Replicação do DNA - Past Paper PDF

Aula 6 Replicação do DNA Características da replicação do DNA: - semiconservativa, em que uma das cadeias formadas é nova e a outra cadeia é parental - bi-direcional, ocorre nos 2 sentidos da bolha de transcrição - direção: 5’ para 3’, ou seja, a adição de novos n...

Aula 6 Replicação do DNA Características da replicação do DNA: - semiconservativa, em que uma das cadeias formadas é nova e a outra cadeia é parental - bi-direcional, ocorre nos 2 sentidos da bolha de transcrição - direção: 5’ para 3’, ou seja, a adição de novos nucleótidos é sempre feita no terminal 3’OH. O DNA é composto por uma dupla hélice e para que ocorra a replicação do mesmo é necessário que as 2 cadeias se separem. Isso acontece normalmente numa zona rica em timinas e adeninas designada de origem de replicação. Quais são os passos? 1. Moléculas das proteínas iniciadoras ligam-se a essa zona e distabilizam-na, formando uma estrutura de arco. É um pouco mais para a frente desta que se iniciará a replicação. 2. As enzimas helicases, trazidas até à zona já aberta pelas proteínas DNA C/ carregamento ligam-se junto à estrutura de arco formada e abrem suficientemente o resto da cadeia, a uma taxa de 1000 nucleótidos por segundo, de modo que o complexo de replicação do DNA se ligue a estas cadeias. Como? Assim que as proteínas DNA C saírem e através do gasto de energia e da sua rotação *Logo depois da helicase começar a abrir as cadeias, existe um conjunto de proteínas, designadas por SSB (Single-strand DNA binding), que se ligam às cadeias simples e as impedem de se ligar novamente, já que a conformação mais estável do DNA é em dupla hélice. Estas saem à medida que a DNA polimerase se vai deslocando e por isso produzindo a nova cadeia de DNA. 3. As helicases formarão, após realizarem o seu trabalho, uma região designada de forquilha de replicação. Esta será a região de replicação que aloja todo o material necessário para que ocorra a replicação do DNA (complexo multi-enzimático) e que se vai movendo progressivamente ao longo do DNA parental em direções opostas de modo que as 2 cadeias possam ser replicadas 4. É DNA polimerase a responsável por fazer a síntese da nova cadeia de DNA. No entanto é necessário que esta chegue até à cadeia e que se ligue a ela. Como é que isso acontece? Através do gasto de energia e de um conjunto de proteínas, designado de âncoras da DNA polimerase. Estas possuem 2 porções: o clamp loader, que depois acaba por sair e o sliding clamp, que permite que a DNA polimerase fique no local até ao fim do processo replicativo. 5. Como a DNA polimerase só consegue adicionar nucleótidos de 5’ para 3’, teriam que existir 2 DNA polimerases diferentes para replicarem as cadeias antiparalelas. Mas só existe uma… então como é que isso acontece? A síntese das duas cadeias ocorre de forma distinta: Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 Cadeia leading-> sintetizada continuamente Cadeia lagging-> sintetizada descontinuamente, através de pequenos fragmentos, designados de fragmentos de Okazaki, unidos posteriormente de forma a dar uma cadeia contínua. Como? 1) Remoção do primer de RNA por uma enzima RNase (nuclease) 2) DNA polimerase sintetiza o DNA em falta 3) DNA ligase junta os vários fragmentos de DNA. Como? Ligando o terminal 3’OH ao 5’-PO4, através do gasto de ATP. No fim desta ligação liberta-se AMP Processo comum: À medida que as cadeias são separadas, vai ocorrendo a síntese das novas cadeias. No entanto, primeiro, antes de se iniciar esta síntese é necessário adicionar um RNA primer, ou seja, ribonucleótidos, sintetizados pela RNA primase, de modo que exista um terminal 3’OH e DNA polimerase o reconheça como local a adicionar nucleótidos. Mas como é que são adicionados? Através da alteração da conformação da DNA polimerase e da libertação de um pirofosfato (2 fosfatos, já que o nucleótido é composto por 3) Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 Aula 7 Reparação e recombinação do DNA A reparação é necessária para manter a estabilidade genética de um organismo. Como tal, existem 2 tipos de mecanismos: - Mecanismo preciso de replicação do DNA -> controla se a replicação ocorreu corretamente, já que como existem tantos agentes a atuar, existe a possibilidade de algo correr mal. A estes danos, dá-se o nome de ESPÔNTANEOS Possíveis fontes de erros:  Pequenas alterações na geometria da hélice em que podem formar-se pontes de hidrogénio entre G e T  Incorporação de formas tautométricas das 4 bases do DNA formando-se pares do tipo C-A e T-G sem alterar a geometria da hélice Mas o que são formas tautométricas? As formas normalmente incorporadas no DNA são: da adenina e citosina – AMINO; da guanina e timina- CETO. No entanto, podem surgir as formas tautométricas: da adenina e citosina – IMINO da guanina e timina – ENOL e são estas que permitem as erradas ligações de A-C e T-G. Como é tal necessário fazer esta revisão!! Quem faz? DNA polimerase. Onde? No centro catalítico exonucleótido. Como? Caso haja a incorporação de uma forma tautométrica, ocorre uma ligação errada. No entanto, como esta forma é instável, o nucleótido passa rapidamente à sua forma normal, sendo detetada assim a ligação errada. Perante esta deteção, a polimerização pára e a DNA polimerase passa para o seu modo de edição. Assim, a cadeia filha vai-se deslocar até ao centro catalítico exonucleótido, desemparelha-se temporariamente e são removidos os nucleótidos mal emparelhados. Logo a seguir, a síntese continua normalmente. *A replicação do DNA tem uma taxa de erro de 1 para 10^9 nucleótidos copiados - Mecanismo de reparação do DNA: utilizado para reparar danos INDUZIDOS, ou seja, que têm origem quando as células são expostas a agentes químicos externos ou radiação. Tipos:  Base excursionara repair: são removidas bases azotadas Como? 1) Citosina sofreu uma desanimação e transformou-se em urânio. No entanto, o uracilo não faz parte do DNA logo uma DNA glicosilase vai eliminá-lo. 2) Sobrou agora um açúcar fosfato sem base e como tal, a enzima AP endonuclease e a fosfodiesterase vão retirá-lo 3) Perante a lacuna que se criou, a DNA polimerase e ligase irão preenchê-la Assim, um uracilo foi restaurado por uma citosina. *um açúcar sem base pode resultar ou da perda de uma porina ou de uma pirimidina.  Nucleotide excision repair: são removidos nucleótidos no seu conjunto Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 Como? 1) É detetado um erro e como tal a helicase é chamada para desenrolar o DNA só naquele sítio 2) Nuclease de excisão/remoção entra naquela bolha criada temporariamente e vai clivar ambos os lados do dano, deixando uma lacuna de 30 nucleótidos. 3) DNA polimerase e ligase adicionam os nucleótidos que estão em falta e está reparado. Quando há quebras nas duas cadeias de DNA ao mesmo tempo, não existe uma cadeia molde intacta para permitir uma reparação precisa. Como tal surgem 2 novos processos de reparação: - NHEJ (nonhomologous end joining): as cadeias são simplesmente juntas novamente pela proteína Ku, mesmo que haja perda de nucleótidos. Como tal, este processo pode levar ao possível aparecimento de uma mutação, contudo como só uma pequena porção do genoma é essencial à vida, este método acaba por não ser assim tão mau. - HR (homologous recombination): utilizado quando as quebras aparecem pouco depois de o DNA ter sido replicado e implica a utilização de enzimas. Processo: 1. Nuclease digere as extremidades das cadeias quebradas 2. Como passou pouco tempo da replicação, as cadeias filhas ainda estão emparelhadas e como tal estas vão servir de molde para as cadeias incompletas. Assim, uma polimerase de reparação começa a sintetizar os nucleótidos…quando alguns já estão incorporadas, as cadeias filhas são libertadas e a síntese prossegue até o fragmento que falta estar todo produzido. 3. Por fim, os fragmentos produzidos são ligados às cadeias que estavam incompletas, reparando a quebra. *Note-se que se este tipo de dano não for reparado pode levar à degradação cromossómica e perda de genes aquando da divisão celular. Este tipo de danos pode ser causado por radiação ionizante, agentes oxidastes e por metabolitos produzidos pela célula. Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023