RNA Isolation - Molecular Biology PDF

Machine Translated by Google Molecular Biology RNA Isolation Agricultural Biotechnology Programme Level 3 Machine Translated by Google...

Machine Translated by Google Molecular Biology RNA Isolation Agricultural Biotechnology Programme Level 3 Machine Translated by Google RNA Extraction:is the purification of RNA from biological samples. This procedure is complicated by the presence of ribonuclease enzymes in cells and tissues. Requires STRICT precautions to avoid sample degradation. RNA especially label. ‫ هو تنقية الحمض النووي الريبي من العينات‬:‫استخراج الحمض النووي الريبي‬.‫ هذا اإلجراء معقد بسبب وجود إنزيمات الريبونوكلياز في الخاليا واألنسجة‬.‫البيولوجية‬.‫ يتطلب احتياطات صارمة لتجنب تدهور العينة‬.1.‫ الحمض النووي الريبي خاصة التسمية‬.2 Machine Translated by Google RNases RNAses are enzymes which are small proteins that can generate and become active. MUST be eliminated or inactivated BEFORE isolation. CRITICAL to have a separate RNAse free area of lab. RNases are Naturally occurring enzymes that degrade RNA Common laboratory contaminant (from bacterial and human sources) Also released from cellular compartments during isolation of RNA from biological samples Can be difficult to inactivate ‫آر إن إس‬ are enzymes which are small proteins that can ‫ مستطيل أزرق وأبيض الوصف الذي تم إنشاؤه تلقائيا‬.1.generate and become active.‫ يجب التخلص منه أو تعطيله قبل العزل‬.2.‫ من األهمية بمكان أن يكون لديك منطقة مختبر منفصلة خالية من الحمض النووي الريبي‬.3 ‫ هي إنزيمات تحدث بشكل طبيعي تحلل الحمض النووي الريبي‬RNases.4 ‫ ملوثات المختبر الشائعة (من البكتيريا والبشر‬.5 )‫مصادر‬ ‫ صدر أيضا من المقصورات الخلوية أثناء عزل الحمض النووي الريبي من العينات البيولوجية‬.6 ‫ يمكن أن يكون من الصعب تعطيله‬.7 Machine Translated by Google Protecting against RNAse Wear gloves at all times Use RNase-free tubes and pipet tips Use dedicated, RNase-free, chemicals Pre-treat materials with extended heat (180 C for several hours), wash with DEPC- treated water, NaOH or H2O2 Supplement reactions with RNase inhibitors ‫الحماية من الحمض النووي الريبي‬.1 ‫ارتداء القفازات في جميع األوقات‬.2 ‫ وأطراف الماصات‬RNase ‫استخدم األنابيب الخالية من‬.3 RNase ‫استخدم مواد كيميائية مخصصة وخالية من‬.4 ‫ أو‬NaOH ‫ أو‬DEPC ‫ تغسل بالماء المعالج بواسطة‬، )‫ درجة مئوية لعدة ساعات‬180( ‫ معالجة المواد مسبقا بحرارة ممتدة‬.5 H2O2 RNase ‫تفاعالت المكمالت مع مثبطات‬.6 Machine Translated by Google TRIZOL RNA Isolation protocol TRIZOLE REAGENT The correct name of the method is Guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. TRIzol is light sensitive and is often stored in a dark- colored, glass container covered in foil. It must be kept below room temperature. When used, it resembles cough syrup, bright of the phenol is extremely strong.. Caution should be taken while using TRIzol (due to the phenol and chloroform). Exposure to TRIzol can be a serious health hazard. Exposure can lead to serious chemical burns and permanent A lab coat, gloves and a plastic apron are recommended TRIZOL RNA ‫بروتوكول عزل‬. Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ‫ كاشف تريزول االسم الصحيح للطريقة هو استخراج‬.1 -‫ حساس للضوء وغالبا ما يتم تخزينه في الظالم‬TRIzol ‫حاوية زجاجية ملونة‬ ‫ يجب أن تبقى أدناه‬.‫مغطاة بالرقائق‬ ‫ مشرق‬، ‫ يشبه شراب السعال‬، ‫ عند استخدامه‬.‫درجة حرارة الغرفة‬..‫من الفينول قوي للغاية‬.)‫ (بسبب الفينول والكلوروفورم‬TRIzol ‫ يجب توخي الحذر أثناء استخدام‬.2.‫ خطرا صحيا خطيرا‬TRIzol ‫ يمكن أن يكون التعرض ل‬.3 ‫يمكن أن يؤدي التعرض إلى حروق كيميائية خطيرة ودائمة‬ ‫ يوصى باستخدام معطف المختبر والقفازات والمئزر البالستيكي‬.4 Machine Translated by Google PRINCIPLE TRIzol Reagent It is a ready-to-use reagent used for RNA isolation from cells and tissues. TRIzol works by maintaining RNA integrity during tissue homogenization, while at the same time disrupting and breaking down cells and cell components. Addition of chloroform, after the centrifugation, separates the solution into aqueous and organic phases. RNA remains only in the aqueous phase. ‫مبدأ‬.‫ كاشف تريزول إنه كاشف جاهز لالستخدام يستخدم لعزل الحمض النووي الريبي من الخاليا واألنسجة‬.1 ‫ وفي نفس الوقت تعطيل‬، ‫ من خالل الحفاظ على سالمة الحمض النووي الريبي أثناء تجانس األنسجة‬TRIzol ‫ يعمل‬.2.‫وتكسير الخاليا ومكونات الخلية‬.‫ يفصل المحلول إلى مراحل مائية وعضوية‬، ‫ بعد الطرد المركزي‬، ‫ إضافة الكلوروفورم‬.3.‫ يبقى الحمض النووي الريبي فقط في المرحلة المائية‬.4  PRINCIPLE After transferring the aqueous phase, RNA can be recovered by precipitation with isopropyl alcohol. But the DNA and proteins can recover by sequential separation after the removal of aqueous phase. Precipitation with ethanol requires DNA from the interphase, and an additional precipitation with isopropyl alcohol requires proteins from the organic phase. Total RNA extracted by Reagent is free from the contamination of protein and DNA. This RNA can be used in Northern blot analysis, rt-pcr, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning ‫مبدأ‬ ‫ يمكن استرداد الحمض النووي الريبي عن طريق هطول األمطار مع كحول‬، ‫ بعد نقل المرحلة المائية‬.1 ‫ لكن الحمض النووي والبروتينات يمكن أن يتعافى عن طريق الفصل المتسلسل بعد إزالة الطور‬.‫األيزوبروبيل‬.‫المائي‬ ‫ وترسيب إضافي مع كحول‬، ‫ يتطلب هطول األمطار باإليثانول الحمض النووي من الطور البيني‬.2 ‫األيزوبروبيل‬ ‫ إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة الكاشف خال من تلوث‬.‫يتطلب بروتينات من المرحلة العضوية‬.‫البروتين والحمض النووي‬ ‫ في‬، rt-pcr ، ‫ يمكن استخدام هذا الحمض النووي الريبي في تحليل اللطخة الشمالية‬.3 ‫ واالستنساخ الجزيئي‬RNase ‫الترجمة المختبرية ومقايسة حماية‬  STEPS: 1- Homogenization: 1. Tissues: Homogenize tissue samples in TRIZOL reagent using a glass-Teflon or power homogeniz 2. Rinse cell or tissue with ice cold PBS once. Lyse cells directly in a culture dish by adding TRIZOL Reagent scraping with cell scraper. Pass the cell lysate several times through a pipette. Vortex thoroughly. STEPS: 1- Homogenization: 1. Tissues: Homogenize tissue samples in TRIZOL reagent using a glass-Teflon or power homogeniz 2. Rinse cell or tissue with ice cold PBS once. Lyse cells directly in a culture dish by adding TRIZOL Reagent scraping with cell scraper. Pass the cell lysate several times through a pipette. Vortex thoroughly. Machine Tr ans l at ed by Google 2. P hase Separation: The homogenized samples were incubated for 5 minutes at 15 to 30°C for the complete dissociation of nucleoprotein complexes. chloroform was added. The tubes were shaken vigorously by hand for 15 seconds and incubated at 15 to 30°C for 2 minutes. The samples were centrifuged for 15 minutes at no more than 12,000 g (4°C). The aqueous phase was transferred to other tubes. ( Following centrifugation, the mixture separates into a lower red, phenol-chloroform phase, an interphase, and a colorless upper aqueous phase. RNA remains only in the aqueous phase. The volume of the aqueous phase is about 70% of the volume of TRIZOL Reagent used for homogenization.) Machine T r ans l at ed by Google :‫فصل هاس‬ 2. P ‫ درجة مئوية للتفكك الكامل‬30 ‫ إلى‬15 ‫ دقائق عند‬5 ‫ تم تحضين العينات المتجانسة لمدة‬.1.‫من مجمعات البروتين النووي‬ ‫ درجة مئوية لمدة‬30 ‫ إلى‬15 ‫ ثانية وتم تحضينها عند‬15 ‫ تم هز األنابيب بقوة باليد لمدة‬.‫ تمت إضافة الكلوروفورم‬.2.‫ دقيقة‬2.)‫ درجات مئوية‬4( ‫ غرام‬12000 ‫ دقيقة عند ما ال يزيد عن‬15 ‫ تم طرد العينات بالطرد المركزي لمدة‬.3 ‫ ينفصل الخليط‬، ‫ ( بعد الطرد المركزي‬.‫ تم نقل المرحلة المائية إلى أنابيب أخرى‬.4 ‫ بقايا الحمض النووي الريبي‬.‫ والطور المائي العلوي عديم اللون‬، ‫ والطور البيني‬، ‫ والطور الفينول كلوروفورم‬، ‫إلى الطور األحمر السفلي‬ ).‫ المستخدم في التجانس‬TRIZOL ‫ من حجم كاشف‬٪ 70 ‫ حجم المرحلة المائية حوالي‬.‫فقط في المرحلة المائية‬  ‫‪1. RNA Precipitation:‬‬ ‫‪ The RNA was precipitated from the aqueous phase‬‬ ‫‪By adding isopropyl alcohol.‬‬ ‫‪ The mixture was centrifuged for 30 minutes at 12,000 × g (2 to 8°C).(The RNA‬‬ ‫)‪precipitate forms a gel-like pellet on the side of the tube at bottom‬‬ ‫‪.1‬ترسيب الحمض النووي الريبي‪:‬‬ ‫‪.1‬تم ترسيب الحمض النووي الريبي من المرحلة المائية‬ ‫عن طريق إضافة كحول األيزوبروبيل‪.‬‬ ‫‪.2‬تم طرد الخليط بالطرد المركزي لمدة ‪ 30‬دقيقة عند ‪ × 12000‬جم (‪ 2‬إلى ‪ 8‬درجات مئوية)‪(.‬يشكل راسب الحمض النووي‬ ‫الريبي حبيبات تشبه الهالم على جانب األنبوب في األسفل)‬ Machine Translated by Google Machine Translated by Google 2. RNA Wash 1- The supernatant was removed. The RNA pellet was washed once with 75% ethanol 2- The sample was inverted and mixed and Centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes at 4 degrees ‫ غسل الحمض النووي الريبي‬.1 ‫ كانت بيليه الحمض النووي الريبي‬.‫ تمت إزالة الطاف‬.1 ‫ من اإليثانول‬٪ 75 ‫تغسل مرة واحدة مع‬ ‫ درجات‬4 ‫ دقيقة عند‬30 ‫ دورة في الدقيقة لمدة‬12000 ‫ تم قلب العينة وخلطها وطردها بالطرد المركزي عند‬.2 Machine Translated by Google 3. Redissolving RNA _ The RNA pellet was dried. RNA was dissolved in RNase-free water ( DEPC-treated water )(or 0.5% SDS solution) by passing the solution through the pipette tip for a few times, and incubating for 10 minutes at 55 to 60°C _RNA ‫ إعادة حل‬.1.‫ تم تجفيف حبيبات الحمض النووي الريبي‬.1 RNase ‫ تم إذابة الحمض النووي الريبي في الماء الخالي من‬.2 ‫) عن طريق تمرير الحل من خالل‬SDS ‫ حل‬٪0.5 ‫) (أو‬DEPC ‫(المياه المعالجة‬ ‫ درجة مئوية‬60 ‫ إلى‬55 ‫ دقائق عند‬10 ‫ والحضانة لمدة‬، ‫طرف الماصة لعدة مرات‬ SPECTROPHOTOMETRIC ANALYSIS: to determine sample concentration and purity. The A260/A280 ratio should be above 1.6. :‫التحليل الطيفي‬ ‫لتحديد تركيز العينة و‬.1.‫نقاء‬ 1.6 ‫ أعلى من‬A260 / A280 ‫يجب أن تكون نسبة‬.2 Other Methods of RNA Isolation Filter-based RNA isolation Magnetic Particle Methods ‫طرق أخرى لعزل الحمض النووي الريبي‬ ‫ عزل الحمض النووي الريبي القائم على المرشح‬.1 ‫ طرق الجسيمات المغناطيسية‬.2