIDADE DE LISBOA  ciclo de Krebs : ocorre na matriz mitocondrial. A molécula de acetil-CoA sofre um conjunto de reacções (descarboxilação e redução de FAD em FADH2 e de NAD+ em NADH). O NADH e o FADH2 vão servir de transportadores de electrões na fosforilação oxidativa pois são coenzimas muito energéticas. Nesta fase formam-se apenas duas moléculas de ATP.  fosforilação oxidativa: formação de ATP por transferência de electrões, ao longo de uma cadeia respiratória, ocorrendo reacções redox. Os dadores de electrões são as moléculas de NADH e FADH2 e o aceptor final é o O2. Ao receber electrões o oxigénio é reduzido e forma duas moléculas de H2O 56  FACULDA