Protocolos-29-35.pdf (Trabalho Nº 4 - Extração e Separação dos Pigmentos do Espinafre)

LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química Trabalho Nº 4 - Extração e Separação dos Pigmentos do Espinafre 1. INTRODUÇÃO Vegetais com cores fortes, como o espinafre, contêm uma mistura de pigmentos de onde se destacam a clorofila a, a cloro...

LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química Trabalho Nº 4 - Extração e Separação dos Pigmentos do Espinafre 1. INTRODUÇÃO Vegetais com cores fortes, como o espinafre, contêm uma mistura de pigmentos de onde se destacam a clorofila a, a clorofila b (compostos responsáveis pela cor verde das plantas) e o -caroteno (responsável pela cor laranja predominante nas cenouras e alperces), compostos com extensa conjugação que absorvem luz na região de 200 a 800 nm do espectro ultravioleta-visível (Figura 1). Embora em menor quantidade, estão também presentes outros pigmentos como as xantofilas (derivados oxidados dos carotenos) e as feofitinas (semelhantes à clorofila por substituição do ião Mg2+ por dois iões H+). Quando ingerido, o –caroteno é clivado formando duas moléculas de vitamina A, sendo a maior fonte desta vitamina na dieta alimentar. A vitamina A, também denominada de retinol, tem um papel muito importante na saúde visual. Os pigmentos são apolares e como tal, insolúveis em água, daí a dificuldade que existe aquando da remoção de nódoas de ervas. Em contrapartida, apresentam elevada solubilidade em solventes não polares. O -caroteno é um hidrocarboneto apolar, enquanto as clorofilas contêm ligações polares C-O e C-N, assim como uma ligação N-Mg, considerada quase iónica. Por estas razões, a polaridade das clorofilas e do -caroteno são distintas, tornando a cromatografia um método eficiente na separação destes pigmentos. Figura 1 - Estruturas da Clorofila a, da Clorofila b e do -Caroteno. Entrada em vigor: Setembro 2024 27  LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química O licopeno (C40H56) é uma substância carotenoide que dá a cor avermelhada ao tomate, melancia, beterraba, goiaba, entre outros alimentos. É um antioxidante com uma eficiência superior à vitamina E que ao ser absorvido pelo organismo, contribui para minimizar e mesmo reparar, os danos nas células causados pelos radicais livres. Embora o licopeno seja bastante solúvel em água, apresenta uma estrutura apolar (Figura 2). Figura 2 - Estrutura do Licopeno. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que dietas ricas em alimentos contendo licopeno contribuem para a prevenção de doenças cardiovasculares, alguns tipos de cancro e protegem dos raios ultravioleta. O -caroteno, também da família dos carotenoides, está também presente nestes alimentos, mas em menor quantidade. Para assegurar uma extração eficiente, sem utilizar grandes quantidades de solvente, utilizam-se processos de extração descontínua e extração contínua sólido-líquido (extrator de Soxhlet). Uma técnica expedita para a identificação e/ou separação dos pigmentos extratados é a cromatografia, a qual pode ser usada quer como método analítico (no qual se avalia o número e a natureza dos componentes de uma mistura sem proceder ao seu isolamento), quer como método preparativo (isolamento e subsequente quantificação dos componentes de uma mistura). O presente trabalho tem como objetivo o isolamento de pigmentos por extração descontínua e contínua. A composição dos extratos brutos será avaliada por cromatografia em camada fina (c.c.f., vide Trabalho nº 1) (método analítico) e o isolamento dos pigmentos maioritários (clorofilas e carotenos) será realizado por cromatografia em coluna (c.c. (método preparativo); vide publicação Segurança, Procedimentos Laboratoriais, Técnicas Analíticas). 2. PARTE EXPERIMENTAL Atenção: Não descurar a utilização de luvas e óculos de proteção, assim como trabalhar em hotte devidamente ventilada! 2.1. Reagentes e auxiliares ✓ Folhas de espinafre ✓ Sílica gel 60 Å (0.060 - 0.2 mm) Entrada em vigor: Setembro 2024 28  LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química ✓ Placas de c.c.f. ✓ Acetona (CH3COCH3) ✓ n-Hexano ((CH3(CH2)4CH3) ✓ Diclorometano (CH2Cl2) ✓ Metanol (CH3OH) ✓ Sulfato de magnésio anidro (MgSO4) 2.2 Material ✓ Extractor de Soxhlet de 125 mL ✓ Balão de fundo redondo 250 mL ✓ Refrigerante de bolas (ou equivalente) ✓ Coluna cromatográfica ✓ Câmara de cromatografia ✓ Material de vidro corrente (Erlenmeyers, copos, funis de sólidos e funis de líquidos, etc.) 2.3 Equipamento ✓ Balança técnica e/ou analítica ✓ Evaporador rotativo (rota-vapor) ✓ Mantas de aquecimento (ou placa de aquecimento com agitação) 2.4 Técnica 2.4.1 Extração Contínua Realizar uma montagem para uma extração em Soxhlet (balão de fundo redondo de 250 mL) e preparar o cartucho (dedo de extração) (Figura 3). Cortar em pequenos pedaços ca. 30 g de folhas de espinafres frescos e transferir para o cartucho, colocando previamente um pouco de algodão na parte inferior do cartucho e no final em cima do espinafre (topo do cartucho). Entrada em vigor: Setembro 2024 29  LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química Introduzir o cartucho carregado no interior do Soxhlet, deitar no balão Refrigerante 150 mL de acetona e alguns regularizadores de ebulição. Adaptar o de bolas extrator ao balão, conectar o refrigerante de bolas ao extrator e ligar a refrigeração. Iniciar o aquecimento (utilizar uma manta de aquecimento ou uma placa de aquecimento com agitação magnética) e manter o sistema em refluxo até que ocorram 3 ciclos de extração. Decorrido esse período, interromper o aquecimento. Adicionar ao extrato obtido uma porção de n-hexano (ca. 50 mL), transferir para uma ampola de decantação, separar a fase orgânica, secar com exsicante (MgSO4), filtrar Extrator por gravidade para um balão de fundo redondo previamente tarado e de Soxhlet evaporar à secura no evaporador rotativo. Quantificar o extrato bruto Balão de fundo obtido. redondo Manta de Figura 3 - Montagem de Aquecimento extração em Soxhlet. 2.4.2 Avaliação da Composição do Extrato Bruto por Cromatografia em Camada Fina4 Preparar uma placa de c.c.f. (dimensão ca. 2 × 8 cm), marcar a lápis o ponto de aplicação e aplicar o extrato bruto com um capilar. Atenção: a amostra deve ser aplicada cuidadosamente, de modo a não ferir a camada de sílica gel. Entretanto preparar a câmara cromatográfica (a mesma poderá ser improvisada recorrendo a um copo e um vidro de relógio) e o sistema eluente (fase móvel) a utilizar (n-hexano:acetona (7:3)). Colocar a quantidade adequada de fase móvel na câmara cromatográfica e deixar saturar. Colocar na câmara a placa contendo a amostra em avaliação e eluir até ca. 1 cm do topo da placa (frente do solvente). Retirar a placa, marcando a lápis a frente do solvente e secar. Assinalar a lápis todas as manchas visíveis. Atenção: as manchas podem desaparecer ou mudar de cor quando expostas ao ar e à luz, resultado da oxidação dos pigmentos. Calcular o valor do fator de retenção (Rf) de cada mancha e tentar identificar cada componente considerando a diferença de polaridade dos possíveis pigmentos presentes nas folhas de espinafre. Comparar com os valores de referência indicados na tabela seguinte. Entrada em vigor: Setembro 2024 30  LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química Tabela 1 - Valores padrão de Rf dos pigmentos com n-hexano:acetona (7:3).4 PIGMENTO COR Rf Caroteno Amarelo-alaranjado 0.80 Feofitina a Verde-acinzentado 0.55 Feofitina b Cinzento-claro* 0.47-0.54 Clorofila a Azul-esverdeado 0.42 Clorofila b Verde 0.34 Xantofilas Amarelo 0.30 Xantofilas Amarelo 0.20 Xantofilas Amarelo 0.10 *Nem sempre visível. 2.4.3 Separação dos Componentes do Extrato Bruto por Cromatografia em Coluna Introduzir n-hexano na coluna cromatográfica até ca. metade, adicionar uma pequena porção de areia na base da coluna e verificar o funcionamento da torneira. Pesar num copo de 100 mL, ca. 7 a 10 g de sílica gel 60 Å (0.060 - 0.2 mm) e adicionar a quantidade de n-hexano necessária para formar uma suspensão homogénea com a ajuda de uma vareta de vidro. Abrir a torneira da coluna deixando gotejar para dentro de um copo durante o enchimento e com a ajuda da vareta de vidro deitar de modo contínuo a suspensão na coluna. Atenção: Quando se interrompe a adição da suspensão à coluna por algum tempo, a sílica tende a sedimentar e formam-se zonas estratificadas. Uma maneira de evitar esta situação é agitar o solvente na coluna com uma vareta de vidro entre duas adições da suspensão. Deixar gotejar o solvente alguns minutos após o enchimento da coluna para facilitar a compactação da sílica. Fechar a torneira, deixando o solvente a cobrir a parte superior da sílica (nunca deixar a superfície da sílica sem eluente). Colocar com cuidado uma pequena camada (ca. 0.5 cm) de areia no topo da coluna. Deixar eluir o solvente até ca. 2-3 mm acima do nível da areia. Dissolver o extrato em ca. 2 mL de n-hexano e aplicar a solução lentamente no topo da coluna com auxílio de uma pipeta de Pasteur. Deixar gotejar o solvente da coluna até que a solução de extrato desça ao nível da areia. À medida que o extrato entra em contacto com a sílica, os pigmentos começam a separar-se em duas bandas, uma de cor amarela-alaranjada (menos polar) e uma de cor verde (mais polar). Recolher toda a fração amarela-alaranjada em frascos de vidro previamente numerados. Entrada em vigor: Setembro 2024 31  LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química Alterar a polaridade do sistema eluente (fase móvel) para uma mistura n-hexano:acetona (8:2) para eluir os pigmentos mais polares, e se necessário, aumentar progressivamente a polaridade. Caso se justifique, recorrer apenas a acetona. Avaliar a pureza das frações recolhidas por cromatografia em camada fina (c.c.f.) por comparação com a composição do extrato bruto. 3. BIBLIOGRAFIA 1 Richardson, B. C.; Casteen, T. G. Experience the Extraordinary Chemistry of Ordinary Things: a Laboratory Manual, 3rd ed.; John Wiley & Sons Inc., 1997. 2 Rodrigues-Amaya, D. A Guide to Carotenoid Analysis in Foods, International Life Sciences Institute, 2001, 64. 3 Becker, H. G. O.; Berger, W.; Domschke, G.; Fanghänel, E.; Faust, J.; Fischer, M.; Gentz, F.; Gewald, K.; Gluch, R.; Mayer, R.; Müller, K.; Pavel, D.; Schmidt, H.; Schollberg, K.; Schwetlick, K.; Seiler, E.; Zeppenfeld, G. Organikum - Química Orgânica Experimental, 2ª ed., Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa, 1997. 4 Afonso, C. A. M.; Candeias, N. R.; Simão, D. P.; Trindade, A. F.; Coelho, J. A. S.; Tan, B.; Franzén, R. Comprehensive Organic Chemistry Experiments for the Laboratory Classroom, Royal Society of Chemistry, 2017. 5 Palleros, D. R. Experimental Organic Chemistry, John Wiley & Sons Inc., 2000. 6 Pavia, D. L.; Lampman, G. M.; Kriz, G. S.; Engel, R. G. Introduction to Organic Laboratory Techniques: A Microscale Approach, 3rd ed.; Saunders College Publishing, 1999. 7 Quach, H. T.; Steeper, R. L.; Griffin, G. W. An improved method for the extraction and thin-layer chromatography of chlorophyll a and b from spinach J. Chem. Educ., 2004, 81, 385-387. 8 Goodrich, J., Parker, C., Phelps, R. The microscale separation of lycopene and [beta]-carotene from tomato paste J. Chem. Educ., 1993, 70, A158. 9 Safety in Academic Chemistry Laboratories, 8th ed.; American Chemical Society, Washington, 2017. 4. MANUSEAMENTO DOS RESÍDUOS ✓ Coloque a sílica gel num recipiente para resíduos de sílica de c.c.; ✓ Coloque os solventes orgânicos no recipiente adequado (solventes halogenados, não halogenados ou hidrocarbonetos). Entrada em vigor: Setembro 2024 32  LICENCIATURA ENGENHARIA QUÍMICA E BIOLÓGICA TÉCNICAS LABORATORIAIS - Química 5. QUESTIONÁRIO - Extração e Separação dos Pigmentos do Espinafre Data: ______________________ Turma: ___________________ Grupo: __________________ Nº: ________ Nome: _____________________________________________________________ Nº: ________ Nome: _____________________________________________________________ Nº: ________ Nome: _____________________________________________________________ 1. Identifique as operações unitárias que utilizou na extração dos pigmentos presentes nas folhas de espinafre? 2. Indique como procedeu para identificar os vários pigmentos presentes no extrato que isolou. 3. Calcule os valores de Rf das manchas observadas na c.c.f. do extrato e identifique-as através das cores e dos valores padrão fornecidos (consultar pág. 30). 4. Indique qual a propriedade na qual se baseia o princípio da separação por cromatografia em coluna e identifique a fase móvel e a fase estacionária. 5. Na c.c.f. a mistura eluente que utilizou foi n-hexano:acetona (7:3). a) Identifique qual o solvente mais polar. b) Sugira um sistema eluente com uma polaridade inferior à que utilizou na separação dos vários pigmentos presentes no extrato, justificando. Entrada em vigor: Setembro 2024 33