Proteine III - SDS-PAGE PDF

Proteine III dirk schmidt-arras UV Molekulare Biologie und Biochemie tumour immunology lab [email protected] +43 662 8044 5553  Ziele des P...

Proteine III dirk schmidt-arras UV Molekulare Biologie und Biochemie tumour immunology lab [email protected] +43 662 8044 5553  Ziele des Praktikums Proteinanalytische Methoden Rechnen mit Protein- konzentrationen Durchführung Elektrophorese (SDS-PAGE) Proben- Protein- Färbe- und Nachweis- Vorbereitung Detektion methoden (Mw-Bestimmung) SDS-PAGE UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 2/45  “Blut ist ein ganz besonderer Saft” Mephisto in Goethes Faust UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 3/45  Blut Blutplasma ist der flüssige, zellfreie Teil des Blutes. Nach der Blutabnahme wird Blutplasma durch Abscheiden der Blutzellen durch Zentrifugation gewonnen. Gerinnung ist gehemmt (EDTA, Citrat) Es enthält noch alle Gerinnungsfaktoren. Blutserum ist der flüssige, zellfreie Teil des Blutes abzüglich der Gerinnungsfaktoren (vor allem Fibrinogen). Nach der Blutabnahme wird die Gerinnungsreaktion nicht unterbunden danach wird der Blutkuchen (enthält Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten) durch Zentrifugation vom Serum getrennt. UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 4/45  Plasmaproteine Plasmaproteine ca. 100 verschiedenen Proteine im Blutplasma; aus Leber und Lymphknoten Gesunder Organismus: dynamisches Gleichgewicht zwischen Biosynthese und Abbau von Plasmaproteinen Hypoproteinämie zu niedriger Plasmaproteinspiegel 83 g/L vermehrte Biosynthese meist klonale Expansion von γ-Globulin produzierenden Plasmazellen UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 5/45  Plasmaproteine Proteinanalytische Methoden Bestimmung der gesamten Proteinkonzentration besitzt nur beschränkte Aussagekraft Auftrennen der Plasma- proteine in Einzelfraktionen diagnostische Hinweise Grundsätzlich kann man Plasmaproteine in 5 Fraktionen trennen: Albumin α1-Globuline α2-Globuline β-Globuline γ-Globuline UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 6/45  Plasmaproteine Albumin gebildet von Hepatozyten macht 60% der Plasmaproteine aus 40% des Albumins im Plasma 60% des Albumins im Extrazellulärraum hohe Fähigkeit zur Wasserbindung -> wichtiger Regulator des kolloid- osmotischen Drucks Transportvehikel für Pharmaka Albumin Vitamine, Magnesium, Calcium, www.PDP.org, 1E7H nicht- veresterte Fettsäuren, Spurenelemente, Abbau- und toxische Produkte im Blut UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 7/45  Plasmaproteine α1-Globuline Ca. 4% der Plasmaproteine Wichtigster Vertreter ist α1-Antitrypsin als Proteaseinhibitor Saures α1-Glycoprotein -> Akut-Phase-Protein α2-Globuline Ca. 6% der Plasmaproteine Wichtigste Vertreter α2-Makroglobulin Haptoglobin UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 8/45  Plasmaproteine – α1/2-Globuline Häm Haptoglobin Hämoglobin gebildet von Hepatozyten α2-Globulin Haptoglobin Haptoglobin bindet und transportiert Hämoglobin verhindert Fe-Ausscheidung über die Niere Serumkonzentration sinkt ab bei Hämolyse (Abtransport!) Hämoglobin norm.: 0.5-2.5 g/L empfindlichster Marker für Hämolyse! Häm entzieht Häm als Substrat für Bakterien Akute-Phase-Protein www.wikipedia.org UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 9/45  Plasmaproteine – α1/2-Globuline interne Schnitt- α1-Antitrypsin α1-Antitrypsin stelle hemmt breites Spektrum an Proteasen (incl. Trypsin Neutrophilen-Elastase) Serpin (Ser protease inhibitor) Akute-Phase-Protein α1-Antitrypsinmangel Prävalenz 1:2.000 Z-Form (slow migrating) 95% aller Mutationen Glu342Lys Aggregation im ER erhöhtes Risiko für Leberzirrhose Lungenemphysem bei Abfall Akut-Phase-Protein α2-Globuline Ca. 6% der Plasmaproteine Wichtigste Vertreter α2-Makroglobulin Haptoglobin β-Globuline Transferrin (Fe-Transport) Fibrinogen (Gerinnung) C-reaktives Protein (CRP) β-Lipoprotein (Lipidtransport) Faktoren des Komplement-systems UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 11/45  Plasmaproteine – β-Globuline Transferrin Eisentransport 2x Fe3+ pro Transferrin- Molekül Aufnahme über Transferrin- Rezeptor www.wikipedia.org RCSB database UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 12/45  Plasmaproteine – Akute-Phase Proteine Akute-Phase-Proteine Akute-Phase-Proteine (APP) sind Bestandteile der angeborenen Immunität in der akuten Phase einer Infektion steigt Plasma- konzentration an APPs massiv an sinkt die Plasma- konzentration an Albumin www.wikipedia.org UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 13/45  Plasmaproteine – Akute-Phase Proteine Akute-Phase-Proteine APPs haben verschiedenen Funktionen: lokale Gerinnung Abtransport von Eisen/Häm (Haptoglobin, Hämopexin) Opsonisierung von Erregern (CRP, Complement) Eindämmung freigesetzter Proteinasen Modulation der adaptiven Immunantwort UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 14/45  Plasmaproteine – Akute-Phase Proteine CRP C-reaktives Protein (CRP) Akute-Phase-Protein steigt bei Entzündungen um das 10-1000 fache an Oppsonisierung von Bakterien UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 15/45  Plasmaproteine – Akute-Phase Proteine Interleukin-6 (IL-6) die inflammatorischen Zytokine IL-1, IL-6 und TNFα werden am Ort der Entzündung von Makrophagen sezerniert IL-1, IL-6, TNFα stimulieren Hepatozyten zur Bildung der Akute-Phase Proteine UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 16/45  Plasmaproteine – Akute-Phase Proteine Interleukin-6 (IL-6) Hauptinduktor für Akute- Phase-Proteine auf Zielzellen bindet IL-6 an den IL-6R und dann an die Defekt in IL-6R signalgebende Untereinheit gp130 Patienten mit Mutationen in gp130 oder IL-6R zeigen defiziente Induktion an Akute-Phase Proteinen Spencer et al. 2019 Defekt in gp130 Schwerd et al. 2017 UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 17/45  Plasmaproteine – γ-Globuline Immunglobuline γ-Globuline=Immunglobuline, Antikörper Immunglobulin-Klassen: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE γ-Globuline werden von zu Plasmazellen ausgereiften B- Zellen produziert. Sie zirkulieren im Blut, befinden sich aber auch an der Oberfläche von allen B- Lymphozyten, wo sie als B- zellrezeptoren für Antigene wirken. www.studymed.at Janeway: Immunologie UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 18/45  Plasmaproteine – γ-Globuline Immunglobuline Aufbau: schwere Kette (heavy chain) leichte Kette (light chain) variable Regionen beider Ketten (VH+VL) bilden Antigenbindestelle konstante Region kann über Rezeptoren z.B. auf Mastzellen gebunden werden (Fc-Rezeptoren) Janeway: Immunologie UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 19/45  Plasmaproteine – γ-Globuline Immunglobuline binden Antigene und vermitteln dadurch Neutralisation Opsonisierung Aktivierung Komplement- system UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 20/45  Elektrophorese klinische Diagnostik bei der Serumprotein- Elektrophorese wird Blutserum elektrophoretisch aufgetrennt: Gelelektrophorese Kapillarelektrophorese Nach der elektrophoretischen Auftrennung kann man 5 gefärbte Banden (Albumin und Globuline) erkennen. Albuminfraktion stellt homogene Substanz dar andere Fraktionen: Überlagerung verschiedener Proteine mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften www.med4you.at UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 21/45  Elektrophorese klinische Diagnostik Quantifizierung von Banden α-Globuline (α1-AT, A2MG) und β-γ-Interzone (CRP) erhöht bei akuten Infektionen γ-Fraktion erhöht z.B. bei multiplem Myelom www.med4you.at UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 22/45  Elektrophorese Elektrophorese Definition: ist die Wanderung von verteilten Teilchen relativ zu einer Flüssigkeit unter dem Einfluss eines räumlich einheitlichen elektrischen Feld Technik wird intensiv zur Analyse von DNA, RNA, und protein verwendet für die Trennung von Makromolekülen der Größe nach Positiv geladene Moleküle ► Kathode Negativ geladene Moleküle ► Anode die Mobilität von Molekülen im elektrischen Feld hängt ab von... Form und Größe Netto-Ladung Porengröße der Gelmatrix elektrischem Feld Reibung UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 23/45  Elektrophorese – SDS-PAGE sample protein protein preparation separation transfer & detection UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 24/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Probenvorbereitung Zelllyse Ablösen der Zellen und Waschen in physiologischem Puffer, um Mediumreste zu entfernen Auflösen der Zellmembran: Ruptur (Sonicator, Dounce Homogenisator, Bead mill, …) Detergenzien Auflösen der Membran Solubilisierung von Membranproteinen in Mizellen UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 25/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Probenvorbereitung Proteindenaturierung SDS ist ein anionisches Tensid, das in vielen Hygiene- und Reinigunsmitteln verwendet wird SDS löst nicht kovalente Bindungen in Proteinen auf – Protein- denaturierung Von Fdardel - Eigenes Werk, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php? SDS bindet im Überschuss an Proteine (ca. 1.4g SDS /1g Protein) curid=52471291 alle Proteine weisen in der Folge negative Ladung auf UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 26/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Probenvorbereitung β-Mercaptoethanol Dithiothreitol (DTT) Proteindenaturatierung β-Mercaptoethanol oder DTT werden zur Reduktion von Disulfidbrücken in Proteinen verwendet ►tertiäre und quartäre Strukturelement in Proteinen werden aufgelöst β-Mercaptoethanol hat höhere Flüchtigkeit (!), ist aber stabiler DTT (dithiothreitol) ist ein stärkeres Reduktionsmittel mit einem höheren Redoxpotential UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 27/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Proteintrennung Gelelektrophorese Biomoleküle werden getrennt aufgrund von Nettoladung Größe Migration durch eine poröse 3D-Matrix Stryer: Biochemie UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 28/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Proteintrennung PAGE polyacrylamide gel electrophoresis Polyacrylamid chemisch inert leicht in großen Mengen zu produzieren variable Porengröße Verhältnis zwischen monomeren Acrylamid und ‘Bis’-Acrylamid bestimmt die Porengröße der resultierenden Matrix kontinuierlicher Prozentsatz, typischer- weise 7.5, 10 oder 12% Gradientengele, typischer- weise 4-15%, 10-20% www.bio-rad.com UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 29/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Proteintrennung PAGE Mischung aus Acrylamid (monomer) N,N’-Methylenbis- acrylamid Radikal induziert quer- vernetzende Polymerisation APS (Ammonium- persulfate) TEMED (Katalysator) Stryer: Biochemie UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 30/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Proteintrennung Kontinuierliches Puffersystem gleicher Puffer bei konst. pH in Gel, Probe und Elektrodenreservoir unscharfe und ungetrennte Proteinbanden in SDS-PAGE selten für Proteinanalytik genutzt üblicherweise für Nukleinsäureanalyse verwendet UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 31/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Proteintrennung Diskontinuierliches Puffersystem entwickelt 1964 durch Ornstein & Davis* Gelmatrix unterteilt in Sammelgel, - grobporig Trenngel, - engporig heute häufig System nach Lämmli genutzt UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 32/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Proteintrennung Dicontinous buffer system entwickelt 1964 durch Ornstein & Davis* Gelmatrix unterteilt in Sammelgel, - grobporig Trenngel, - engporig Tris-Glycine System: unterschiedlicher pH der beiden Gele ist essentiell: niedriger pH: Cl- Leition hoher pH: Glyzin Leition Wechsel des Leitions verursacht stacking UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 33/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Proteintrennung Diskontinuierliches Tris-Glycine Bis-Tris Puffersystem Bis-Tris-System neutraler pH in Trenngel längere Haltbarkeit geringere Alkylierung, Desaminierung, Reoxidation als bei hohem pH schärfere Banden einfach zu handhaben 2 verschiedene Laufpuffer MES: Proteine mit niedrigem Mw MOPS: Proteine mit hohem Mw www.thermofisher.com UV Molekular Biologie und Biochemie – Proteine III: SDS-PAGE Dirk Schmidt-Arras 34/45  Elektrophorese – SDS-PAGE: Probentrennung running bu