Ronéo 2 LAS - Cours de Biologie, Biochimie et Métiers de la Santé - PDF

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 SOCLE COMMUN UE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Matière Titre du cours Date Professeur Cours vu Biologie 01- GÉNÉRALITÉS SUR LA CELLULE 02/10 Pr.Oudar cellulaire 02- TECHNIQUES D’ÉTUDES 02/10 Pr.Oudar Biochimie 01- POLYSACCHARIDES 05/10 Pr. Gardano UE SHS Matière Titre du cours Date Professeur Cours vu Histoire des Pr.Vassy Sciences de la 01- SCIENCES ET MÉDECINE 05/10 Médecine UE MÉTIERS DE LA SANTÉ Matière Titre du cours Date Professeur Cours vu 01- GÉNÉRALITÉS ANATOMIQUES 03/10 Pr. Dumas Anatomie 02- GÉNÉRALITÉS SUR L’OSTÉOLOGIE 03/10 Pr. Dumas ET L’ARTHROLOGIE 03- GÉNÉRALITÉS EN ARTHROLOGIE 03/10 Pr. Dumas ET MYOLOGIE  SOCLE COMMUN  UE BIOLOGIE – SOCLE COMMUN Biologie Cellulaire 01 - Généralités sur la cellule Points clés ❖ Les valeurs numériques sont à apprendre. ❖ Savoir comparer la taille de différents éléments (plus grand/plus petit) ❖ Les dates sont à connaître et faire attention à pouvoir les situer en siècle. ❖ Certaines notions seront approfondies au fur et à mesure des cours donc ne pas s’inquiéter si certaines choses vous paraissent encore vagues. Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny PLAN DU COURS I. Généralités sur la cellule comme unité du vivant, la théorie cellulaire A. Chronologie II. Généralités sur les ordres de grandeurs en Biologie III. Deux types d’organisation cellulaire : les eucaryotes et les procaryotes A. Organisation de la cellule procaryote B. Organisation de la cellule eucaryote Université 2 sur 10 Sorbonne Paris Nord  Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny I. GÉNÉRALITÉS SUR LA CELLULE COMME UNITÉ DU VIVANT – LA THEORIE CELLULAIRE A. Chronologie Date Chercheur Découverte ♦ Introduit la notion de cellule. ♦ Microscopiste qui cherchait à savoir pourquoi les bouchons étaient efficaces ♦ Observation de tranche de bouchon de liège très fine grâce à un microscope qui Robert Hooke 1665 venait d’être fabriqué. (1635-1703) ➔ Obtention d’une image en nid d’abeille qui lui a rappelé la structure que pouvaient avoir les cellules occupées par les moines à l’époque dans les monastères. ➔ Invention de la terminologie “cellule”. 1675 / ♦ Invention du microscope Schleiden (1804-1881) & ♦ Proposent 2 principes : 1830 ① Tous les organismes sont constitués d’une ou plusieurs cellules. Schwann ② « La cellule est l’unité structurale et fonctionnelle des plantes et des animaux ». (1810-1882) Rudolf Ludwig ♦ Propose un 3ème principe : 1855 Karl Virchow ③ « Une cellule ne peut provenir que de la division d’une cellule déjà existante ». (1821-1902) → Il met alors à mal la théorie de la génération spontanée. ♦ Fabrication des lentilles qui ont permis au microscope optique d’améliorer sa résolution. 1886 Karl Zeiss ème ♦ D’où la possibilité à la fin du XIX siècle de faire de la description de cellules et (1816-1888) de tissus en microscopie optique 1850 à ♦ Amélioration des outils et des techniques de préparation, de coloration, de mise 1900 / en évidence des structures en microscopie optique. C’est l’âge d’or de ce domaine. ♦ En même temps que l’outil s’est amélioré, il y a une amélioration des techniques de coloration qui permettaient d’observer des tissus biologiques. Golgi (1843- ♦ Naturellement, à part quelques exceptions, le tissu biologique n’est pas coloré. Il 1926) faut donc pour pouvoir les observer au microscope, que ceci soit manipulé avec un certain nombre de colorations spécifiques. Fin XIXe et Cajal Golgi et Cajal ont mis au point la technique d’imprégnation à l’argent qui permet (1852-1934), ♦ de mettre en évidence de nombreuses structures à l’intérieur même des cellules (naturellement non observables) : appareil de Golgi. prix Nobel en En particulier Santiago Ramon y Cajal a permis la description d’un certain nombre 1906 ♦ de structures au niveau du cerveau, notamment les neurones. ♦ Mise au point du microscope à contraste de phase 1930 / ➔ Permet d’observer des cellules vivantes. Université 3 sur 10 Sorbonne Paris Nord  Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny I. GÉNÉRALITÉS SUR LA CELLULE COMME UNITÉ DU VIVANT – LA THEORIE CELLULAIRE A. Chronologie (suite) Date Chercheur Découverte ♦ Construction du premier microscope électronique à transmission (MET). ➔ Amélioration de la résolution ➔ A permis une description des cellules et des tissus qui ont permis de répondre à de nombreuses questions posées à cette époque là à propos de la 1931 / biologie cellulaire. ♦ Les premières publications de descriptions de la cellule ne sortiront qu’en 1945. ♦ Mise en place de la réaction Antigène/Anticorps encore utilisée de nos jours, celle- 1941 A.H. Coons ci permet la localisation des molécules au sein des tissus, c’est l’immunofluorescence. ♦ Mise au point du microscope confocal. 1988 / ➔ Permet d’observer les cellules avec des résolutions bien meilleures que lesprécédents microscopes optiques. ♦ Les connaissances que nous avons aujourd’hui dans le domaine de la biologie cellulaire sont directement liées aux techniques et aux outils qui ont été De nos développés en parallèle et qui ont permis d’avoir des informations nouvelles et / jours ♦ régulières sur l’organisation des cellules et leur fonctionnement. Mise en évidence de nouveaux microscopes en particulier les microscopes à effet tunnel, les microfaisceaux laser.  Il faut connaître les possibilités et les limites de l’outil pour connaître les bons résultats Université 4 sur 10 Sorbonne Paris Nord  Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny II. GÉNÉRALITÉS SUR LES ORDRES DE GRANDEURS EN BIOLOGIE Outil permettant la Échelle Élément biologique visualisation ♦ Neurones : Dans l’organisme, les cellules les plus longues sont certains neurones moteurs. o Peuvent avoir des prolongements (=Axones) qui peuvent Mètre (m) aller jusqu’à 1 mètre de longueur ou plusieurs dizaines de Œil nu centimètres. o Ce sont les cellules humaines les plus longues. ♦ Cellules musculaires striées squelettiques : Cellules Centimètre multinucléées = jusqu’à 15 cm de long voir un peu plus (dépend (cm) du muscle) ♦ Ovocyte : gamète femelle qui est une cellule mononuclée = 100 Micromètre µm = 0,1 mm (µm) ♦ Adipocytes : Cellules chargées de stocker les lipides = jusqu’à 80 µm Majorité des cellules chez l’Homme = 10-30 µm de diamètre ♦ Globule Rouge (GR) = 7 µm de diamètre, peut servir de repère Micromètre car taille des GR assez constante. Utilisé comme repère par les Microscope optique (µm) anatomopathologistes. ♦ Noyau = 4-5 µm (variable selon les types cellulaires)  Les éléments en microns et en nano sont de l’ordre de « l’infra cellulaire ». ♦ Mitochondrie : Jusqu’à 3 µm. De l’ordre du µm ou légèrement inférieur. Lysosomes : contiennent des enzymes responsables de la Micromètre dégradation à l’intérieur des cellules. Leur diamètre est en (µm) moyenne de 0,1 µm et peut atteindre plusieurs µm en fonction du type de cellule (plus gros dans les macrophages, jusqu’à Microscopie électronique plusieurs microns en fonction des cellules) ♦ Ribosomes : 10aine de nm. Nanomètre ♦ Épaisseur de la membrane plasmique : 7,5 nm. (nm) ♦ Molécule ♦ Atome Angström ♦ L’Angström correspond à 10-10 m Université 5 sur 10 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny II. GÉNÉRALITÉS SUR LES ORDRES DE GRANDEURS EN BIOLOGIE Outils pour observer Il faut des outils adaptés pour observer en biologie cellulaire o Certains éléments peuvent s’observer à l’œil nu (ce qui est en rouge sur l’image) o Pour les éléments un peu plus petits (en vert sur l’image), il faut un microscope optique o Pour les plus petits éléments (en violet), il faut utiliser un microscope électronique. Université 6 sur 10 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRE : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES ♦ Dans le monde du vivant, il existe deux types d’organisation cellulaire : o Les procaryotes (sans noyau) = Bactéries, certains virus o Les eucaryotes (avec noyau) Au cours de l’évolution est apparue une structure appelée membrane qui différencie les procaryotes (sans noyau) des eucaryotes (qui possèdent un noyau) III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRES : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES A. Organisation de la cellule procaryote ♦ Organisme vivant possédant de l’information génétique, en général de l’ADN circulaire, non délimité par définition par une membrane. ♦ Relativement simple en comparaison des cellules eucaryotes. ♦ L’information génétique des procaryotes est située dans une zone appelée nucléoïde. ♦ Possède une membrane, potentiellement une paroi en fonction des bactéries. ♦ De plus, suivant le type de bactérie, elle peut présenter des excroissances telles que des flagelles qui lui permettent de se mouvoir ou encore des pillis. ♦ Possèdent en général des métabolismes autonomes qui leur permettent de produire de l’énergie et de se reproduire. ♦ Leur forme (forme de bâtonnet, sphérique…) est assez variable et est fonction de la bactérie étudiée. ♦ On a ci-dessous une photo de bactérie allongée, obtenu grâce à la microscopie électronique. ♦ On peut y observer de l’ADN (nucléoïde bactérien), des petites granulations (ribosomes) et tout autour une paroi relativement épaisse apparaissant en foncé sur cette photographie. Université 7 sur 10 Sorbonne Paris Nord  Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRES : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES B. Organisation de la cellule eucaryote (avec noyau) ♦ Structure beaucoup plus complexe que celle de la cellule procaryote. ♦ Entouré par une membrane plasmique qui d’une certaine manière isole l’intérieur d’une cellule de son environnement. ♦ La membrane sert non seulement à isoler la cellule de l’extérieur mais elle a aussi des activités physiologiques importantes permettant des échanges avec le milieu extérieur par des mécanismes particuliers qui lui sont propres ou par des changements de sa forme via : o L’endocytose (= perte de membrane) : entrée des différentes molécules et matériaux o L’exocytose (= gain de membrane) : sortie des molécules vers l’extra-cellulaire. ♦ La membrane plasmique permet un certain nombre d’interactions avec le milieu environnant en formant : ♦ Des jonctions entre cellules ou directement avec ce qui l’entoure (MEC (cours ultérieur)). ♦ Ces jonctions permettent aux cellules d’adhérer entre elles mais également de communiquer. ♦ L’intérieur de la cellule est composé de plusieurs de types d’organites détaillés ci-dessous. ♦ L’une de ses particularités est qu’il est entouré d’une enveloppe elle-même constituée de deux membranes (constituants similaires à ceux de la membrane plasmique), protégeant d’une certaine manière le matériel génétique sous forme d’ADN. ♦ L’apparition de cette enveloppe au cours de l’évolution autour du matériel génétique a permis de diviser le monde vivant en deux grands types d’organisations (les procaryotes ♦ et les eucaryotes). Contient le matériel génétique sous forme d’ADN. Cet ADN est lui- Le noyau même sous forme de chromatine dans une cellule qui n’est pas en division. Il existe deux types de chromatine : o L’hétérochromatine, dense en électrons, apparaît noire en microscopie électronique. o L’euchromatine, apparaît très claire en microscopie électronique ♦ On y retrouve également le nucléole qui correspond à la mise en commun de partie de certaines molécules d’ADN de certains chromosomes. ♦ Sorte de gel qui contient de très nombreuses inclusions cytoplasmiques, parmi Le cytoplasme lesquelles on peut citer les réserves sous forme de sucres (ex : Glycogène), ou encore des protéines (qui constituent le cytosquelette vu dans un cours ultérieur) Les ♦ Elles sont entourées d’une double membrane et ayant pour principal fonction la mitochondries production d’énergie. ♦ Il peut prendre deux aspects : ① Recouvert de ribosomes = Réticulum endoplasmique rugueux (REG), impliqué dans la synthèse des protéines et en continuité avec l’enveloppe nucléaire. Le réticulum ② Absence de ribosome à sa surface = Réticulum endoplasmique lisse (REL), rôle plutôt dans la synthèse des lipides.  CES DEUX RÉTICULUMS PEUVENT ÊTRE EN CONTINUITÉ. ♦ Structure sous forme de sacs plus ou moins empilés (nombre de sac variable selon le type cellulaire). L’appareil de ♦ Intervient dans la maturation des protéines synthétisées dans le réticulum Golgi endoplasmique rugueux : Donc un certain nombre de protéines vont être modifié au cours de leur passage dans l’appareil de golgi Les vacuoles ♦ Volumineuses dans les cellules végétales, plus petites dans les cellules animales. Université 8 sur 10 Sorbonne Paris Nord  Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny III. DEUX TYPES D’ORGANISATION CELLULAIRES : LES EUCARYOTES ET LES PROCARYOTES B. Organisation de la cellule eucaryote (avec noyau) : suite ♦ Sac dans les cellules qui contiennent des enzymes qui permettent de dégrader le matériel en provenance de l’extérieur (recyclage ou élimination d’éléments étrangers). Les lysosomes ♦ Permettent également d’éliminer des produits de la cellule elle-même = mécanisme d’autophagie. L’autophagie concerne les structures en fin de vie ou défectueuses. B. Organisation de la cellule eucaryote (avec noyau) Schéma d’une cellule eucaryote ♦ Ci-dessus (à droite), est représentée une photo en microscopie électronique d’une cellule eucaryote animale. ♦ On repère bien à l’intérieur de cette cellule, en très foncé, le nucléus = le noyau ♦ On voit les petites vésicules comme les lysosomes ♦ On peut observer des empilements de saccules qui correspondent à l’appareil de Golgi ♦ Tout cela étant entouré par la membrane plasmique ♦ Nous voyons également un certain nombre de mitochondries qui sont caractéristiques avec leur double membranes et surtout l’apparition de crêtes à l’intérieur de la mitochondrie. ♦ Enfin, il existe dans la cellule des structures qui correspondent à des éléments du cytosquelette (que nous reverrons) comme les centrioles. Le centriole est à l’origine des éléments du cytosquelette. Université 9 sur 10 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 01 - Généralités sur la cellule Santé Bobigny Université 10 sur 10 Sorbonne Paris Nord  UE BIOLOGIE – SOCLE COMMUN Biologie cellulaire 02 – TECHNIQUES D’ÉTUDE DE BIOLOGIE CELLULAIRE Points clés v La définition du pouvoir de résolution v Les différents échantillons utilisables v Les structures des différents microscopes et leurs utilisations (surtout le MO et le MET) v Les principes et les applications des différentes techniques non morphologiques Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire PLAN DU COURS I. Techniques morphologiques A. Introduction B. Les microscopes C. Etude in situ des constituants biochimiques II. Techniques non morphologiques A. Cytométrie de flux B. Fragmentation subcellulaire par centrifugation différentielle C. Fabrication d’anticorps monoclonaux D. ELISA E. Chromatographie F. Electrophorèse G. Autres techniques Université 2 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire I. Techniques morphologiques A. Introduction Cellules invisibles à l'œil nu. Apparition de la nécessité d’un certain nombre Début de la d’outils permettant l’observation de microscopie l’infiniment petit. Mise au point des premiers microscopes : optiques ou photoniques puis microscopie électronique Définition : Plus petite distance observable entre 2 points sans qu’ils puissent être confondus. Ainsi, plus D est petit, plus le microscope est puissant. Doeil= 0,2mm Formule : Le pouvoir de résolution (D) N = Indice de réfraction du milieu, entre la préparation et l’objectif (ex : N=1 pour l’air, N=1.5 pour l’huile) λ (lambda) = Longueur d’onde du faisceau α (alpha) = Moitié de l’angle du cône de lumière qui entre dans l’objectif (meilleur angle pour α = 70°) Permettent d’observer des cellules et des tissus : préparation indispensable pour observer dans des conditions qui doivent être les plus proches de celles du Technique vivant. morphologique Nécessité de développer des techniques de préparation des cellules et des tissus : préparation indispensable à leur observation. => Appellation : Imagerie cellulaire Université 3 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire I.Techniques morphologiques B. Les microscopes 1. Microscopie optique ou microscopie photonique Cellules vivantes (ex vivo ou in vivo) : Culture de cellules dans des boîtes de pétri ou dans des tubes. Incubation à 37°, dans une atmosphère humidifiée (5% de CO2), dans des milieux de culture adaptés à chaque type de cellule, en présence de nutriments spécifiques ou de facteurs de croissance. Échantillons cellulaires Ces échantillons sont obtenus auprès de cliniciens : en consultation ou auprès d’un patient hospitalisé ou patient au bloc opératoire o Liquide biologique (sang, moelle hématopoïétique, LCR, urines) o Liquide pathologique (épanchement dans la plèvre, le péritoine, une articulation...) o Liquide d’exploration (lavage broncho alvéolaire...) o Brossage ou grattage (frottis vaginal) Les différents échantillons Étalement cellulaire sur lame o On dépose une goutte de sang, que l’on étale avec une lamelle pour obtenir une unique couche de cellule (ex: frottis sanguin) puis visualisation au microscope. o Possibilité de partir de suspensions cellulaires si la concentration cellulaire n’est pas trop grande. On dépose cette concentration cellulaire. Ensuite utilisation de l’évaporation : après avoir déposé une goutte on attend que cela sèche. Échantillons tissulaires o Biopsies faites lors d’opération ou de prélèvement pour des raisons de diagnostic, il peut s’agir d’organe entier (ex : ganglions), résection. Université 4 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire 1. Microscopie optique ou microscopie photonique Étalement tissulaire ♦ 2 possibilités pour la fixation : o 1ère possibilité (rapide) : 1) Congélation de la biopsie : azote liquide à -196°C en présence de cryoprotecteurs ( limite la formation de cristaux de glace qui peuvent endommager les cellules) 2) Puis, coupe au cryostat : enceinte réfrigérée à -20/-30°C contenant des microtomes permettant d’obtenir des coupes de 5 à 10 µm 3) Fixation et coloration o 2ème possibilité (plus longue) : 1) Utilisation de fixateurs chimiques (aldéhydes : formaldéhyde = formol, glutaraldéhyde, osmium) pour observer des cellules proches de l’état naturel : conservation plus longue et obtention de coupes plus fines (5µm) observables au microscope optique. Même principe pour le microscope électronique, seules les substances d’enrobage et les outils vont différer. Comme l’observation se fait à une échelle plus petite, la fixation doit être plus importante (utilisation d’un mélange de formaldéhyde et de glutaraldéhyde) 2) Puis, déshydratation, inclusion en paraffine liquide à 55-60°C (MO), en résine plastique (MET) 3) Refroidissement puis coupe avec microtome (microscope optique) ou ultra-microtome (microscope électronique) ♦ Le but étant ainsi d’immobiliser les structures cellulaires dans une organisation aussi proche possible de l’état avant prélèvement, de leur vivant. Université 5 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire 1. Microscopie optique ou microscopie photonique Le microscope optique Source lumineuse : photons Principe : Faisceaux de photons traverse plusieurs lentilles de verres : o Le condenseur, o L’objectif (grossissement x25, Compositions / x40,x100), Principe o L’oculaire (grossissement x10) En tout on a donc un grossissement de l’image de l’ordre de 400x Un appareil de capture d’image pour faire des photos et pouvoir stocker des informations. Déshydratation et inclusion en paraffine à chaud. La paraffine va entrer dans les tissus et remplacer l’eau et les différents solvants, refroidissement à une température de laboratoire (20°-25° voire moins) puis durcissement Préparation Coupe 5 µm Nécessité d’utiliser une préparation fine, quasiment transparente et d’augmenter les contrastes par une coloration (éosine, hémalun) Pouvoir de résolution : D= 0,2 μm Observation : forme de la cellule, du noyau et de certaines structures à l’intérieur Résultats (mais pas aussi bien que le MET) Université 6 sur 24 Sorbonne Paris Nord  Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire B. Les microscopes 2. Microscopie électronique Microscope électronique à transmission (MET) Source lumineuse : électrons. (Beaucoup plus pénétrant que les photons) Principe : Faisceau d’électrons traverse des lentilles électromagnétiques Vide extrêmement poussé à l’intérieur du microscope pour éviter toutes les déviations La moindre molécule de gaz dans la Composition / colonne du microscope pourrait modifier Principe l’axe du faisceau et empêcherait l’obtention d’une image de grande netteté Électrons arrivent dans toutes les directionset sont canalisés par un condenseur L’observation se fait sur un écran phosphorescent. Tension de 40 à 100 kVolt Échantillon fixé et mort Déshydratation et inclusion en résine plastique de type époxyaraldite (se polymérisent à 60°C) Préparation Coupe ultramince, 50 nm (à l’aide de couteau en diamant) Dépôt sur une grille de cuivre ou platine (2mm de diamètre) Utilisation d’agents contrastants : métaux lourds (acétate d’uranile, citrate de plomb Pouvoir de résolution : D=0,1 à 0,2 nm. Observations : o Image obtenue en noir et blanc Résultats o Grossissement de 30 000, 50 000 voire 100 000 x o Permet d’observer des structures infra cellulaires Université 7 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire B. Les microscopes 2. Microscopie électronique Microscope électronique à balayage (MEB) Source lumineuse : électrons Principe : o Faisceau d’électrons frappe la surface de l’échantillon qui va renvoyer des électrons car il est recouvert Compositions / de métal. Principe o Les électrons arrivent sur un détecteur à scintillation. o Le signal est ensuite amplifié par un photomultiplicateur. Tension entre 1 et 40 kV Échantillon doit être fixé et mort Préparation Pas de coupe Échantillon entier recouvert de métaux (carbone, or, platine) Observation : o Obtention d’image en relief, Résultats o Permet d’étudier la surface des objets, o Formes des cellules et des tissus o Observation allant de particules à des petits insectes (organisme entier) Université 8 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire B. Les microscopes 3. Microscope à contraste de phase Principe : Les différentes structures que l’on trouve dans une cellule vont dévier les ondes de manière différente. Si lorsque le faisceau traverse l’objet, les ondes sont déviées de la même manière, il y a augmentation de la brillance (les ondes sont en phase) Si lorsque le faisceau traverse l’objet, les ondes sont déviées de manière différente : il y a diminution de la brillance. Quand les ondes lumineuses traversent des objets ayant une certaine consistance, leur amplitude est diminuée, c’est ce qui crée l’image. Objet moins dense : amplitude peu changée mais phase modifiée, ce qui crée des interférences. Effets des interférences exploitées pour créer l’image. Compositions / Principe Préparation Aucune (ni coupe, ni fixation, ni coloration) Observation : organites et cellules en mouvement, division et Résultats même d’organismes vivants, Inconvénient : moins de contraste que les autres microscopes Université 9 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire B. Les microscopes 4. Microscope à fluorescence 2 Sources lumineuses : une lampe halogène et une lampe à arc (lampe à vapeur de mercure) qui permet d’exciter les fluorochromes Principe : o Permet de détecter des molécules fluorescentes qui ont la propriété d’absorber la lumière à une certaine longueur d’onde (λ1) pour restituer une lumière à une autre longueur d’onde supérieur (λ2). 2 filtres : o Filtre d’excitation (dont la longueur d’onde d'absorption est la même que la longueur d’onde de la molécule fluorescente), va sélectionner une seule longueur d’onde o Filtre d’arrêt qui laisse passer la lumière émise par la molécule Compositions / fluorescente qui a été excitée par la lumière Principe Nécessite un trajet optique avec différentes lentilles, prismes, cubes de fluorescence, objectifs, oculaires, capteurs CCD… Préparation Marquage avec des molécules fluorescentes : o Fluorescéine (absorbe dans le bleu et émet dans le jaune/vert) o Rhodamine (absorbe dans le vert et émet dans le rouge) Observation : o Peu détaillée et pas très bonne netteté (améliorée par déconvolution). o Localisation de molécules marquées grâce à la fluorescence (fond noir) Résultat o Non utilisé pour observer l’aspect général de la cellule Avantage : Prise en main facile rapide, acquisition d’image rapide Inconvénient : Microscope plus volumineux que les MO classiques Université 10 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire B. Les microscopes 5. Microscope confocal (1988) Source lumineuse : laser Principe : o Même principe que pour le microscope à fluorescence classique. o Microscope à fluorescence (marquage par des fluorochromes) avec faisceau laser qui stimule la fluorescence. o Réalise lui-même des coupes optiques qui grâce à un travail sur ordinateur permettront la visualisation d’image 3D Compositions / Principe Les échantillons peuvent être plus épais que dans la Préparation microscopie àfluorescence classique. Observations : o Localisation des molécules et netteté plus précises des molécules marquées Résultats o Images vues en 3D o Images obtenues dans un troisième plan (Z série). o Microscope confocal = microtome optique pouvant permettre de déterminer si une molécule est dans la cellule et non sur la membrane plasmique. Université 11 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire I. Techniques morphologiques C. Études in situ de constituants biochimiques Principe : o Localisation et détection de différents constituants des cellules ou des tissus (lipides, protéines, acides nucléiques …) à l’aide de L’histochimie réactions chimiques dans les cellules permettant la coloration de molécules : o PAS (Acide périodique/ réaction de Schiff, pour mettre en évidence des résidus glucidiques) o Feulgen-Rossenbeck (mise en évidence de molécules d’ADN) Principe : o Localisation des enzymes par réaction enzymatique (coloration) o Technique en deux temps : 1) Incubation de la coupe (cellules, tissus) avec le substrat de l’enzyme à détecter 2) Révélation du produit de la réaction enzymatique o L’enzyme recherchée est trouvée par son action sur un substrat (injecté au cours de l’expérience) qu’elle va transformer en un produit coloré visible si elle est présente Exemple : o Peroxydase (enzyme) + DAB diaminobenzidine (substrat incolore) + H2O2 (catalyseurs) qui donne une coloration brune Mise en évidence d’activités : o Peroxydasique dans le foie L’histoenzymologie o Tyrosinase dans les mélanocytes o ATPase dans les cellules musculaire o Phosphatase acide dans les lysosomes Résultat : o Observation au MO o DAB est dense aux électrons donc possibilité d’observation au MET Université 12 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire I. Techniques morphologiques C. Études in situ de constituants biochimiques (suite) Localisation de molécules antigéniques (protéines, glycoprotéines surtout, pas trop les lipides et les glucides car ils sont peu antigéniques) par réaction/interaction antigène-anticorps directe ou indirecte : o Directe : anticorps couplé à objet visible, comme le fluorochrome (MO) ou à des billes d’or colloïdales (MET) o Indirecte : Un anticorps primaire reconnait l’antigène et plusieurs anticorps secondaires (provenant d’une autre espèce que le premier anticorps), couplé à un marqueur, reconnaissent L’immunohistologie l’anticorps initial pour amplifier. Le second anticorps doit être capable de reconnaître le premier anticorps. è Utilisé si antigènes en quantité peu importante, permet l’amplification du signal. On utilise des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés spécifiquement contre l’antigène recherché. Marquage possible : o Fluorochrome : fluorescéine (Microscope à fluorescence) o Enzyme peroxydase, phosphatase alcaline, même principe que l’histoenzymologie (MO/MET). Enzyme accrochée à son anticorps lui-même accroché à son antigène. On lui donne un substrat. Si l’enzyme est présente et à l’endroit où elle sera présente, cela va transformer le substrat en un produit coloré et que l’on peut observer. o Billes d’or colloïdales (MO/MET) Toutes ces techniques peuvent se faire sur des coupes au cryostat, voire au cryomicrotome (ME), des coupes en paraffine, des blocs avant inclusion standard, des coupes ultrafines après inclusion sur des résines hydrosolubles (MET). Choix de la technique dépend de l’antigène, de sa localisation, de la quantité d’antigène présent dans une cellule Université 13 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire I. Techniques morphologiques C. Études in situ de constituants biochimiques (suite) Principe : o Localisation d’acides nucléiques à l’aide de l'hybridation de la séquence recherchée, avec une sonde complémentaire d’acide nucléique simple brin marqué. o Basé sur l’affinité que peuvent avoir des chaînes d’acides nucléiques lors d’une réaction d’hybridation. o Principe identique à celui de la réaction antigène/anticorps, mais l’outil utilisé est une sonde complémentaire de l’acide nucléique recherché. o Hybridation ADN/ADN; ADN/ARN ou ARN/ARN Différents types de sondes : o ADN bicaténaire, ARN monocaténaire, oligonucléotide: petites séquences obtenues par synthèse (ADN ou ARN). o Sonde chaude : utilisation d’isotopes pour marquer la sonde o Sondes froides : utilisation de fluorochrome ou biotine avidine (+ utilisé car moins coûteux et + facile à Hybridation in situ utiliser) § On utilise plutôt des sondes froides pour des raisons de coût et de facilité d’emploi. Exemple : o Mise en évidence du gène qui code pour la protéine calbindin 28k (qui fixe le calcium) dans les neurones de Purkinje du cerebellum (cervelet) d’un cerveau de rat adulte Résultat : o Informations sur l’expression des gènes. Recherche d’ARN messager. Possibilité de coupler cette technique avec de l’immunohistochimie pour mettre en évidence en même temps une protéine et son ARN messager o Mise en évidence de la présence de gènes dans les tissus. Université 14 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire I. Techniques morphologiques C. Études in situ de constituants biochimiques (suite) Principe : o Suivi dans le temps de macromolécules à l’intérieur d’une cellule grâce à des précurseurs radioactifs. Si les précurseurs rentrent dans la constitution des protéines, quand la protéine sera créée,le précurseur sera incorporé dans la protéine qui deviendra radioactive. o Incubation d’un tissu avec une molécule radioactive. o L’échantillon est ensuite plongé dans une émulsion photographique (durant quelques jours à quelques semaines) et révélé à l’abri de la lumière. Autoradiographie o Observation de grains d’argent réduits, argent métallique, sous la forme de points noirs. Résultat : détection et visualisation de la radioactivité introduite au sein de cellules ou de tissus au MO ou au MET Exemple : mise en évidence sur une cellule synaptique d’un neurotransmetteur présent dans une fente synaptique. A retenir : - La définition du pouvoir de résolution - Les différents échantillons utilisables - La structure du microscope optique et son utilisation - La structure du microscope électronique (MET et MEB) - Les différents microscopes (fluorescence et contraste de phase) - Les différentes techniques d’étude in situ des constituants biologiques Université 15 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques A. Cytométrie de flux (FACS) Objectif : Fait défiler à grande vitesse des cellules marquées avec des anticorps fluorescents afin de les différencier, de les trier et de les compter. Les anticorps reconnaîtront surtout des antigènes de surface, mais pas uniquement. La détection des molécules fluorescentes se fait à travers des pipettes, dans lesquelles les cellules passent une à une. Fonctionnement Principe : o On va utiliser des anticorps couplés à des fluorochromes qui vont reconnaitre soit un antigène intracellulaire, soit un antigène membranaire o Un laser va venir exciter les fluorochromes des cellules marquées qui, elles, sont en suspension dans une gaine liquide d’entrainement. o Un dispositif permet de trier les cellules en fonction de la fluorescence : elles passent une par une pour être triées (ex : rouge, verte, bleu, etc.) Ce dispositif permet de dénombrer et de réaliser un tri cellulaire des molécules présentes dans ou en surface de la cellule sans pour autant détecter sa localisation ! On peut également avoir une idée de la quantification d’ADN. On l’utilise pour : o Typage des leucémies o Numération des sous populations lymphocytaires du sang o Formule automatique du lavage broncho-alvéolaire o Cycle cellulaire et ploïdie des tumeurs C’est donc une technique utilisée en pathologie mais aussi en laboratoire pour la recherche, notamment en hématologie pour le typage de leucémies (métabolisme cellulaire...). On peut aussi faire des numérations des populations lymphocytaires. Résultats Sur cette image on peut voir une mesure du nombre de quantité d’ADN avec un 1er pic avec des cellules avec 1 seule quantité d’ADN et un 2èmepic avec le double de cette quantité, qui peut permettre l’étude du cycle cellulaire, afin de détecter la présence d’aneuploïdies. Ici, on peut quantifier grâce à l’intensité de la fluorescence. C’est un moyen facile de faire de la quantification de cellules et de le rapporter à la quantité d’ADN. Université 16 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques B. Fragmentation subcellulaire par centrifugation différentielle Objectif : Permet d’isoler les différents constituants à l’intérieur d’une cellule, par un système de centrifugations successives d’un broyât de cellules. Principe : Réalisation d’une série de centrifugation o A chaque centrifugation : on récupère le culot avec les différents constituants obtenus et on soumet de nouveau le surnageant à une centrifugation o Vitesse donnée en g (accélération de la pesanteur) : 10 minutes à 1000g pour obtenir surnageant et culot, puis 20 min à 20 000g puis 60 min à 80 000g o Plus le temps et la vitesse seront augmentés et plus les organites seront sédimentés dans le culot. Voici un schéma des différentes centrifugations réalisées : Fonctionnement Utilisation des différents culots pour étudier les fonctions Résultats des différents constituants de la cellule (ex : test biochimique) Université 17 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques C. Fabrication d’anticorps monoclonaux Cette fabrication se fait en plusieurs étapes : ❶ Immunisation de souris saines par différents antigènes puis récupération de la rate de celles-ci pour en extraire les lymphocytes B (LB) et parallèlement : prélèvements de cellules malades chez une souris atteinte de myélome. On met ces cellules en culture. ❷ Réalisation de fusions cellulaires multiples dont la plus intéressante : entre LB et cellules myélomateuses, car on va avoir une production d’anticorps suite au contact avec ces cellules de myélome. ❸ Sélection des clones qui nous intéressent à savoir ceux pour lesquels on a une production de l’anticorps recherché ❹ Amplification des clones sélectionnés ❺ Pour finir on va : Fonctionnement o Soit injecter en intra péritonéal ces cellules clonales chez des souris puis récupérer le sérum (ex : liquide d’ascite) o Soit récupérer directement les anticorps produits par les cellules et clones sélectionnés Université 18 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques D. ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) C’est un test immuno-enzymatique par réaction antigène-anticorps colorée produite par l’action sur un substrat d’une enzyme préalablement fixée à un anticorps secondaire. On réalise ces expériences dans des petits puits de type boîte de culture. Principe : Il existe 2 méthodes différentes : Œ ELISA indirecte pour la recherche/le dosage d’un anticorps : 1. Un antigène spécifique de l’anticorps est mis au fond des puits. On lave bien avant. 2. On va déposer au même endroit l’échantillon avec l’anticorps recherché, à savoir l’anticorps à doser : s’il est bien présent, il y aura liaison avec l’antigène du puit. 3. Un 2ème anticorps cette fois-ci, lié à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré, est mis dans le puit afin d’aller se lier avec l’anticorps présent. 4. Quantification par colorimétrie, avec un spectrophotomètre.  ELISA sandwich pour la recherche/le dosage d’un Fonctionnement antigène 1. Un anticorps spécifique de l’antigène est mis au fond des puits 2. On va déposer au même endroit l’échantillon avec l’antigène que l’on cherche à doser : s’il est bien présent, il y aura liaison avec l’anticorps du puit. 3. Un 2ème anticorps cette fois-ci, lié à une enzyme catalysant la formation d’un produit coloré, est mis dans le puit afin d’aller se lier avec l’antigène présent. 4. Quantification avec un spectrophotomètre. La coloration sera proportionnelle à la quantité d’antigène présent. Université 19 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques D. ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) (suite) Dosage anticorps/antigènes, permet de déterminer les concentrations sériques Possibilité de réaliser une gamme étalon dans laquelle on a dilué l’antigène / l’anticorps recherché de manière à avoir une information quantitative. Exemples d’application : on peut identifier des sérums de patients, les anticorps anti-protéine de l’enveloppe du virus du VIH peuvent être mis en évidence… Avantages : Résultats o Utilisation d’anticorps monoclonaux qui rendent la détection spécifique. o Quantification : gamme étalon. o L’utilisation d’anticorps secondaires rend la technique très sensible (faible quantité d’antigènes/anticorps). o Facilement accessible aux biologistes. o Détection du signal uniquement avec un spectrophotomètre Inconvénients : o Limite de détection : difficile de mettre en évidence une très faible quantité d’antigènes ou d'anticorps. o Réaction enzymatique : rend la technique dépendante d’un certain nombre de facteurs. La réaction enzymatique dépend de la température, du pH… Université 20 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques E. La chromatographie Séparation d’un mélange de protéines à travers une colonne constituée de 2 phases : une mobile (liquide et mélange de molécules) et une fixe (papier, gel, cellulose...) : cela permet la purification d’une molécule. Principe : o Dépôt d’un mélange de protéines au sommet d’une colonne contenant une matrice solide et perméable. o Ajout d’un solvant en continu par le dessus de la colonne, ce qui va entraîner le mélange protéique vers le bas de la colonne. o Les protéines du mélange migrent à des vitesses différentes (en fonction de la taille, de l’encombrement) ð Séparation des protéines. Récupération dans différents tubes. Fonctionnement o Des matrices sont utilisées pour séparer les protéines selon leur charge électrique, leur taille... Il en existe 2 types : Œ Chromatographie sur gel ou exclusion Ø Séparation des constituants du mélange sur une colonne remplie de billes poreuses (gel) : la séparation se fait uniquement en fonction de la taille !  Chromatographie d’affinité Ø Anticorps qui reconnaissent une protéine spécifiquement que l’on accroche dans la colonne. Quand on fait passer un mélange de protéines, elles vont être reconnues par l’anticorps et vont s’y attacher. Celles qui ne sont pas reconnues passent à travers et sont récupérées. Puis on lave et on a dans la colonne des anticorps sur lesquels sont fixées les protéines reconnues. Ø Fixation sur la phase fixe d’un constituant puis ajout d’une phase mobile avec laquelle le constituant a une certaine affinité : la séparation se fait uniquement en fonction de l’affinité ! Ø Exemple : anticorps-antigène Université 21 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques F. L’électrophorèse Celle-ci se fait en plusieurs étapes : 1. Dénaturation des protéines (purifiées auparavant par d’autres techniques) (perte de la structure tridimensionnelle) par chauffage avec du SDS, un détergent qui se fixe sur les protéines pour leur ajouter une charge négative + ajout d’un agent réducteur pour détruire les ponts disulfures. 2. On va déposer ces protéines (chargées négativement) en haut d’un gel de polyacrylamide. Passage d’un courant continu entre les extrémités du gel ce qui va faire migrer les cellules chargées négativement vers le pôle positif. La migration se fait aussi selon le poids moléculaire (les Fonctionnement plus petites migrent plus vite, tandis que celles de poids moléculaire plus élevé seront plus lentes). 3. Puis, soit : o Coloration au bleu de Coomassie pour rendre visible les protéines présentes dans l’échantillon. OU o Transfert sur une feuille de nitrocellulose avec ajout d’un anticorps marqué spécifique de l’antigène recherché = Technique de Western Blot. Marqueurs de taille dans un puit à part. On peut avoir unmélange de protéines de poids moléculaire connu. Par analogie, on trouve le poids moléculaire de chaque protéine, après destruction des ponts disulfures. Université 22 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire II. Techniques non morphologiques F. L’électrophorèse (suite) Illustration II. Techniques non morphologiques Radioactivité (détection et suivi du devenir de molécules d’ADN ou des protéines) Culture cellulaire (primaire ou secondaire) Fractionnement subcellulaire Biologie moléculaire : Techniques d’extraction, de purification, de détermination des séquences PCR, RT-PCR, protéiques et acides nucléiques Outils informatiques (recherche dans les bases de données de séquences de protéine ou d’acides nucléiques) ♦ Nécessité de mettre en œuvre plusieurs familles de techniques Université 23 sur 24 Sorbonne Paris Nord Biologie cellulaire Tutorat 02 – Techniques d’étude en Santé Bobigny biologie cellulaire A RETENIR ♦ Les principes des différentes techniques ♦ Les applications de ces différentes techniques Université 24 sur 24 Sorbonne Paris Nord  UE1 BIOLOGIE – SOCLE COMMUN BIOCHIMIE & BIOLOGIE MOLÉCULAIRE 05 – LES POLYSACCHARIDES Points clés Comprendre la structure des glucides ainsi que leurs rôles Connaître les voies métaboliques du glycogène et sa régulation Apprendre les glycoconjugués… Comprendre la nomenclature des disaccharides C’est une fiche qui peut paraître dense au premier abord mais une fois que vous l’avez vue plusieurs fois et que vous aurez compris les mécanismes abordés, elle sera nettement plus simple à vos yeux. Bon courage à vous et surtout ne lâchez rien !  Tutorat BIOCHIMIE Santé Bobigny 05 – Les polysaccharides PLAN DU COURS I. Introduction II. Formation des osides A. Liaisons entre les osides B. Disaccharides C. Polysaccharides III. Voies métaboliques du glycogène A. Glycogénolyse B. Glycogénogenèse C. Régulation IV. Glycoconjugués A. Glycosaminoglycanes (GAGs) B. Les différentes familles de glycoconjugués C. Protéoglycanes V. Les hétéropolysaccharides A. Polysaccharides Université Sorbonne Paris Nord 2 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny I. INTRODUCTION ♦ Les aldéhydes sont capables de s’oxyder avec la réduction d’un autre composé, ils ont donc un pouvoir réducteur. ♦ Les monosaccharides ou certains polysaccharides ont un pouvoir réducteur car ils sont capables de s’oxyder avec un acide avec la réduction d’un autre composé. ♦ Dans le cas représenté ci-dessous, on observe la réaction d'un aldéhyde avec la liqueur de Fehling. La liqueur est de couleur bleue car elle contient du Réaction des cuivre qui peut se réduire en oxyde de cuivre avec l’oxydation de l’aldéhyde. aldéhydes avec La solution change de couleur ce qui indique la présence d’un composant la liqueur de avec un pouvoir réducteur. Fehling ♦ Le groupe aldéhyde est capable de réagir avec le groupe alcool et dans le cas des glucides en forme linéaire, cette réaction est responsable de la cyclisation de la molécule monosaccharidique (glucose). Cyclisation du ♦ Le OH hémiacétal (entouré en glucose orange) maintient les propriétés (rappel) chimiques de l’aldéhyde donc la capacité à réduire la liqueur de Fehling et c’est pourquoi on dit que le glucopyranose et tous les autres monosaccharides possèdent un pouvoir réducteur. ♦ Alpha lorsque le OH est en bas. ♦ Bêta lorsque le OH est en haut. ♦ Tous les sucres mono ou polysaccharides qui possèdent un OH hémiacétal libre sont réducteurs.libre sont réducteurs. Université Sorbonne Paris Nord 3 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES A. LIAISONS ENTRE LES OSIDES ♦ La liaison osidique c’est la réaction entre un OH hémiacétal et le OH alcool présent sur une autre molécule. Si cet OH alcool, avec lequel le OH hémiacétal est capable de réagir, appartient à un autre glucide —> formation de la liaison osidique et donc l’union de deux glucides. ♦ Les osides se définissent par le fait que leur hydrolyse libère au moins 2 Classification molécules d'oses identiques ou différents. des osides ♦ Les oses ou dérivés d’oses sont liés entre eux par une liaison covalente qui est la liaison osidique. ♦ Disaccharides = 2 oses : Maltose, Lactose, Saccharose ♦ Oligosides = oligosaccharides : constitués de 3 à 10 oses.. ♦ Polyosides = polysaccharides : polymères constitués de plus de monosaccharides : amidon, glycogène, cellulose ♦ Homopolyosides : constitués d’un seul type d’ose → leur hydrolyse ne donne qu’un seul ose ♦ Hétéropolyosides : constitués de plusieurs oses différents →leur hydrolyse donne un mélange d’oses ou de dérivés d’oses ♦ Elle s’établit entre la fonction hémiacétal d’un ose et la fonction hémiacétal ou alcool d’un autre ose. Liaison O-osidique ♦ L’atome intermédiaire entre les 2 oses est un atome Liaisons d’oxygène. osidiques ♦ Elle s’établit entre la fonction hémiacétal d’un ose et une fonction amine d’un dérivé d’ose. Liaison N-osidique ♦ L’atome intermédiaire entre les 2 oses est alors un atome d’azote. Université Sorbonne Paris Nord 4 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES : LIAISONS ENTRE LES OSIDES NOMENCLATURE ♦ Nom et nature des constituants de l’oside ♦ Ex : L’alpha-D-Glucopyranosyl-1-6-D-glucopyranose est constitué de 2 molécules de glucose. Constituants de l’oside ♦ C’est donc un homo-disaccharides → homo car il est constitué du même ose : le glucose → disaccharides car il possède 2 glucoses ♦ Lorsqu’un ose engage son groupement Nature des hémiacétalique dans une liaison osidique,son anomérie fonctions est fixée. Éléments impliquées ♦ L’ose en question perd alors son caractère réducteur : caractérisant dans les liaisons on ajoute alors le suffixe “-osyl” un oside osidiques et anomérie des ♦ Ex : Le 1er ose de l’alpha-D-Glucopyranosyl-1-6 D composés Glucopyranose engage son groupement hémiacétalique (réducteur) dans la liaison osidique. ♦ Les carbones qui engagent leur groupement hydroxyle Position des dans la liaison osidique sont numérotés. liaison osidiques sur ♦ Ex : On parle de liaison 1-6 lorsqu’on la liaison osidique relie le carbone n°1 d’un ose et le carbone chaque ose n°6 d’un autre ose. ♦ Les enzymes prennent le nom d’osidases ou de glycosidases. Nom des enzymes ♦ Leur nom provient du nom de l’ose qui engage son carbone anomérique dégradant les dans l'osidique. osides ♦ Ex : c’est une alpha glucosidase qui hydrolyse l’alpha D-Glucopyranosyl-1-6 D-Glucopyranose puisque c’est le glucose qui engage son groupement hémiacétalique ici. Université Sorbonne Paris Nord 5 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES B. LES DISACCHARIDES EXEMPLE : LE MALTOSE ♦ Le maltose est issu de la réunion de 2 glucoses (c’est donc un homo-disaccharide) ♦ Le maltose a un pouvoir réducteur car le groupe hydroxyle du deuxième ose est libre (entouré en rouge) —> sa nomenclature se termine donc par “ose”. ♦S’il n’y avait pas de OH hémiacétal libre (engagé dans une liaison),sa nomenclature se serait terminée par “oside”. ⚠Les disaccharides sont à connaître +++ α - D-glucopyranosyl-1,4- α-D glucopyranose ♦ Règle de nomenclature : ici nous avons : 1) Anomérie du 1er sucre 2) Série du 1er sucre 3) Nom – OSYL 4) Position des C engagés dans la liaison 5) Anomérie du 2ème sucre 6) Série du 2ème sucre 7) Nom du 2ème sucre avec terminaison OSE si OH hémiacétal libre sinon OSIDE si OH hémiacétal non libre. II. FORMATION DES OSIDES : LES DISACCHARIDES PROPRIÉTÉS ♦ Lorsqu’un ose engage son carbone anomérique (groupement hémiacétalique) dans la liaison : o Son anomérie est fixée 1er Ose o Il prend le suffixe -osyl o Il n’est plus réducteur ♦ Ex : Lorsque l’alpha D-glucopyranose engage son groupement hémiacétal dans une liaison osidique, on l’écrit alpha D-glucopyranosyl → alpha-D-Glucopyranosyl 1-6 D-Glucopyranose. ♦ Lorsque le 2ème ose ne fait pas intervenir son groupement hémiacétal dans la liaison : 2ème Ose o Sa fonction réductrice est libre o Son anomérie n’est pas fixée o Il reste réducteur Université Sorbonne Paris Nord 6 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES : LES DISACCHARIDES LE SACCHAROSE (ou sucrose) Il est constitué d’α-D-glucopyranose et de β-D-fructofuranose. Structure Il correspond à l’alpha-D-Glucopyranosyl-1,2-β-D-Fructofuranoside Il peut aussi s'appeler le β-D-fructofuranoside-1,2- α-D-glucopyranoside. La liaison osidique peut être β1-2 ou ɑ1-2. ♦ Les 2 oses engageant leur fonction réductrice, le saccharose n’est pas réducteur. Propriétés ♦ Le saccharose correspond au “sucre” alimentaire. (fructose beaucoup plus sucré que le glucose). ♦ Il est d’origine végétale : taux variable selon les aliments. II. FORMATION DES OSIDES : LES DISACCHARIDES AUTRES DISACCHARIDES C’est un hétérodisaccharide car on retrouve un galactose lié à un glucose. Rappel : le galactose est l’épimère en C4 du glucose. Le lactose La liaison entre les 2 est de type β1-4 car le glucose est dans son anomérie bêta un pouvoir réducteur car l’hydroxyle hémiacétal du glucose libre, sa terminaison est donc en ose. ♦ Ce sont 2 molécules de glucose liées qui sont en anomérie alpha. ♦ Il ne possède pas de pouvoir réducteur. Le tréhalose Université Sorbonne Paris Nord 7 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES C. POLYSACCHARIDES ♦ Les polysaccharides sont divisés : o En homo-polysaccharides quand il y a un seul type de glucide qui est lié et polymérisé. o En hétéro-polysaccharides lorsqu’il y a plusieurs unités glucidiques différentes qui sont liées, elles peuvent être ramifiées ou linéaires. homo-polysaccharide hétéro-polysaccharide ♦ Les polysaccharides ont plutôt un rôle structurel dans les cellules et les tissus, en effet ces derniers sont chargés d’assurer l’organisation et la stabilité du tissu. ♦ Les ramifications sont dues au fait que les glucides portent plusieurs OH (alcool/hydroxyle) sur lequel peuvent s’attacher d’autres OH hémiacétal venant de la part d’autres glucides. ♦ Il faut savoir que les glucides sont les seuls polymères biochimiques à être ramifiés (leur structure peut être complexe). Les protéines, les acides nucléiques et les lipides ne le sont pas. Université Sorbonne Paris Nord 8 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES : POLYSACCHARIDES PRINCIPAUX HOMOPOLYSACCHARIDES : L’AMIDON ♦ L’amidon est un polymère de glucose dans les végétaux, constitué de l’amylose (linéaire) et de l’amylopectine (ramifié). ♦ L’amidon est un homopolyoside réducteur car il y a une extrémité ou il y a un OH hémiacétal libre, c’est donc une extrémité réductrice. Définition ♦ L’autre extrémité se nomme l’extrémité non réductrice car la chaîne se termine avec le carbone qui porte le OH alcool en position 4 et n’a pas de pouvoir réducteur. ♦ Les animaux peuvent digérer l’amidon. ♦ L’amidon est un homopolyoside/homopolysaccharide de réserve énergétique du monde végétal présent dans la pomme de terre, la farine ou le riz. ♦ L’amylose est une molécule formée d’une longue chaîne linéaire. o Les glucoses sont reliés entre eux par des liaisons α1-4 : chaque molécule de glucose engage son carbone réducteur. ♦ L’amylopectine est une molécule ramifiée formée : o De ramifications = branchements : ▪ Elles sont branchées sur une chaîne linéaire d’α-D-glucoses par une liaison α1-6 tous les 20 à 30 résidus glucoses. ♦ L’amylose et les parties linéaires de l’amylopectine s’enroulent sur elles-mêmes pour acquérir une forme hélicoïdale : condensation de molécules de glucose dans un même volume = gain de place. Structure de l’amylose et Liaisons α1-4 et α1-6 dans les ramifications. de l’amylopectine Université Sorbonne Paris Nord 9 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny PRINCIPAUX HOMOPOLYSACCHARIDES : L’AMIDON DIGESTION ♦ La 1ère enzyme qui intervient est l’amylase, capable de couper, d’hydrolyser les liaisons de type alpha-1,4. C'est donc une α-1,4-glucosidases. Action des amylases: enzyme spécifique de la digestion de l’amidon o L'amylase salivaire commence la digestion de l’amidon dans la bouche. o La digestion se poursuit dans le tube digestif, par l’amylase pancréatique o Il y a alors libération de maltose et de maltotriose = oligoside formé de 3 molécules de glucose. ♦ Lorsqu’elles arrivent à proximité d’une ramification, de par l’encombrement stérique, les amylases n’avancent plus le long de la chaîne linéaire : o Elle se décrochent o On obtient alors des dextrines = oligosides qui comportent des molécules de glucose liées en α 1-4 et une ramification en α1-6 ♦ L a 2ème enzyme qui intervient est l’alpha 1-6 glucosidase = enzyme débranchante qui dégrade la liaison de type alpha 1-6 des dextrines Autres enzymes (qui portent encore les ramifications typiques de l’amylopectine) de façon à libérer du maltose et du maltotriose. Le maltose va être absorbé par les cellules (entérocytes par exemple) et va participer aux voies métaboliques Université Sorbonne Paris Nord 10 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES : POLYSACCHARIDES PRINCIPAUX HOMOPOLYSACCHARIDES : LE GLYCOGÈNE ♦ Homopolyoside de réserve glucidique du monde animal. ♦ Son rôle est le stockage du glucose dans les cellules. ♦ Sa structure est semblable à celle de l’amylopectine : o Chaîne linéaires de glucoses reliées en α1-4. o Ramifications en α1-6. Structure ♦ Ramifications beaucoup plus fréquentes que celles de l’amylopectine : o Un branchement tous les 8 à 12 résidus glucoses. o La condensation de molécules de glucose est beaucoup plus importante dans un même volume pour le glycogène que pour l’amidon = stratégie pour stocker plus de molécules de glucose dans le minimum d’espace. ♦ Le glycogène, polymère du glucose (environ 30 000 unités), à une utilisation différente par rapport à l’amidon car il n’y a pas d’hydrolyse de la molécule dans son entièreté mais l'action d’une enzyme qui est la phosphorylase (aussi appelée "glycogène phosphorylase") et qui va transférer un résidu de glucose de l’extrémité non réductrice du glycogène sur un résidu de phosphate. ♦ La phosphorylase retire un résidu de glucose à la fois —> produit le glucose phosphorylé qui sera utilisé dans les voies métaboliques pour Rôle la production d’énergie. ♦ Cette utilisation du glycogène permet une possibilité de régulation —> la phosphorylase s'arrête quand la cellule n’a pas besoin d’énergie. ♦ Le glycogène endogène sert de réserve énergétique du monde animal. ♦ Synthétisé par la glycogénogénèse principalement dans le foie et les muscles. Université Sorbonne Paris Nord 11 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny II. FORMATION DES OSIDES : POLYSACCHARIDES Comparaison entre l’hydrolyse de l’amidon et la glycogénolyse Hydrolyse de l’amidon Glycogénolyse Réserve Amidon Glycogène énergétique (réserve énergétique végétale) (réserve énergétique par milieu musculaire et hépatique) Enzymes -Amylases ( α1-4 -Phosphorylase + α1-6 impliquées glucosidase) + α 1-6 glucosidase glucosidase -Phosphoglucomutase -Maltase ( α 1-4 glucosidase) Produits de la -Maltotriose -Glucose-1-Phosphate digestion/réaction -Maltose -Glucose-6-Phosphate -Glucose -Glucose (foie) Devenir du glucose —> Entrée dans la glycolyse —> Entrée dans la glycolyse (ou —> Entrée dans la libération de glucose libre par le glycogénogénèse foie) Université Sorbonne Paris Nord 12 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny III. VOIES MÉTABOLIQUES DU GLYCOGÈNE A. GLYCOGÉNOLYSE Le glycogène ♦ Il correspond au stock de glycogène de l’organisme. endogène ♦ C'est un polymère de réserve énergétique du monde animal. ♦ La glycogénolyse est la voie métabolique d’utilisation des réserves énergétiques. ♦ Elle permet de mobiliser extrêmement rapidement les réserves énergétiques glucidiques par l'hydrolyse du glycogène endogène. Étapes de la glycogénolyse ♦ Elle est réalisée en seulement 2 étapes. ♦ Elle est réalisée dans les cellules du foie et des muscles. Université Sorbonne Paris Nord 13 sur 30  BIOCHIMIE Tutorat 05 – Les polysaccharides Santé Bobigny III. VOIES MÉTABOLIQUES DU GLYCOGÈNE : GLYCOGÉNOLYSE ENZYMES ♦ C'est l’enzyme clé de la glycogénolyse = enzyme dont le fonctionnement est régulé. ♦ Elle hydrolyse la liaison α1-4 du dernier résidu glucose de la chaîne = extrémité non-réductrice + substitue le OH porté par le C1 du glucose qu’elle a libéré par un phosphate. Réaction Catalysée Phosphorylase ♦ Elle libère du Glucose-1 phosphate. Composés ♦ Les Glc-1 phosphate sont libérés 1 à 1 pour que le libérés par glucose ne soit pas libéré en excès,et que la l’enzyme glycogénolyse soit réalisée tout en économisant le stock de glycogène. ♦ La phosphorylase est, par contre, inhibée en cas Régulation d’excès de glucose dans la cellule. ♦ Activée en cas de déficit énergétique. (ex: jeûne) ♦ Cette enzyme déplace donc le P du carbone 1 du Glc-1-phosphate sur Phosphoglucomutase le carbone 6 → Glc-6-Phosphate. ♦ Dans le muscle, il entre préférentiellement dans la glycolyse pour la production rapide d’énergie pour réaliser le travail musculaire. ♦ Elle n’est présente que dans le foie. Glucose 6 ♦ Elle dépho