Struttura e funzione delle proteine PDF

Struttura e funzione delle proteine  Struttura e funzione delle proteine - Le proteine (dal greco proteios, primo posto) sono le molecole più complesse e variate degli organismi  Struttura e funzione delle proteine - Svolgono la maggior parte delle funzioni cellulari - La sua funzione è stret...

Struttura e funzione delle proteine  Struttura e funzione delle proteine - Le proteine (dal greco proteios, primo posto) sono le molecole più complesse e variate degli organismi  Struttura e funzione delle proteine - Svolgono la maggior parte delle funzioni cellulari - La sua funzione è strettamente correlata alla sua struttura (forma), entrambe si sono perfezionate lungo miliardi di anni di evoluzione molecolare Struttura e funzione delle proteine  Struttura e funzione delle proteine LA STRUTTURA DELLE PROTEINE Le proteine sono catene di amminoacidi, che possono essere di 20 tipi diversi, legati da legame peptidico, combinati seguendo le istruzioni codificate nel DNA. Le catene più corte si chiamano peptidi, e quelle più lunghe polipeptidi. La catena peptidica ha una ‘ossatura’ di base, fatta dagli atomi centrali degli amminoacidi che si ripetono in maniera continuata uniti dal legame peptidico, dalla quale sporgono la catene laterali di ogni amminoacido, diverse fra di loro e responsabili delle proprietà di ogni amminoacido e della proteina nel suo insieme. H NH3 C COOH R  Struttura e funzione delle proteine I 20 amminoacidi a seconda della sua polarità Le proteine hanno una carica elettrica netta legata al numero di aa provvisti di carica positiva e negativa. A pH fisiologico, i gruppi -R di diversi aminoacidi sono ionizzati e quindi dotati di carica: aa acidi: carica negativa aa basici: carica positiva Si definisce il punto isoelettrico come il valore del pH al quale la proteina ha carica elettrica netta uguale a zero. aa ACIDI aa BASICI Struttura e funzione delle proteine Ammino-terminale Carbossi-terminale o N-terminale o C-terminale Legame peptidico Ossatura polipeptidica Catena laterale polare Catena laterale apolare > Quante proteine si possono fare? 20 aminoacidi: 20n combinazioni possibili (n = numero di aa nella catena) Un peptide di 4 aa: 204 = 20 x 20 x 20 x 20 = 160.000 combinazioni diverse! > Quali sono le dimensioni delle proteine cellulari? catene di 50 a 50.000 aminoacidi 2050  20n  2050.000 combinazioni diverse possibili Una proteina di dimensioni medie: 300 aa: 20300 possibilità! Gli analisi di proteomica (studio di tutte le proteine contenute in un campione) mostrano però che il numero di proteine diverse è più contenuto: Escherichia coli  2.000 - 3.000 Drosophila melanogaster  5.000 Homo sapiens  60.000 – 100.000 restrizioni di tipo conformazionale (struttura tridimensionale della proteina) evoluzione molecolare: selezione delle proteine con proprietà idonee a svolgere una funzione La prima proteina a essere sequenziata è stata l’insulina, grazie al biochimico britannico Frederick Sanger: Sanger scelse l’insulina per ragioni pratiche: ce n’era tanta a disposizione, perché l’ormone veniva estratto dal maiale per curare i malati di diabete. Il “metodo a incastro” che Sanger ideò consisteva nel rompere l’insulina in pezzi maneggevoli per i sistemi di analisi disponibili allora, per poi rimettere gradualmente insieme i pezzi. Sanger impiegò dieci anni. Quando finì, nel 1953, aveva ottenuto non soltanto la sequenza esatta degli amminoacidi dell’insulina, ma anche le differenze, piccole ma significative, fra le insuline delle diverse specie di mammifero. Per questi risultati meritò il premio Nobel per la Chimica nel 1958. Ventidue anni dopo Sanger vinse di nuovo il Nobel per avere scoperto un modo di stabilire l’ordine dei nucleotidi nel DNA. Un adattamento di questa procedura, conosciuto come metodo di sequenziamento di Sanger, è stato usato per leggere il DNA nel progetto genoma umano.  Struttura e funzione delle proteine Le proteine sono molto diverse: possono avere da 30 a più di 10.000 aa, con tante forme diverse. Ad oggi, grazie al sequenziamento del DNA, si conoscono le sequenze amminoacidiche di moltissime proteine, e grazie alla cristallografia di raggi X e alla risonanza magnetica nucleare si conoscono anche tante delle loro strutture tridimensionali. Due motivi basici della struttura proteica, molto comuni perché dovuti a interazioni fra gruppi N-H e C=O della ossatura polipeptidica: 1. L’elica alfa -elica  Struttura e funzione delle proteine L’elica è una struttura frequente nella biologia, si forma facilmente quando le unità di una catena si legano a intervalli regolari. L’elica alfa è destrorsa. Tante proteine cellulari hanno questo motivo strutturale: Elica superavvolta  Struttura e funzione delle proteine 2. Il foglietto beta  Struttura e funzione delle proteine Il foglietto beta si forma per legame a idrogeno fra tratti di catena paralleli fra di loro (filamenti), con orientamento (N C) eguali o alternanti: foglietti beta: antiparalleli paralleli Possono formare il nucleo rigido di una proteina, o domini funzionali de diversi tipi.  Struttura e funzione delle proteine I ponti a idrogeno stabilizzano la struttura dell’elica alfa e del foglietto beta  Struttura e funzione delle proteine I livelli di organizzazione delle proteine: - Struttura primaria: la sequenza amminoacidica della catena polipeptidica. - Struttura secondaria: elica alfa e foglietto beta. - Struttura terziaria: conformazione stabile finale di una catena polipeptidica, compressi struttura secondaria e tutte le connessioni, giri, anse, etc. > Dominio proteico: una parte della proteina in grado di raggiungere da sola una struttura stabile, e tante volte funzionale, in maniera indipendente al resto della catena polipeptidica.  Struttura e funzione delle proteine - Struttura quaternaria: associazione fra più di una catena per conformare una proteina funzionale. Le catene interagiscono grazie a la formazione di numerosi legami deboli, che insieme sono forti. Ogni catena indipendente è una subunità, la proteina finale è multimerica (dimero, trimero, etc). Le superficie di contatto con altre molecole, non solo con proteine, sono i siti di legame: per altre proteine, per substrati, per molecole che modificano l’attività della proteina, etc.  Struttura e funzione delle proteine - Nella struttura quaternaria, le diverse catene proteiche si possono associare tramite legami disolfuro. Esempio: gli anticorpi  Struttura e funzione delle proteine Le proteine del ambiente extracellulare hanno un altro rinforzo per mantenere la loro struttura nelle condizioni all’esterno della cellula: i legami disolfuro (S-S) fra i gruppi solfidrilici (-SH) di due cisteine. Questi possono rinforzare la struttura terziaria di una catena polipeptidica o legare fra di se più di una catena per fare una proteina unica. Struttura terziaria Struttura terziaria Unico dominio Tre domini Ovalbumina Actina  Struttura quaternaria Struttura quaternaria Proteina multimerica con quattro proteine Più proteine associate fra di loro legate covalentemente (6 subunità) Emoglobina (4 subunità) Immunoglobulina (anticorpo)  Struttura e funzione delle proteine Le catene peptidiche sono molto flessibili, gli atomi possono girare intorno al legame peptidico, e così le catene si possono piegare in qualsiasi direzione, ma questo processo viene condizionato dalle interazioni non covalenti che si formano quando gli amminoacidi si avvicinano. I legami non covalenti sono deboli, ma insieme sono forti. Si formano diversi tipi: L’interazione idrofoba Polipeptide srotolato Conformazione ripiegata in ambiente acquoso Legami a idrogeno Attrazioni elettrostatiche Attrazioni di van der Waals Attrazioni Legame a idrogeno elettrostatiche Attrazioni di van der Waals  Struttura e funzione delle proteine La forma tridimensionale che adotta una proteina è la sua conformazione, e il processo di acquisizione di questa forma è il ripiegamento. Il ripiegamento di una catena peptidica è quello che porta allo stato di minima energia libera (∆G) per la proteina, rendendola stabile nel ambiente cellulare; avviene grazie ai legami non covalenti, inclusi i legami a idrogeno che si stabiliscono: Legami a Legami a Legami a idrogeno tra gli idrogeno tra gli idrogeno tra gli > tra gli atomi della ossatura, atomi della atomi della atomi delle > tra gli atomi della ossatura e ossatura ossatura e delle catene laterali quelli delle catene, catene laterali > e tra quelli delle cantene laterali.  Struttura e funzione delle proteine La conformazione finale della proteina a volte permette certi cambiamenti conformazionali che sono importanti per la funzione della proteina.  Struttura e funzione delle proteine Per azione di solventi, detergenti, radiazione e/o calore, che sfanno i legami della struttura terziaria, la proteina si può srotolare tornando alla struttura primaria: proteina denaturata (perde la forma nativa), e in questo modo perde anche la funzione.  Struttura e funzione delle proteine Il processo di ripiegamento si studia in laboratorio usando proteine modello purificate. Si possono srotolare con agenti denaturanti come l’urea, che rompe i legami deboli, e poi si toglie l’urea e si studia il ripiegamento che avviene in maniera spontanea in soluzione acquosa.  Struttura e funzione delle proteine Il ripiegamento segue sempre il percorso verso il minimo d’energia, solitamente funziona, ma a volte ci sono errori di ripiegamento. ENERGIA LIBERA  Struttura e funzione delle proteine Le proteine chaperon aiutano la proteina in ripiegamento a raggiungere la conformazione corretta, con il minor livello energetico, rendendo più efficiente il ripiegamento. Possono agire in due modi diversi:  Struttura e funzione delle proteine Quando il ripiegamento non va bene: malattie del ripiegamento delle proteine Morbo della mucca pazza (encefalopatia spongiforme bovina), malattia neurologica degenerativa  Struttura e funzione delle proteine La forma che assume la proteina nella sua conformazione tridimensionale è importante per l’interazione con altre proteine e per l’attività da svolgere (struttura- funzione). Ci sono proteine globulari (più o meno sferiche) e fibrillari (allungate).  Struttura e funzione delle proteine L’interazione fra proteine può creare strutture proteiche molto grandi e complesse  Struttura e funzione delle proteine Quattro maniere diverse di rappresentare una proteina Ossatura A nastro A filo A spazio ramificato pieno  Struttura e funzione delle proteine Una considerazione evolutiva: combinando 20 amminoacidi in catene di longitudine variabile si potrebbero fare un numero altissimo di proteine diverse, ma non esistono: l’evoluzione ha selezionato lungo milioni d’anni soltanto le proteine che si ripiegano in una conformazione stabile e sono efficienti nella loro funzione. Certe proteine sono comparse molto presto nella istoria della vita e si sono conservate quassi intatte in organismi separati da miliardi d’anni di evoluzione.  Struttura e funzione delle proteine Un’altra considerazione evolutiva: una volta che si trova una proteina utile, piccoli cambiamenti possono dare origine a proteine molto simili pero con funzioni diversificate, formando una famiglia di proteine, di sequenza e/o struttura simile, con funzioni correlate pero non identiche. Ad esempio, la famiglia delle proteasi a serina: Verde: aa conservati; rosso: centro attivo a Ser  Struttura e funzione delle proteine LA FUNZIONE DELLE PROTEINE La attività delle proteine dipende fondamentalmente da due aspetti: - La loro struttura, molto importante per definire i siti di legame ad altre molecole: tasche per il substrato, superfici a incastro con altre proteine, etc. - Le catene amminoacidiche nei siti attivi, che partecipano alle funzioni chimiche delle proteine. Il legame ad altre molecole è molto importante per la funzione, ed è caratterizzato da: - una forte specificità: interazione molto selettiva - l’affinità: una misura della forza del legame (tramite legami deboli). In genere, le molecole che si legano alle proteine sono ligandi.  Struttura e funzione delle proteine La forza della interazione fra proteina e ligando dipende di quanti legami deboli si possano formare fra le superfici di contatto (affinità), e questo a sua volta di quanto incastrano bene quelle superfici (specificità). affinità specificità Alcune interazioni richiedono pochi legami: il substrato si deve slegare velocemente dopo la reazione; altre richiedono molti legami per durare nel tempo: formazione di un complesso macromolecolare, come il ribosoma.  Struttura e funzione delle proteine Il sito di legame si forma grazie al ripiegamento della proteina, e può portare vicini amminoacidi importanti per la funzione anche se sono lontani nella sequenza primaria della proteina.  Struttura e funzione delle proteine L’attività delle proteine si può modificare per legame di molecole molto variate. - Tanti farmaci agiscono inibendo l’attività di un enzima: l’aspirina (acido acetilsalicilico) inibisce la cicloossigenasi, un enzima che partecipa alla produzione delle prostaglandine, i messaggeri del dolore. - Tante proteine hanno bisogno di un gruppo non proteico funzionale per la sua attività: ad esempio il gruppo eme della emoglobina. - Molte di queste molecole sono vitamine: il nostro organismo non le sintetiza, ma ne ha bisogno per certe attività enzimatiche: il retinale della rodopsina (proteina sensibile alla luce, nelle cellule della retina) si sintetizza partendo dalla vitamina A. Retinale Eme  Struttura e funzione delle proteine Regolazione della attività delle proteine. Ci sono diversi meccanismi per regolare l’attività delle proteine, in modo di avere la quantità giusta di ogni attività per il bisogno della cellula. La regolazione in generale può essere positiva o negativa. 1. Regolazione della quantità di proteina: si regola proprio la produzione della proteina, a livello della espressione del gene (trascrizione e traduzione). 2. Meccanismi di feedback positivo o negativo: sono tipici regolatori dell’attività enzimatica. Un prodotto di una via metabolica è in grado di attivare (feedback positivo) o inibire (feedback negativo o inibizione retroattiva) un enzima della via metabolica a monte del prodotto stesso.  Struttura e funzione delle proteine 3. Meccanismi allosterici. Tanti enzimi hanno più di un sito di legame. Il legame di una molecola diversa del substrato in un sito diverso del centro attivo induce dei cambiamenti conformazionali che favoriscono o inibiscono il legame del substrato. Sono enzimi allosterici, hanno più di una conformazione stabile, e ogni conformazione ha un livello di attività diverso.  Struttura e funzione delle proteine 4. La fosforilazione. Il legame di un gruppo fosfato (o più di uno) a una proteina può modificare la sua conformazione e così la sua attività, in maniera positiva o negativa. L’aggiunta del gruppo fosfato è catalizzata da un enzima chiamato proteina chinasi, di solito molto specifica per la proteina che si fosforila. La rimozione del gruppo fosfato è operata da un enzima chiamato fosfatasi, a volte di tipo generico a volte molto specifico per una proteina o famiglia di proteine.  Struttura e funzione delle proteine 5. Legame a GTP. Molte proteine legano guanosina trifosfato nello stato attivo, e tornano inattive idrolizzando loro stesse il GTP a GDP (attività GTPasica). L’attività si ricupera per scambio del GDP con GTP, mediato d’altre proteine (GEF: GTP exchange factors). Nelle proteine che legano GTP, la idrolisi a GDP provoca un cambiamento conformazionale importante per la funzione della proteina. Struttura e funzione delle proteine EF-Tu Tecniche di studio delle proteine COME SI STUDIANO LE PROTEINE Le proteine sono un chiaro esempio di relazione tra struttura e funzione. Conoscere la struttura ci può aiutare a capire la funzione (o il meccanismo di funzionamento), e in vece conoscere la funzione di un dominio proteico ci può aiutare a capire la sua struttura, visto che tante volte questa è conservata per certi domini funzionali. Per studiare una proteina bisogna averne una grande quantità in stato puro. La fonte di proteina può essere: - Il tessuto dove è più abbondante. - Una fonte cellulare creata per tecnologia del DNA ricombinante: colture di batteri o cellule eucariotiche, dove si producono proteine ricombinanti. Tecniche di studio delle proteine Tecniche di omogeneizzazione Ultrasuoni Detergenti Pressione Tritatura Tecniche di studio delle proteine La centrifuga. Rotore ad angolo fisso o rotore basculante. Separazione in surnatante e sedimento. Tecniche di studio delle proteine Mettere le proteine al nostro servizio Tecniche di studio delle proteine Determinare il ripiegamento di una proteina, creare nuove proteine