Proteosyntéza PDF

Proteosyntéza PharmDr. Monika Sučik, PhD.  PROTEOSYNTÉZA Kľúčový proces - zložitý a energeticky náročný Zúčastňujú sa ho: 1. Bunkové organely (R, ER, GA) 2. Enzýmy (RNA polymeráza,....) 3. Bielkovinové faktory 4. Pomocné látky PROTEOSYNTÉZA TRANSKRIPCIA - prepis časti GI o zložení konkrétneho P z...

Proteosyntéza PharmDr. Monika Sučik, PhD.  PROTEOSYNTÉZA Kľúčový proces - zložitý a energeticky náročný Zúčastňujú sa ho: 1. Bunkové organely (R, ER, GA) 2. Enzýmy (RNA polymeráza,....) 3. Bielkovinové faktory 4. Pomocné látky PROTEOSYNTÉZA TRANSKRIPCIA - prepis časti GI o zložení konkrétneho P z archivovanej kópie v DNA do pracovnej kópie mRNA. Prokaryoty v jadrovej oblasti, eukaryoty v jadre. TRANSLÁCIA - preklad GI z pracovnej kópie mRNA (CGAU) do jazyka P (AMK). Prebieha v cytoplazme na ribozómoch. PROTEOSYNTETICKÝ APARÁT 1. ribozómy (SSU+LSU - 30S a 50S prokaryoty, 40S a 60S u eukaryoty) 2. t-RNA 3. m-RNA 4. enzýmy (RNA polymeráza,...) 5. bielkovinové faktory (iniciačné, elongačné, terminačné) 6. GTP (zdroj energie) TRANSKRIPČNÁ JEDNOTKA TJ = úsek DNA, z ktorého sa syntetizuje jedna súvislá molekula RNA Prokaryoty - môže TJ pozostávať z viacerých génov (viac polypeptidových reťazcov) – prepisom vzniká primárny transkript - označuje sa ako polycistronická mRNA Eukaryoty – jedna molekula RNA obsahuje informáciu pre syntézu len jedného polypeptidového reťazca - monocistronická mRNA TRANSKRIPČNÁ JEDNOTKA Prokaryoty TJ majú dvojakého typu: Operónová TJ Neoperónové TJ – je riadená len promótorom Každá z nich sa skladá z: Promótor Štartovací nukleotid Prepisované gény Terminátor TRANSKRIPČNÁ JEDNOTKA Operón má medzi promótorom a štartovacím nukleotidom – operátor – regulačná oblasť operónu, na ktorú sa viaže P tzv. represor – zodpovedá za zastavenie transkripcie  GÉN základná funkčná genetická jednotka Gén predstavuje kompletnú sekvenciu NK (DNA alebo RNA), ktorá nesie informáciu pre syntézu určitého produktu (funkčnej RNA alebo Proteín). 1. Gén pre funkčnú RNA – DNA úseky - kódujú primárnu štruktúru rRNA a tRNA – primárny transkript – pre-rRNA, pre-tRNA, pre- mRNA (hnRNA) – posttranskripčnou úpravou vznikajú funkčné rRNA, tRNA, mRNA (u eukaryotov), u baktérií posttranskripčná úprava neprebieha (nemá intróny) 2. Gén ako regulačná oblasť – úsek DNA alebo RNA (u RNA vírusov) – plní regulačnú funkciu – rozpoznávaný špecifickým P – napojenie signalizuje zahájenie alebo zastavenie transkripcie – gén nemá produkt 3. Štruktúrny gén - úsek DNA – obsahuje informáciu o primárnej štruktúre Proteínu  Gény sú na určitom mieste = lokuse v chromozóme. Na rovnakých lokusoch v homologických chromozómoch sa nachádzajú formy génu tzv. alely. Gén sa začína špecifickým úsekom PROMÓTOROM - je väzobným miestom pre RNA polymerázu a teda miestom začiatku prepisu GI. Gén je ukončený špecifickým úsekom TERMINÁTOROM, miestom ukončenia prepisu GI. Gén Prokaryoty - gény majú exónovú štruktúru. Eukaryoty - gény majú intrón-exónovú štruktúru. Exóny sú kódujúce úseky DNA, ktoré sa prepisujú do poradia AMK v polypeptide Intróny sú nekódujúce úseky DNA, ktoré sa neprepisujú do poradia AMK v polypeptide Génová expresia Génová expresia ("vyjadrenie génu", resp. jeho GI) - predstavuje kvantitatívnu mieru transkripcie Hlavný enzým podieľajúci sa na transkripcii je RNA-polymeráza.  Genetická informácia Prepis GI z jedného typu NK do druhého typu NK -------------z DNA do RNA GI je správa zapísaná v DNA o poradí AMK v peptidovom reťazci, ktorý vytvára P. GI je zapísaná pomocou genetického kódu (GK). AMK musí byť určovaná najmenej trojicou báz - triplet. Triplet - kóduje AMK - označuje sa ako kodón. G G mRNA A C 5' 3' kodon Vlastnosti Genetického kódu GK je degenerovaný: rovnaká AMK môže byť kódovaná niekoľkými tripletmi (synonymné kodóny) ak sú prítomné špecifické OH skupiny (napr. CCU, CCA, CCG, CCC je pre prolin) - tzv. tichá mutácia (napr. zámenu posledného z trojice nukleotidov). 1 triplet kóduje len jednu 1 AMK. GK je univerzálny: všetky organizmy - kodóny majú rovnaký kódovací zmysel. Neplatí to u niektorých nižších skupín organizmov a u mitochondrií. Nezmyselné kodóny - nekódujú žiadnu AMK (stop kodóny), ale majú signalizačnú funkciu. Vlastnosti GK GK je tripletový: teda každý kodón sa skladá z 3 nukleotidových báz. GK sa neprekrýva: každý nukleotid je súčasťou len jedného kodónu.  Začiatok a koniec GK Dva špecifické kodóny: Začiatok - tvz. iniciačný kodón (štart kodóny) AUG (ktorý súčasne, ak sa nachádza aj na iných miestach kódu kóduje AMK metionín), výnimočne u prokaryotov GUG, UUG, CUG (selenocysteín, pyrrolyzín) Koniec kódu – jeden z trojice kodónov UAA, UAG, alebo UGA, ktoré nekódujú žiadnu AMK a označujeme ich ako terminačné kodóny (stop kodóny). G G mRNA A C 5' 3' kodon  Genetický kód – všetkých 64 možných kombinací Druhý nukleotid Terminačné Terminační kodony kodóny U C A G UUU fenyalanin UCU serin UAU tyrosin UGU cystein U UUC fenyalanin UCC serin UAC tyrosin UGC cystein C U UUA leucin UCA serin UAA stop kodon UGA stop kodon A (selenocystein) UUG leucin UCG serin UAG stop kodon UGG tryptofan G CUU leucin CCU prolin CAU histidin CGU arginin U CUC leucin CCC prolin CAC histidin CGC arginin C C CUA leucin CCA prolin CAA glutamin CGA arginin A Prvý CUG leucin CCG prolin CAG glutamin CGG arginin G Tretí nukleotid nukleotid AUU isoleucin ACU threonin AAU asparagin AGU serin U AUC isoleucin ACC threonin AAC asparagin AGC serin C A AUA isoleucin Iniciačný ACA kodón AAA lysin threonin AGA arginin A AUG methionin ACG threonin AAG lysin AGG arginin G GUU valin GCU alanin GAU kyselina asparagová GGU glycin U GUC valin GCC alanin GAC kyselina asparagová GGC glycin C G GUA valin GCA alanin GAA kyselina glutamová GGA glycin A GUG valin GCG alanin GAG kyselina glutamová GGG glycin G Eukaryotická RNA-polymeráza RNA-polymerázy sú enzýmy, ktoré katalyzujú syntézu reťazca RNA z voľných nukleozid-5'-monofosfátov, ktoré pripájajú na 3'-OH koniec syntetizujúceho sa RNA reťazca, pričom ako templát využívajú jedno vlákno DNA RNA-polymeráza I - vyskytuje sa v jadierku, transkribuje gény pre rRNA RNA-polymeráza II - vyskytuje sa v jadre, transkribuje štruktúrne gény a gény pre niektoré malé RNA RNA-polymeráza III - vyskytuje sa v jadre, transkribuje gény pre tRNA, 5S-rRNA a niektoré malé RNA  Eukaryotická RNA-polymeráza RNA-polymeráza nevyžaduje pre svoju funkciu primer ako substrát syntéza prebieha v smere 5´-3´, žiadna RNA-polymeráza nemá 3',5'- exonukleázovú aktivitu (proof-reading aktivitu) nedokáže z RNA reťazca vyštiepiť nesprávne zaradený nukleotid. Prokaryotická RNA-polymeráza Majú len jeden druh RNA polymerázy. Má 4 podjednotky: α podjednotka – udržuje stabilitu molekuly β podjednotka – podmieňuje väzbu ribonukleotidov na polymerázu β′podjednotka - podmieňuje spojenie RNA polymerázy s DNA reťazcom σ podjednotka – sigma faktor – podmieňuje väzbu RNA polymerázy k promótoru Prepisuje asi 40 nukleotidov za sekundu. Všeobecný priebeh transkripcie Iniciácia transkripcie Elongácia transkripcie Terminácia transkripcie  Iniciácia transkripcie u prokaryotov Každý prepis prebieha v istom úseku DNA – transkripčnej jednotke - tvoria ju gény, ktoré budú prepisované, na jednom konci začína promótorom, na druhom končí terminátorom a kóduje daný typ RNA. sigma faktor RNApolymerázy vyhľadá oblasť promótora, ktorý má funkčné oblasti: GACA-box - konvenčná sekvencia 5'-TTGACAT-3', pozícia ~(-35) TATA-box (Pribnowov box) - konvenčná sekvencia 5'-TATAAT-3', pozícia ~(-10) Dochádza k lokálnej denaturácii DNA, vzniká tzv. transkripčná bublina. Elongácia transkripcie u prokaryotov σ podjednotka sa odštiepuje od enzýmu a samotnú elongáciu zabezpečuje jadro enzýmu RNApolymeráza (podjednotky α1, α2, β, β´) RNApolymeráza postupne pridáva nukleozid-5'-monofosfáty na 3'-koniec reťazca RNA, pričom sa posúva po matricovom reťazci DNA Reťazec rastie v smere 5´→ 3´, rýchlosť elongácie je 20-50 nukleotidov/sek Na rozdiel od replikácie DNA, gén môže byť (a vždy aj je) prepisovaný viackrát, zatiaľ čo DNApolymeráza zreplikuje každý úsek DNA len raz.  Transkripcia 3' Spustiť animáciu Transkript 5' Ribonukleosidtrifosfát 5' 3' Templát 3' 5' Terminácia transkripcie prokaryotov Terminátor TJ je tvorený niekoľkými po sebe idúcimi pármi CG - vytvoria vlásenkovú štruktúru Medzi vlásenkami sa nachádza krátka sekvencia, ktorá vytvára nespárené OKO = štruktúru, ktorá bráni ďalšiemu pohybu RNA polymerázy sigma faktor terminácie identifikuje terminátor a viaže sa na jadro RNA polymerázy Syntéza RNA sa končí, RNA sa uvoľňuje z komplexu DNA/RNA, DNA spätne špiralizuje Terminátory transkripcie u baktérií 1. Terminátory nezávislé na ró-faktore – koniec sekvencie AAAAAAAA - 8A na DNA sa prepíše na 8U mRNA - signál na uvoľnenie RNA - vytvára sa vlásenková štruktúra 2. Terminátory závislé na ró-faktore - Ró-faktor – P uvoľňujúci dokončené RNA vlákno z matricového DNA reťazca, celý sa prepíše do RNA reťazca – končí sekvenciou napr. GTTAGAA prepísanou do mRNA na CAAUCUU - v prípade že nie je sekvencia 8A (8U) Produkty transkripcie u prokaryotov  Eukaryotická transkripcia Eukaryotický promótor má viacero funkčných oblastí GC-box - konvenčná sekvencia 5'- GGGCGG-3', pozícia ~(-90) CAAT-box (kæt box) - konvenčná sekvencia 5'-GGCCAATCT-3', pozícia ~(-80) TATA-box (Hognessov box) - konvenčná sekvencia 5'- TATAAAA-3', pozícia ~(-30) Produkty transkripcie u eukaryotov Transkripčné faktory potrebné u eukaryotov Na transkripcii sa zúčastňujú proteíny – transkripčné faktory (všeobecné a špeciálne) – vykonávajú úlohy, ktoré prokaryotická RNApol vykonáva sama v rámci iniciácie transkripcie rozoznávajú TATA-box prikladajú RNA-polymerázu II k promótoru rozpletajú dvojzávitnicu DNA a fosforylujú RNApolymerázu II, čím je aktivovaná k transkripcii GC-box a CAAT-box urýchľujú iniciáciu väzbou s ďalšími transkripčnými faktormi ďalej už RNA-polymeráza II katalyzuje syntézu RNA bez transkripčných faktorov.  Posttranskripčné úpravy RNA u eukaryotov Transkripciou vzniká primárny transkript (pre-mRNA) alebo heterogénna jadrová RNA (hnRNA), pri funkčných NK - pre-rRNA, pre-tRNA Tieto veľké molekuly sa pred opustením jadra ďalej upravujú (posttranskripčné úpravy): 1. Tvorba komplexov hnRNA s P = hnRNP + intróny hnRNA = spliceozóm 2. Úprava 5´-konca hnRNA tzv. čiapočkou 3. Polyadenylácia 3´-konca hnRNA 4. Zostrih – splicing Upravené RNA sú transportované do cytoplazmy a slúžia v procese translácie. Posttranskripčné transkripcia úpravy translácia DNA Pre-mRNA mRNA Proteín (v jadre) (v jadre) (vznik v jadre, transport do cytoplazmy) Posttranskripčné úpravy RNA u eukaryotov aj prokaryotov 1. komplex hnRNP + intróny hnRNA = spliceozóm snRNP riadi proces zostrihu hnRNP riadi tiež transport mRNA do cytoplazmy V cytoplazme mRNA+mRNP = komplex (regulácia translácie) 2. Na 5´ konci RNA vzniká tzv. čiapka (cap), čo je naviazanie 7-metylguanozínu na tento koniec. Čiapka chráni 5´ koniec budúcej mRNA pred štiepením exonukleázami a - pripojenie mRNA na ribozóm - začiatok translácie. Prebieha aj u baktérií. 3. Na 3´ konci sa uvoľní 3´OH primárneho transkriptu a pripojí sa na ňu úsek pozostávajúci z mnohých adenylových zvyškov v polohe C6 - tzv. polyadenylácia (katalyzuje enzým poly(A)- polymeráza). Prebieha aj u baktérií.  Zostrih – len u eukaryotov Eukaryotická DNA obsahuje: kódujúce sekvencie (tzv. exóny) nekódujúce sekvencie (tzv. intróny) Zostrih (RNA splicing): Intróny z pre-mRNA sú odstraňované „zostrihovými“ enzýmami Exóny sú spojené dohromady RNA ligázou mRNA Exony Introny 1. Priblíženie oboch koncov intronov 2. Odštiepenie intronov a spojenie exonov  Reverzná transkripcia podľa predlohy v podobe RNA sa syntetizuje komplementárna DNA (cDNA). životný cyklus niektorých RNA vírusov, špeciálne polymerázy - telomerázy RT je využívaná MB k amplifikácii materiálu pomocou RT-PCR Pri klasickej PCR slúži ako templát DNA. Pri RT-PCR sa k amplifikácii používa RNA, ktorá je pomocou reverznej transkriptázy prevedená na DNA. RT sa využíva pri výrobe inzulínu - mRNA, nesúca informáciu o AMK inzulínu, spolu s reverznou transkriptázou je vpravená do bakteriálnej bunky. V nej je mRNA prevedená pomocou reverznej transkriptázy na DNA a začlenená do bakteriálneho genómu - bakteriálna bunka začína tvoriť inzulín. Ten je využívaný v inzulínovej terapii diabetikov a je lepšie tolerovaný ako inzulín z prasačích buniek  TRANSLÁCIA Konečný proces prenosu GI z génu do P Prebieha na ribozómoch v cytoplazme čítaním (prekladom) GK zapísaného v mRNA za účasti tRNA prinášajúcej jednotlivé AMK Na ribozómoch prebieha polymerizácia AMK do polypeptidového reťazca – proteosyntéza Translácie sa zúčastňujú okrem tRNA aj ribozómové RNA  Translácia Funkčná jednovláknová RNA - 75 - 95 nukleotidov, Okrem typických RNA nukleotidov má aj neobvyklé nukleotidy - vznikajú cielenou post-transkripčnou modifikáciou štandardných nukleotidov. tRNA - "ďatelinový štvorlístok". Jednotlivé "lístky" sú zložené z tzv. palindrómov. Sú to také nukleotidové sekvencie (RNA alebo DNA), ktoré sú symetrické tak, že bázy od osi symetrie smerom doľava sú komplementárne k bázam nachádzajúcim sa vpravo od osi symetrie  Translácia Umožňuje to na jednovláknovej molekule tvoriť vnútromolekulové spojenia, ktoré lokálne tvoria dvojvláknový úsek = vlásenka (angl. hairpin). Ak sa v strede palindrómu, t.j. v oblasti stredu symetrie nachádzajú nukleotidy, ktoré sa nevedia takýmto spôsobom popárovať, na konci vlásenky sa tvorí jednovláknová slučka (angl. loop). Takýmto prípadom vlásenky so slučkou (angl. hairpin loop) sú aj "lístky" tRNA, ktoré sa označujú ako ramená  Sekundárna štruktúra tRNA akceptorové rameno (bez slučky - CCA) na jeho koniec sa viaže AMK antikodónové rameno s antikodónovou slučkou týmto koncom tRNA rozoznáva GK zapísaný v mRNA pseudouridínové rameno s TΨC- slučkou obsahuje modifikovaný uracil - pseudouracil dihydrouridínové rameno s D-slučkou obsahuje modifikovaný uracil - dihydrouracil variabilná slučka Krátka (tRNA I) alebo dlhá (tRNA II) neovplyvňuje biologickú funkciu tRNA  Translácia Obidva konce RNA (3' aj 5') sa nachádzajú v akceptorovom ramene tRNA. Na každú tRNA sa pripája len jedna AMK, a to na posledný adenín 3'-konca tRNA, ktorá končí jednovláknovou prečnievajúcou sekvenciou 5'-CCA-3'. Pre každú z 20 proteínogénnych AMK existuje osobitný enzým - aminoacyl- tRNA-syntetáza, ktorý vytvára kovalentnú väzbu medzi tRNA a jej príslušnou AMK.  Touto časťou tRNA viaže príslušné AMK Zaradenie AMK do polypeptidového reťazca je dané pomocou 3 za sebou idúcich nukleotidov = kodón. Genetický kód je teda systém pravidiel, podľa ktorých jednotlivé kodóny určujú zaradenie štandardných AMK do polypeptidového reťazca Kodóny v mRNA nerozpoznávajú priamo AMK. Translácia mRNA do P závisí na tRNA, ktorá sa spáruje s kodónom na mRNA. Na tRNA je naviazaná AMK - aminoacyl- tRNA. Touto časťou sa páruje s kodónom v mRNA  Translácia 1. Aktivácia AMK – tvorba aminoacyl -tRNA 2. Tvorba komplexu aktivovanej AMK s tRNA 3. Transport komplexu do ribozómu 4. Iniciácia (zahájenie proteosyntézy) 5. Elongácia (predlžovanie peptidového reťazca) 6. Terminácia (ukončenie proteosyntézy) 7. Postranslačné úpravy P Aminoacyl-tRNA Antikodón sú tri nukleotidy komplementárne ku kodónu v mRNA Na 3'-koniec (vždy končí sekvenciou CCA) je 5' naviazaná AMK 3' Terciálna štruktúra tRNA – aktivácia AMK Biologická funkcia tRNA až v terciárnej štruktúre. Osobitne pre každú z 20 (23) AMK Aktivácia – naviazanie AMK s tRNA katalyzuje aminoacyl-tRNA-syntetáza Vytvára kovalentnú väzbu medzi tRNA a jej príslušnou AMK Rovnaké AMK môžu byť spájané s rôznymi tRNA, ale rovnaké tRNA viažu len jednu a tú istú AMK Aktivácia AMK Je predpokladom tvorby aminoacyl – tRNA Požadované komponenty: 20 proteinogénnych AMK 20 druhov enzýmu aminoacyl – tRNA – syntetáza 20 a viac druhov tRNA ATP Mg2+  Aminoacyl-tRNA-synthetáza Enzým, rozpozná a pripojí správnu AMK k tRNA za použitia energie z hydrolýzy ATP Vzniká vysokoenergetická väzba mezi tRNA a AMK. Aminokyselina (Tryptofán) O O O OH O Makroergická O H2N tRNA väzba H2N HN 2 N N N H ATP AMP + 2Pi H H A C C A C C Väzba kodonu k A C C Párovanie antikodónu báz Väzba AMK k tRNA U G G 5' 3' Aminoacyl-tRNA-synthetáza mRNA Aktivácia AMK Má 2 fázy: 1. Tvorba aminoacyladenylátu Mg2+ R – CH – COOH + ATP + E → R – CH – COO ~ AMP – E + PP (Pyrofosfát) | | NH2 NH2 aminoacyladenylát E = aminoacyl – tRNA – syntetáza Aktivácia AMK 2. Naviazanie na tRNA Mg2+ R – CH – COO ~ AMP – E + tRNA → R – CH – COO - tRNA + AMP + E | | NH2 NH2 Aminoacyl – tRNA Každá aminoacyl – tRNA – syntetáza má 3 vysoko špecifické väzobné miesta: pre AMK, tRNA a Mg2+ Translácia prebieha na ribozómoch E-miesto P-miesto A-miesto LSU katalyzuje vznik peptidovej väzby mezi AMK a Veľká polypeptidovým reťazcom. podjednotka SSU zodpovedá za nasadnutie Väzbové miesto E P A tRNA na kodón mRNA. Malá pre mRNA podjednotka aminoacylové miesto (A miesto) - tRNA s naviazanou AMK väzbové miesta pre pomocné peptidylové miesto (P miesto)- predlžovanie polypeptidového translačné proteíny reťazca práve o 1 AMK ďalšie miesta, na ktoré sa peptidyltransferázové miesto - tvorba peptidovej väzby viažu pomocné P (tzv. výstupné miesto pre deacylovanú tRNA (E miesto) - tRNA faktory) urýchľujúce a odovzdá svoju AMK, odchádza z ribozómu v tomto mieste regulujúce proces proteosyntézy Iniciácia syntézy polypeptidového reťazca Požadované faktory: mRNA formyl – metionyl – tRNA (u eukaryotov metionyl – tRNA) iniciačný kodón mRNA: AUG 30S podjednotka ribozómu (u eukaryotov 40S) 50S podjednotka ribozómu (u eukaryotov 60S) GTP Mg2+ Faktory iniciácie: IF1, IF2, IF3 (u eukaryotov eIF1 – eIF9) – P s rôznymi funkciami Iniciácia je založená na tvorbe iniciačného komplexu: Met Iniciácia translácie 30S podjednotka ribozómu sa viaže na IF3 (u eukaryotov elF1-6) iniciačná - dochádza k disociácii ribozómu na podjednotky tRNAMet Na základe komplementarity Shine-Dalgarovej sekvencie ku 16S P rRNA sa na 30S podjednotku viaže 5´koncom mRNA. Vodítkom správneho naviazania je čiapočka. Malá ribozomálna IF2 viazaný s GTP a fmet – tRNA (u bakterií N– podjednotka formylmethionyl–tRNA (fMet–tRNAiMet) u eukaryotov (Metionin Met-tRNA) sa viaže na mRNA 5' AUG 3' mRNA  Iniciácia translácie Pripojenie GTP k IF2 umožní väzbu tohoto komplexu s mRNA a iniciačným Met– tRNA = iniciační komplex 30S.IF3.mRNA.IF1.IF2.fMet–tRNA.GTP. Súčasne sa uvoľnia faktory IF1, IF2, IF3 a hydrolyzuje GTP na GDP a fosfát. Met–tRNAiMet obsadí na ribozóme tzv. peptidylové miesto P. Miesto A, je určené k väzbe ďalšej aa–tRNA - kodón následujúci za AUG. Met P A AUG 5' mRNA 3'  Iniciácia translácie SSU sa viaže na 5'-koniec mRNA pohybuje se ve smere 5' → 3' a hľadá kodón AUG, který je rozpoznaný antikodónom iniciačnej tRNA. Po rozpoznaní iniciačného kodónu sa pripojí Velká ribozomálna veľká ribozomálna podjednotka. podjednotka LSU aa2 Iniciačná tRNA sa viaže do P-miesta, predlžovanie reťazca začína naviazaním druhej tRNA s AMK do A-miesta. AUG 5' 3' Malá ribozomálna podjednotka SSU mRNA  Iniciácia translácie V ďalšom kroku dochádza k vzniku peptidovej väzby medzi Met a prichádzajúcou AMK (aa2). Ribozóm sa posunie o 3 nukleotidy pozdĺž mRNA tRNA bez naviazanej AMK sa uvoľní z E-miesta a tRNA z A-miesta sa prenesie do P-miesta. aa3 Met Met aa2 aa2 E P A E P A 5' AUG 3' AUG mRNA  Elongácia translácie Požadované faktory: Funkčný 70S ribozóm (80S u eukaryotov) Všetky druhy aminoacyl – tRNA, ktoré zodpovedajú kodónom na mRNA Mg2+ GTP Faktory elongácie: EF-Tu, EF-Ts, EF-G (u eukaryotov EF1-EF2) Enzým peptidyltransferáza  Elongácia translácie Prvý krok: aminoacyl-tRNA je naviazaná do A-miesta spolu EF-Tu + GTP. Potom dochádza ku hydrolýze GTP a uvoľneniu Tu-GTP z ribozómu za pomoci EF-Ts. Druhý krok: vznik peptidovej väzby za pomoci peptidyltransferázy. Tretí krok: TRANSLOKÁCIA - ribozóm sa posunie pomocou GTP a EF-G o 3 nukleotidy, tRNA bez AMK sa uvoľní z E-miesta, tRNA z A-miesta sa prenesie do P-miesta NH2 aa1 aa2 aa4 aa3 E P A 5' 3' mRNA  Rostoucí peptidový řetězec aa4 NH2 aa1 aa2 aa3 Elongácia translácie 5' E P A mRNA 3' NH2 aa1 aa2 aa3 aa4 E P A mRNA je prekladaná v smere 5' → 3' 5' mRNA 3' najprv vzniká N-koniec proteínu (polypeptidový reťazec rastie smerom od N-konca k C-koncu). NH2 aa1 aa2 aa3 aa4 Posun o tři nukleotidy E P A Celý cyklus 3 krokov je opakovaný kým ribozóm 5' mRNA 3' nenarazí na stop-kodón. aa5 NH2 aa1 aa2 aa3 aa4 E P A 5' mRNA 3' NH2 aa1 aa2 aa3 aa4 aa5 tRNA E P A 5' mRNA 3' Terminácia translácie Požadované faktory: ATP GTP Terminačné kodóny na mRNA: UAG, UGA, UAA Terminačné faktory: RF1, RF2, RRF  Terminácia translácie Koniec P je signalizovaný prítomnosťou stop kodónu (UAA, UAG alebo UGA). do A-miesta se viaže uvolňovací faktor namiesto AMK sa viaže molekula vody uvoľní sa C-koniec polypeptidového reťazca z tRNA v P-mieste NH2 Uvolňovací faktor aa1 aa3 aa2 aa4 aa5 E P A 5' 3' UAA mRNA  Terminácia translácie Proteín sa uvolňuje do cytoplazmy. H2O NH2 aa1 aa3 aa2 aa4 aa5 COOH E P A 5' 3' UAA mRNA  Terminácia translácie mRNA se odpojí od ribozómu Dôjde k disociácii oboch podjednotiek ribozómu 5' UAA 3' mRNA  ENERGETIKA CYKLU Proteosyntéza – energeticky veľmi náročný proces - pre vznik jednej peptidovej väzby: 4 molekuly makroergných fosfátov: 2 ATP – pro aktiváciu, 2 GTP – pre posun - pre syntézu 200-300 g P/24 hod. – je treba cca 10% všetkého bazálne vyprodukovaného ATP Ďakujem za pozornosť 