Presentatie hoofdstuk 6 deel 2 PDF

Microbial Nutrition and Growth (2) Associaties en biofilms In de natuur leven organismen in associatie met verschillende soorten Antagonistische relaties Synergistische relaties Symbiotische relaties Biofilms Gemeenschappen van micro-organismen, samengesteld uit bacteriën en...

Microbial Nutrition and Growth (2) Associaties en biofilms In de natuur leven organismen in associatie met verschillende soorten Antagonistische relaties Synergistische relaties Symbiotische relaties Biofilms Gemeenschappen van micro-organismen, samengesteld uit bacteriën en/of schimmels van verschillende soorten, die zich op oppervlakten ontwikkelen. Vorming van slijmachtige laag die kleeft aan oppervlakten (tanden, rots, medische hulpmiddelen, …) Voordelen: ▪ Bescherming tegen schadelijke stoffen en invloeden ▪ Gezamelijke voedingsstoffen ▪ Uitwisselen van genetische informatie ▪ Meer pathogeen Biofilms Ontwikkelingsproces: Hechtingsfase Vermenigvuldiging en opbouw extracellulaire polymere substantie (EPS) of matrix Rijping (communicatie tussen micro-organismen dmv quorum-sensing) Verspreiding  Migrating Clumps of bacteria clump of adhering to surface bacteria Surface Water currents Water currents move, as shown by the blue arrow, among pillars of slime formed by the growth of bacteria attached to solid surfaces. This allows efficient access to nutrients and removal of bacterial waste products. Individual slime-forming bacteria or bacteria in clumps of slime detach and move to new locations. Quorum sensing Bacteriën kunnen met elkaar communiceren Gebruik van signaalmoleculen (quorum sensing moleculen) die vrijgegeven worden in de omgeving Bacteriën kunnen de concentratie van deze moleculen in de omgeving meten (via receptoren) en dus de celdensiteit Quorum sensing zorgt ervoor dat micro-organismen hun biochemie en vorm aanpassen Coördinatie van gedrag bij veranderingen in het mileu Quorum sensing Verhinderen van vorming biofilms Pathogene micro-organismen zijn vaak schadelijker wanneer ze deel uitmaken van biofilm → manieren zoeken om de vorming tegen te gaan Medicijnen die receptoren blokkeren Medicijnen die EPS afbreken … Culturing microorganisms Opgroeien van microorganismen Voedingsbodem (VB): medium dat nutriënten bevat voor microbiële groei Inoculum: de micro-organismen die geïnoculeerd of aangebracht worden in of op een voedingsbodem Cultuur: micro-organismen die groeien op of in een voedingsbodem Vloeibare VB (= broth) Vaste VB  Bacterium 6 Bacterium 7 Bacterium 5 Bacterium 8 Bacterium 4 Bacterium 9 Bacterium 3 Bacterium 10 Bacterium 2 Bacterium 11 Bacterium 1 Bacterium 12 Culturing microorganisms Inocula kunnen van verschillende bronnen afkomstig zijn Specimens uit de omgeving Uit rivierwater, bodem, lucht, voedsel, … Klinische specimens Uit patiëntenstalen Bewaarde specimens Clinical Specimens and the Methods Used to Collect Them Type or Location of Specimen Collection Method Skin, accessible membrane (including eye, outer ear, Sterile swab brushed across the surface; care should be taken not to nose, throat, vagina, cervix, urethra), or open contact neighboring tissues wounds Blood Needle aspiration from vein; anticoagulants are included in the specimen transfer tube Cerebrospinal fluid Needle aspiration from subarachnoid space of spinal column Stomach Intubation, which involves inserting a tube into the stomach, often via a nostril Urine In aseptic collection, a catheter is inserted into the bladder through the urethra; in the “clean catch” method, initial urination washes the urethra, and the specimen is midstream urine Lungs Collection of sputum either dislodged by coughing or acquired via a catheter Diseased tissue Surgical removal (biopsy) Het bekomen van reinculturen Een reincultuur is een verzameling micro-organismen die afstammen van één enkele cel (progenitor). Alle individuen in een reincultuur zijn identiek, dus klonen. De progenitor wordt ook colony forming unit (CFU) genoemd. 2 manieren om reinculturen te bekomen: Strijkplaat-methode Plaatgiet-methode Strijkplaat-methode Plaatgiet-methode Cultuurmedia / voedingsbodems Meerderheid van prokaryoten nog niet opgegroeid in cultuurmedium Vloeibare VB (= nutriënt broth) Vast VB (= nutriënt agar) Agar Complex polysacharide uit celwand rode algen Maakt VB vast Wordt niet gemetaboliseerd door MO Vervloeit bij 100°C Wordt vast bij 40°C Vaste agar smelt niet onder de 100°C Samenstelling voedingsbodems Basisbestanddelen: Water C-bron N-bron Energiebron Mineralen Eventuele groeifactoren Samenstelling voedingsbodems Peptonen Eiwitten geheel of gedeeltelijk gehydrolyseerd Hydrolyse door enzymen (pepsine, trypsine, trypsine + caseïne) Bevatten: C, N, P, S en mineralen Eiwitbronnen: Caseïne Gelatine Sojameel Vlees Samenstelling voedingsbodems Extracten uit gist, vlees of mout Gistextract Uit biergist Grote hoeveelheid vitamine B Bodem voor schimmels en bacteriën Vleesextract Uit mager vlees Inwerking van enzymen Bevat geen koolhydraten Moutextract Uit kiemend graan hoge concentraties maltose Bodem voor gisten en schimmels Soorten voedingsbodems Chemisch gedefinieerde media Complexe media Selectieve media Differentiële media Anaeobe media (Transport media) Chemisch gedefinieerde voedingsbodems De exacte chemische samenstelling is gekend Voorbeeld 1: Chemisch gedefinieerde voedingsbodems De exacte chemische samenstelling is gekend Voorbeeld 2: Complexe voedingsbodems Exacte chemische samenstelling is niet gekend Digesten van gisten, vlees, sojameel, of eiwitten zoals caseïne in melk Ondersteunen de groei van een brede waaier aan micro-organismen Worden ook gebruikt wanneer de nutritionele behoeften van het micro-organisme niet gekend zijn Vb. Tryptic soy agar (TSA) Complexe voedingsbodems TSA is Een universele of algemene, rijke voedingsbodem Een complexe voedingsbodem Samenstelling TSA In g/L Tryptonen 15.0 Soyapeptonen 5.0 Natriumchloride 5.0 Agar 12.0 Oplossen in 1L water, opkoken en autoclaveren Selectieve voedingsbodems Worden gebruikt om uit een mengflora welbepaalde soorten selectief te isoleren, met uitsluiting van de anderen Bevatten een aantal remmende stoffen om de groei van sommige soorten te verhinderen Eosine, methyleenblauw, kristalviolet, galzouten → inhiberen groei gram- positieve bacteriën Hoge NaCl concentratie → selecteert voor halofielen Antibiotica Stoffen die pH van bodem zuur maken Selectieve voedingsbodems Voorbeeld: Sabouraud dextrose agar (licht zure pH) Links algemene TSA bodem met daarop bodemstaal Rechts selectieve Sabouraud dextrose agar met daarop gelijkaardig bodemstaal Verrijkingsbodems Slechts één of een zeer beperkt aantal soorten kunnen erop groeien terwijl de anderen na verloop van tijd helemaal afsterven Soms worden gelijktijdig remmende factoren toegevoegd om ongewenste organismen te doen afsterven en speciale groeibevorderende factoren om de gewenste micro-organismen te stimuleren Koude aanrijking → aanrijken van een cultuur van koude-tolerante species zoals Vibrio cholerae Differentiële bodems Bevatten naast de normale voedingsbestanddelen ook nog welbepaalde substanties die door de bacteriën al dan niet kunnen verbruikt worden en die toelaten een visueel onderscheid te maken tussen de soorten bacteriën die op de bodem groeien. Onderscheid op basis van visuele veranderingen in het medium Onderscheid op basis van het uitzicht van de kolonies Het verbruik van deze welbepaalde substanties gaat vaak gepaard met een pH-verandering. Wanneer aan de bodem een indicator toegevoegd wordt, zal de kleuromslag aanduiden of de bacterie de substantie gemetaboliseerd heeft (zie voorbeeld 2) Differentiële bodems Voorbeeld 1: Het gebruik van bloedagar als differentiële bodem: Streptococcus pneumoniae (links) lyseert rode bloedcellen partieel (alfa-hemolyse), Streptococcus Pyogenes (midden) lyseert rode bloedcellen volledig (beta- hemolyse), Enterococcus faecalis lyseert geen rode bloedcellen (gamma-hemolyse) Differentiële bodems Voorbeeld 2: Het gebruik van welbepaalde koolhydraten (suikers) als C-bron Aan de buisjes werd een welbepaald koolhydraat toegevoegd samen met de pH indicator fenolrood (rood bij neutrale pH, geel bij zure pH) Wanneer de bacterie de suiker verbruikt (kan metaboliseren of vergisten) dan gaat dit gepaard met de productie van zure producten (medium kleurt geel). Selectief differentiële bodems Vele bodems zijn zowel selectief als differentieel: ze laten de groei toe van sommige soorten (selectief) en binnen de soorten die op de bodem groeien kan een onderscheid gemaakt worden (differentieel) Voorbeeld 1: Mac Conkey agar (MCA) is een selectief, differentiële bodem voor gram-negatieve bacteriën Selectief: aanwezigheid van galzouten en kristalviolet Differentieel: aanwezigheid van lactose en neutraalrood Kolonies worden rood wanneer de bacteriën lactose vergisten tot zure eindproducten Kolonies zijn geel-bruin bij niet vergisting Selectief differentiële bodems Voorbeeld 2: Mannitol Salt Agar (MSA) Samenstelling MSA In g/L pH 7.4 is een selectief, differentiële bodem peptonen 10.0 voor stafylokokken Vleesextract 1.0 Selectief: hoge zoutconcentratie van 7,5% Mannitol 10.0 Differentieel: aanwezigheid van mannitol en fenolrood Natriumchloride 75.0 Kolonies worden geel wanneer de bacteriën Fenolrood 0.025 mannitol vergisten of oxideren Kolonies zijn wit op een rose achtergrond als ze Agar 15.0 mannitol niet gebruiken Oplossen in 1L water, opkoken en autoclaveren Anaerobe voedingsbodems Gebruikt voor de kweek van anaerobe bacteriën Bevatten chemische stoffen die zuurstof binden Natriumthioglycolaat Vitamine C of ascorbinezuur Cysteïne Natriumformaldehydesulfoxalaat De bodems worden opgekookt om O 2 tijdelijk te verwijderen Speciale cultuursystemen Een anaeroob kabinet Culturen met weinig O2 Sommige organismen geven voorkeur aan een verlaagd O2 gehalte en verhoogd CO2 gehalte Capnofielen vereisen hogere CO2 condities Jar met kaarsje Speciale aanpassing van de broedstoof CO2 packet Bewaren van culturen Frigo / koelkast (4°C) Bewaring voor korte periode Diepvriezen (-50°C tot -95°C) Bewaring voor meerdere jaren Lyofilisatie (vriesdrogen = bevriezen en dehydrateren onder vacuüm) Bewaring voor tientalen jaren Groei van microbiële populaties De meeste micro-organismen groeien door binaire deling 1 moedercel splitst in 2 identieke dochtercellen Gebeurt in 4 stappen 1. Replicatie van het DNA. De gedupliceerde chromosomen zijn vastgehecht aan het cytoplasmamembraan 2. De cel wordt langer, door groei tussen de aanhechtingsplaatsen worden de chromosomen worden uit elkaar getrokken 3. Vorming van een nieuw cytoplasmatisch membraan en een nieuwe celwand (septum) ter hoogte van het midden van de cel 4. Splitsing van de dochtercellen. De cellen kunnen loskomen van elkaar of vastgehecht blijven Vraagstelling Beginaantal micro-organismen is 1 Gemiddelde delingstijd = 20 min (= generatietijd) Hoeveel mo zijn er na 24 u bij binaire deling? Als 1 E. coli een volume heeft van 1µ3 of 10-12 cm3 een soortelijke massa van 1g/cm3 Bereken dan het gewicht van alle cellen na 24u.