Biología Celular: Origen y Evolución (PDF)

Tem 8 Niv de or za ón de lo se vi 1. Niveles de organización La materia se organiza en diferentes niveles que se clasifican según su complejidad. De esta manera, cada nivel incluye a los inferiores y conforma un nivel más complejo comenzando de la sig...

Tem 8 Niv de or za ón de lo se vi 1. Niveles de organización La materia se organiza en diferentes niveles que se clasifican según su complejidad. De esta manera, cada nivel incluye a los inferiores y conforma un nivel más complejo comenzando de la siguiente forma: 1. Nivel molecular: Está compuesto por átomos y moléculas, como el ADN. 2. Nivel celular: Conjunto de moléculas que forman células, como una célula muscular lisa. 3. Nivel tisular: Un tejido es un conjunto de células especializadas en la misma función y que están unidas entre sí por cantidades variables de matriz extracelular. - Tejidos de vertebrados: epitelial, conectivo, muscular y nervioso. - Tejidos vegetales: meristemático, epitelial, parénquima, colénquima, xilema, floema. 4. Órganos: Un órgano es una unidad funcional constituida por dos o más tejidos. - Órganos de vertebrados: riñón, corazón, pulmón, hígado, testículo, ovario, etc. - Órganos de vegetales: raíz, tallo, hoja, flor y fruto.  5. Aparato o sistema: Ambos son conjuntos de órganos cuyas funciones están interrelacionadas. Sin embargo, se denomina sistema a un grupo de órganos homogéneos, con un origen embrionario común (nervioso, óseo y muscular). En cambio, un aparato está conformado por órganos heterogéneos (locomotor, digestivo, respiratorio...). - Sistemas en vertebrados: urinario, digestivo, respiratorio, nervioso... - Sistemas en vegetales: dérmico, fundamental y vascular 6. Organismo: Agrupación de sistemas y aparatos que conforman un ser vivo (tanto unicelulares como pluricelulares). 2. Disciplinas que convergen en la biología celular Estas disciplinas nos sirven para aproximarnos a técnicas de distintos tipos y las diferentes técnicas nos sirven para acercarnos a la biología celular. 3. La teoría celular Base de la Teoría Celular Propuesta por Schleiden, botánico (1838) y Schwann, zoólogo (1839): 1. Todos los organismos están formados por una o más células. 2. La célula es la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos 3. Toda célula procede de otra célula preexistente (Virchow, 1855). La teoría celular surgió gracias a los avances técnicos y a la observación de células. La teoría celular sigue dando problemas actualmente porque hay seres vivos acelulares como los virus, priones o viroides. Hoy por hoy es la que manejamos. Puede que no sea compleja o no encaje con todas las entidades vivas, pero son los paradigmas en los que nos basamos y en los que trabajamos. Antecedentes de la Teoría Celular Primeras observaciones microscópicas: El microscopio posibilitó la observación de estructuras no visibles por el ojo humano y el desarrollo de la Teoría Celular. - 1590: Los Jansen (padre e hijo) fabrican el primer microscopio rudimentario (5x). - 1610: Malpighi utiliza un microscopio elemental y observa “adiposi globuli”. - 1665: Robert Hooke descubre las células en una lámina de corcho (30x) y las llamó “Cells”. - 1670: Anton van Leeuwenhoek observó bacterias y protistas (eucariotas unicelulares) Desarrollo y consolidación de la teoría celular S. XIX: Se acelera el desarrollo de la Teoría Celular gracias al perfeccionamiento de los métodos y técnicas histológicas. 1889: Santiago Ramón y Cajal consigue la aceptación definitiva de la Teoría Celular aplicable a todos los tejidos, al demostrar la individualidad de las neuronas. A partir de la tinción de Golgi, Ramón y Cajal demostró la individualidad de las neuronas y consiguió la aceptación de la Teoría Celular. 4. La célula Es la unidad estructural, fisiológica y genética de los seres vivos. Podemos diferenciar dos tipos: las células procariotas y las células eucariotas. Entre ellas existen diversas diferencias entre las que se encuentran: - Las células eucariotas poseen un núcleo rodeado de una doble membrana. El ADN de las células procariotas se encuentra en una zona del citoplasma llamada nucleoide. - Las células eucariotas presentan orgánulos membranosos, compartimentación, y por tanto ventaja para separar procesos (pero requiere mayor gasto de energía). - Las células eucariotas son más grandes y más complejas. 5. Desarrollo de los conocimientos en la biología celular gracias al progreso de los métodos y de los instrumentos Un microtomo es un instrumento de corte que permite obtener rebanadas muy finas de material, conocidas como secciones. Un microscopio simple es como una lupa. Se ve directamente a través de una lente. El microscopio compuesto tiene más de un cristal de aumento y la luz atraviesa la muestra. Los microscopios más avanzados no son más importantes que los ópticos. Cuando observamos algo en el microscopio electrónico vemos una parte muy pequeña de la célula y no tenemos contexto de lo que ocurre alrededor. Obtenemos información concreta de lo que queremos observar pero perdemos información del resto.  Tem 9 Ori y ev ión ce r Se supone que el origen del universo está a 15.000 millones de años. Tenemos más conocimiento del origen de la vida, hace 3.800 millones de años. Las fechas de surgimiento de cada uno de los tipos de organismos se basan en la datación del fósil más antiguo que se ha encontrado de ese grupo. 1. Hipótesis evolutiva Charles Darwin: “La vida pudo comenzar cuando algunas sustancias químicas, estimuladas por calor, luz o electricidad, reaccionaron unas con otras y se generaron complejos orgánicos de complejidad creciente” (1871) Se plantea que la vida pudo originarse cuando de forma no dirigida sin intencionalidad ninguna algunas sustancias químicas reaccionaron unas con otras y se generaron complejos orgánicos cada vez más complejos. Importante: aleatoriedad del proceso y no intencionalidad. Es contraria al creacionismo (dios como creador) y la panspermia (los organismos llegaron a la Tierra ya formados, por meteoritos). Inciso: hipótesis La hipótesis nula es aquella que yo quiero demostrar que es falsa. Si no demuestro que es falsa entonces es verdadera. Las hipótesis directas son aquellas que yo quiero demostrar que son verdaderas. La mayoría de las hipótesis en ciencia son nulas. Si yo no puedo demostrar que Dios no existe entonces tengo que considerar que existe la posibilidad de que sea cierto. 2. Postulados de la hipótesis evolutiva sobre el origen de la vida Se trata de la Teoría Oparin-Haldane: 1. La vida surgiría en las condiciones que prevalecían en la Tierra primitiva. 2. Primero se sintetizarían moléculas orgánicas simples (monómeros), que posteriormente formarían moléculas más complejas (polímeros), y éstas se organizarían hasta originar células muy sencillas. 3. La vida se habría originado poco a poco, de una forma gradual y continua, tardando millones de años. Fases de la evolución biológica: 1. Formación de la Tierra 2. Síntesis de monómeros 3. Polimerización de monómeros 4. Síntesis de moléculas autorreplicantes sometidas a la selección natural 5. Las membranas definieron a las primeras células 3. Síntesis de monómeros: experimento de Miller-Urey (1953) Consistía en una simulación de las condiciones que existían en la tierra primitiva. En una campana se simula el caliente océano primitivo (tenía muchos volcanes acuáticos), eso daba lugar a vapor de agua. Luego había otra campana que simulaba la atmósfera primitiva (con metano, gases, H₂O, oxígeno..) y daba lugar, por ejemplo, a tormentas eléctricas. Como resultado, tuvo lugar la síntesis de moléculas sencillas (ácido cianhídrico (HCN), aldehídos…) y la síntesis de moléculas complejas (azúcares, aminoácidos, nucleótidos…). Actualmente hay algunos cuestionamientos acerca del aislamiento (podría haber contaminación) de este experimento o si el cristal que se utiliza podría haber dado lugar a los compuestos que se formaron. 4. Polimerización de monómeros A partir de monómeros se forman polímeros (se unen entre sí y dan lugar a los polímeros). 5. Moléculas autorreplicantes sometidas a la selección natural ¿Qué fue primero? ¿Polinucleótidos de ADN o ARN autorreplicantes o proteínas autorreplicantes?. Probablemente el ARN: ciertas moléculas pequeñas de ARN, llamadas ribozimas, actúan como enzimas que catalizan reacciones celulares, entre ellas la síntesis de moléculas de ARN. No se sabe cómo se pasó de una célula basada en el ARN a las células actuales basadas en el ADN. Lo que sí se sabe es que: - Todos los organismos vivos actuales proceden de una única célula que fue la que adquirió el código genético actual. - El código genético es el mecanismo que utiliza el ADN para sintetizar proteínas. 6. Las membranas definieron a las primeras células En el laboratorio puedo emular las condiciones primitivas, puedo sintetizar ARN, ADN, proteínas, etc. Para crear una célula es necesario crear una membrana. Se ha demostrado que cuando las estructuras orgánicas que generan la membrana se encuentran en ambiente acuoso tienden a formar las micelas y las bicapas lipídicas (para las micelas no hacen falta fosfolípidos, pueden ser ácidos grasos). Los fosfolípidos de la membrana lipídica tienen 2 colas y una de ellas tiene múltiples insaturaciones. Esto hace que no puedan unirse en paralelo sino dando lugar a una curvatura que hace que se forme la bicapa porque termodinámicamente es la estructura más estable, aumenta la entropía del sistema. Se forma de manera espontánea. Esto sí lo sabemos, pero lo que no sabemos es cómo se crea una célula totalmente funcional con todos sus orgánulos y estructuras en coordinación. No se sabe cómo de pronto una serie de moléculas empiezan a trabajar de forma coordinada. No se puede crear una célula en el laboratorio desde 0, hay que utilizar otra célula. 6. Origen evolutivo de las células eucariotas La teoría más aceptada es el proceso de invaginación, a partir de una célula procariota. Su membrana invaginó introduciéndose hacia adentro de manera que quedaron trozos de la membrana dentro de la propia célula. Esto dio lugar a la formación del núcleo y del retículo endoplasmático.  Tem 10 De lo or s o un ul a lo p u c u r 1. Origen de los organismos pluricelulares - Organismos unicelulares: la célula realiza todas las funciones que necesita. - Colonias: están formadas por células iguales y todas realizan las mismas funciones. - Organismos pluricelulares: están formados por distintos tipos de células y cada tipo realiza funciones diferentes. Volvox representa el paso hacia la pluricelularidad. Es un género de algas clorofíceas que tienen forma de esfera hueca, constituidas por 50.000 o más células. En Volvox las células se especializan: 1. Células reproductoras/germinales: poco numerosas y de gran tamaño. 2. Células somáticas: muy numerosas y pequeñas, tapizan la superficie. Son biflageladas y están unidas por uniones comunicantes, responsables de que todos los flagelos se muevan sincrónicamente. 2. Especialización Los organismos pluricelulares presentan especialización. Esto quiere decir que están compuestos por varios tipos de células y cada tipo realiza funciones diferentes. Se trata de una especialización tanto morfológica como funcional (además de tener diferente función tienen diferente forma). La especialización es posible gracias a la capacidad de las células eucariotas de expresar su información genética de forma diferente, es decir, a su capacidad para diferenciarse. También requiere la capacidad de las células de funcionar de manera coordinada gracias a la comunicación celular. Los organismos unicelulares pueden llevar a cabo todas las funciones vitales, por lo que pueden vivir de manera aislada. En cambio, los pluricelulares no pueden vivir aislados porque tienen células que se especializan (las células especializadas no pueden vivir de forma independiente). La única función que no pierde ninguna célula es la de nutrición, las demás sí pueden perderlas. 3. Diferenciación celular - Es el proceso por el que la célula, durante el desarrollo embrionario o la vida de un organismo pluricelular, experimenta un cambio progresivo hasta adquirir la maquinaria molecular y una forma por la que se especializa en desarrollar una determinada función con alta eficacia. - En el proceso se seleccionan genes para su expresión, según las enzimas y todo lo que necesite. - La forma de la célula cambia pero el material genético no, salvo excepciones (mutaciones). - Conlleva una pérdida progresiva de potencialidad para formar otro tipo celular, es decir, pierde la capacidad de poder tener otras funciones para ser otro tipo celular diferente. - Interviene tanto la localización de la célula como las interacciones con las células colindantes. - De un tipo celular inicial obtenemos otro. 4. Maduración celular Es el proceso en el que se terminan de desarrollar los orgánulos que cada célula hija necesita. De un tipo celular inmaduro obtenemos otro igual pero maduro. Maduración celular en organismos unicelulares La célula progenitora se divide y da lugar a dos células hijas idénticas. Estas células no se especializan, solamente sufren un proceso de maduración. Viven de forma aislada. Maduración celular en colonias La célula progenitora se divide y da lugar a dos células hijas idénticas. Estas células no se especializan, solamente sufren un proceso de maduración. Viven juntas, en asociación. Maduración celular en organismos pluricelulares De células progenitoras se obtienen hijas iguales a la progenitora. Estas células hijas tienen que especializarse y para ello deben pasar por el proceso de diferenciación para silenciar y expresar los genes determinados para cada caso,llegando a ser células diferenciadas distintas tanto de la célula madre como de otras células hijas. Además, las células especializadas tienen que pasar por un proceso de maduración. Las células resultantes son dependientes entre sí, viven juntas y realizan funciones diferentes. 5. Evolución de los organismos pluricelulares Un paso clave en la especialización fue la aparición de los epitelios. El epitelio se define como la capa que separa al organismo del medio externo, reviste todo el organismo tanto por dentro como por fuera. Permite el desarrollo de varios tipos celulares y el aumento de la complejidad, aumentando también la coordinación entre ellos por el sistema nervioso. 6. Concepto de tejido - Tejido (del latín texere = tejer): conjunto de células y matriz extracelular que se organizan de una forma determinada para el desarrollo de funciones concretas. Las células de un tejido se relacionan entre sí mediante interacciones celulares directas o mediadas por la matriz extracelular. Distintos tejidos se asocian entre sí para formar los órganos - Histología: ciencia que estudia los tejidos, en su estructura microscópica, desarrollo y funciones.  Tem 11 Es u de la es c a ce r Los microscopios son necesarios para estudiar las células. Una célula típica mide entre 10 y 100 µm. Las células son aproximadamente cinco veces más pequeñas que la menor partícula visible por el ojo humano. 1. Características ópticas de las lentes/ojos Poder de resolución El poder de resolución es la capacidad de un sistema de lentes de distinguir como dos imágenes independientes/separadas dos puntos que están muy próximos entre sí. Dicho de otra manera, es la capacidad que tiene la lente para diferenciar dos imágenes que son diferentes como independientes. Cuanto mayor sea el poder de resolución de un instrumento óptico, menor es la distancia existente entre dos puntos que se pueden distinguir como puntos separados. Cuanto menor sea el límite de resolución, mayor poder de resolución tiene. El poder de resolución es directamente proporcional a la calidad de la imagen. Límite de resolución Es la menor distancia a la cual dos puntos pueden ser distinguibles de forma separada. Es decir, es el número a partir del cual ya no podemos diferenciar dos cosas como separadas. Cuanto menor sea el límite de resolución, mayor calidad tiene la lente, puesto que puedes diferenciar dos cosas más cercanas entre sí. α es la mitad del ángulo que se forma en el triángulo que se genera cuando observamos una muestra. Me interesa una longitud de onda muy pequeña para que el límite de resolución sea menor. Podemos distinguir dos grandes tipos de microscopios: los microscopios ópticos, que utilizan la luz como base para conseguir la imagen, y los microscopios electrónicos, que emplean electrones como base. 2. Microscopio óptico simple Se trata de la lupa o el microscopio estereoscópico. La lupa es un microscopio simple ya que posee solo una lente. - Posee una lente curva (convergente) de corta distancia focal, que desvía la luz incidente de modo que se forma una imagen virtual ampliada del objeto. - En el microscopio compuesto la luz atraviesa la muestra, en la lupa no. La luz tiene que rebotar en la muestra, no atravesarla. - Aumenta la imagen de objetos y organismos que son visibles a simple vista. - Proporciona una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. - Se utiliza para observar la morfología de las colonias, para cortar/seccionar/diseccionar un tejido para realizar un cultivo organotípico, etc. 3. Microscopio óptico compuesto Aumenta la imagen de muestras biológicas que NO SON VISIBLES A SIMPLE VISTA. En este tipo de microscopios la luz atraviesa la muestra. La fuente lumínica pasa por el condensador, la luz atraviesa la muestra y luego llega a los objetivos. En este caso tenemos 3 sistemas de lente: - Los oculares, que permiten una mayor magnificación.10X, 15X. - El condensador, que concentra los rayos de luz sobre la muestra. - El revólver con los objetivos, que magnifican la imagen. 4x, 10x, 20x, 40x, 60x y 100x. La magnificación es cuánto me aumentan las lentes el tamaño de la muestra, es decir, los aumentos totales: aumentos del objetivo x aumentos del ocular La magnificación total de una imagen fotográfica es el nº de aumentos del microscopio x los aumentos de la imagen. La magnificación de la imagen se suele representar con una escala. Forma de indicar los aumentos: - Signo x seguido de un número que indica los aumentos - Barra de aumento con una longitud determinada que indica la correspondencia con el tamaño real. Es la forma más idónea. Características ópticas de los microscopios ópticos - Poder de resolución - Límite de resolución - Apertura numérica Es la capacidad del objetivo de utilizar un mayor o menor número de rayos luminosos en la formación de la imagen. Depende del semiángulo de entrada de la luz al OBJETIVO (α) y del ÍNDICE DE REFRACCIÓN DEL MEDIO (n) que existe entre el objetivo y la muestra. 3. Tipos de microscopios ópticos compuestos (luz visible) Microscopio óptico compuesto de campo claro Aumenta la imagen de muestras biológicas que NO SON VISIBLES A SIMPLE VISTA. Un haz de LUZ BLANCA atraviesa la muestra. Microscopio óptico compuesto invertido Los objetivos se encuentran por debajo de la platina y el sistema de iluminación está por encima de la platina. Sirve para la observación de cultivos celulares, para observar células muertas o vivas, para la observación y manipulación de gametos o embriones vivos, etc. En el microscopio óptico no podemos meter la placa con el cultivo pq choca y si separamos el objetivo pierdo límite de resolución. Por eso se utiliza este microscopio en estos casos. El microscopio invertido se utiliza muchísimo más porque se puede usar para observar cualquier muestra. Como está el objetivo por abajo nunca va a chocar con la muestra. Cuando se hace una inversión en un microscopio caro se compra el invertido porque abre más puertas. Todos los microscopios siguientes (que utilizan la luz visible) pueden ser convencionales o invertidos. Microscopio óptico compuesto de campo oscuro Posee un condensador con un filtro que deja pasar únicamente los rayos lumínicos oblicuos que llegan a la muestra. Así, solo me permite ver el borde de mi muestra. Los objetivos reciben la luz dispersada por los diferentes componentes celulares. Aplicación: observar partículas dispersas en un medio homogéneo, preparaciones vivas (sin teñir), estudiar los bordes de las muestras, ver microorganismos con diámetro superior a 0,2 μm. Se puede ver sobre todo cuantos elementos tengo. Es muy útil para conteos de células, ya sean células muertas o vivas. También se usa mucho en inorgánica. Además, también sirve para observar/estudiar la morfología de las partículas a observar. Microscopio óptico compuesto de contraste de fase Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la que atraviesa una zona más gruesa o más densa (ej. núcleo) se retrasa y su fase queda desplazada respecto a la luz que atraviesa una zona menos densa (ej. el citosol). Las diferencias de fase se traducen en diferencias de amplitud de onda que pueden ser detectadas como diferencias de intensidad luminosa. El sistema de lentes magnifica la diferencia entre las fases de los rayos de luz que atraviesan la muestra. Aplicación: estructuras incoloras (cultivos celulares y cortes histológicos sin teñir) TRUCO DE EXAMEN: CÓMO DIFERENCIO CAMPO OSCURO DE CONTRASTE DE FASE: en la imagen de contraste de fase se ve el interior y se ve un halo alrededor de la muestra que es típico de contraste de fase. Microscopio de interferencia, de contraste diferencial (DIC) o Nomarski Su creador (Nomarski) quiso combinar el campo oscuro con el contraste de fases. Presenta dos tipos de haces luminosos: oblicuos (como el de campo oscuro) y haces que atraviesan la muestra y se retardan según la zona que atraviesan (similar a microscopio de contraste de fase). Parece que la muestra tiene volumen, relieve. Se aplica en estructuras incoloras (cultivos celulares y cortes histológicos sin teñir). Microscopio de luz polarizada Características de tejidos o componentes celulares: - Isótropos: No producen ningún cambio en la luz polarizada. - Anisótropos (birrefringentes): modifican el plano de la luz polarizada. Sustancias cristalinas o fibrosas. Imagen brillante. Consta de dos filtros polarizadores: 1) Polarizador: se encuentra en el condensador. Polariza la luz que incide sobre la muestra. Sólo deja pasar los rayos que entran en sus huecos. 2) Analizador: en el ocular. Despolariza la luz que incide en la retina. Va girando y cuando coincide con la estructura de mi célula va a pasar a través de las zonas claras y es absorbida por las zonas oscuras. Por ejemplo, sirve para ver la estructura del polen o acumulación de metales pesados en músculo. En general, estructuras ALTAMENTE organizadas. 4. Tipos de microscopios ópticos (fluorescencia) Los microscopios de fluorescencia detectan moléculas autofluorescentes (fluorocromos endógenos) o moléculas acopladas a un fluorocromo. Un fluorocromo es un componente de una molécula que absorbe energía de una longitud de onda específica y que la devuelve en otra de mayor longitud de onda (menos energía). La fluorescencia consiste en estimular una molécula (fluorocromo) con luz de una determinada longitud de onda (de absorción) y se emite luz de una longitud de onda mayor, es decir, menor energía (longitud de onda de emisión). El emisor produce la longitud de onda que estimula el fluorocromo y el detector detecta la longitud de onda que emite, que recuerdo que es diferente. Microscopio de epifluorescencia La luz que se utiliza es luz ultravioleta, que se genera gracias a una lámpara de mercurio. Antes de llegar a la lente del ojo hay un filtro barrera para que la luz UV no llegue a nuestro ojo. Si lo vemos azulado es que el filtro está mal y tenemos que retirar el ojo inmediatamente. Este microscopio nos permite ver interacciones que no se pueden ver con el microscopio de campo claro pq hay cosas que me estorban (solo visualizamos aquello que nos interesa, lo que hemos teñido). Esto es tanto una ventaja como una desventaja, ya que nos quedamos sin “contexto”. Las imágenes de fluorescencia tienen la ventaja de que lo que veo lo veo bien. Se ve perfectamente aquello que he marcado. A pesar de ello, no ver lo que no queremos ver nos limita la información sobre el entorno. No vemos la realidad, sino solo lo que hemos marcado, lo que queremos ver. Microscopio láser confocal Está basado en un microscopio de fluorescencia y utiliza rayos láser como fuente de iluminación. Los rayos láser son rayos lumínicos que salen solo en una misma dirección. Permite la captura informática de las imágenes. El microscopio de láser confocal me ilumina desde el lado, y solo un plano de mi muestra. Se ve mucho más nítido (mayor definición y resolución) que el microscopio de fluorescencia “normal”. De una misma muestra puedo sacar imágenes de distintos planos. Los pinholes son condensadores que dejan pasar únicamente la longitud de onda que me interesa para estimular el fluorocromo. Con ellos se alcanza la nitidez característica del microscopio confocal. 5. Microscopios electrónicos Existen dos tipos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido o “scanning”. Ambos utilizan los electrones como base para obtener la imagen, pero: - En el electrónico de transmisión los electrones atraviesan la muestra, mientras que en el de barrido rebotan en la muestra. - En el de transmisión la muestra está cortada en lonchas finitas y se genera una imagen en 2D. En el de barrido el tejido no está cortado y se genera una imagen en 3D, pseudo-3D. Microscopio electrónico de transmisión Podemos diferenciar dos tipos de zonas en una muestra para el MET: - Zonas electroclaras, a través de las cuales los electrones pasan. - Zonas electrodensas, a través de las cuales los electrones no pasan. Aumento de contraste Las muestras suelen procesarse para aumentar el contraste. Se añaden átomos pesados a la muestra para generar zonas electrodensas (actúan como colorantes histológicos). Suelen ser un metal en el que rebota el electrón, aumentando el contraste (al rebotar lo negro se ve más negro y lo blanco se ve más blanco). El aumento de contraste sirve para observar material particulado como microorganismos (virus, bacterias…) o fracciones celulares (orgánulos, proteínas, membranas…). Por ejemplo, se utiliza el tetróxido de osmio (O4Os), que se une a radicales cargados de las moléculas (ej. cabezas polares de fosfolípidos de membranas celulares, grupos ionizables de las proteínas).  - Contraste negativo: Es una técnica que consiste en llenar la superficie del tejido con metales pesados en fase líquida. Tras el secado, se forma una película sólida muy densa a los electrones. Las partículas se observan con el MET como estructuras claras (sin contraste) rodeadas de una sustancia densa. La parte blandita se llena de metales pesados. Las partes duras (proteínas) no, ya que no las atraviesan. - Sombreado metálico: Teñimos las partículas en lugar de desde arriba desde el lado. Al echarlo desde el lateral se me acumulan en un lado. Permite la observación con el MET de detalles superficiales a alta resolución.Cuando hacemos la foto al haber una mayor concentración de metales pesados a un lado se produce rebote y da la sensación de sombra y volumen. Se observan objetos oscuros (partícula) junto a “sombras” (zona sin metal, claras) Réplicas Consiste en obtener una copia de la superficie de una muestra. Obtención de la réplica: se vierten soluciones de plástico en la superficie y se secan. Aislamiento de la réplica: eliminación de la muestra por medios químicos. Recogida y sombreado de la réplica para la visualización en el MET. Criofractura Sirve para visualizar las superficies y el interior de las membranas celulares. Criofijación: congelación rápida con nitrógeno líquido (- 196ºC) con crioprotector. Fractura: la muestra se golpea con una cuchilla, y la línea de fractura pasará por la zonas menos resistentes. Réplica: metalización de la muestra y posterior eliminación de la muestra. Sombreado y observación con el MET. Microscopio electrónico de barrido o “scanning” El MEB permite visualizar tridimensionalmente la superficie de las muestras. Pongo la muestra abajo y dejo que los electrones reboten (los e que rebotan se llaman e secundarios). Para que la muestra no se llene de agujeros al recibir el impacto de los electrones se recubre de un metal, normalmente oro.  Tem 12 Pro mi es án a de mu r bi ógi pa mi s ía óp i y el róni de t a s ón y ba d 1. Planificación de los métodos y técnicas En primer lugar es necesario considerar el tipo de proceso que se va a estudiar, que puede ser: - Procesos dinámicos. Por ejemplo, la circulación de elementos dentro de una célula, la migración celular o la división celular. En este caso se utilizan experimentos de localización y dinámica celular, pulso caza, BrdU, colorantes vitales, etc. - Procesos estáticos. Por ejemplo, estudios morfológicos y cuantitativos, la presencia/ausencia de marcadores, etc. En este caso se puede llevar a cabo una tinción general o específica (histoquímica, inmunolocalización, hibridación in situ, autorradiografía…) Ambos tipos de procesos se pueden estudiar in vivo o post-mortem. Luego hace falta decidir el tipo de procesamiento de la muestra biológica en función del proceso a estudiar o la propia naturaleza de la muestra. Por último, para visualizar e interpretar los resultados, hay que decidir el tipo de microscopio o sistema de visualización de los resultados o la técnica de cuantificación adecuada si procede. IMPORTANTE: si queremos observar células vivas no hay que fijar, porque si fijamos nos cargamos las células. Si fijamos la muestra podemos estudiar procesos estáticos y dinámicos, pero siempre post-mortem. 2. Procesamiento de muestras biológicas en biología celular 1. Disección: Exposición de la muestra que yo quiero observar. 2. Fijación: Me permite preservar el tejido. Evita que se desnaturalicen proteínas, evita que haya degeneración, evita la entrada de patógenos. Evitamos la apoptosis de las células: desnaturalizamos las enzimas que llevan a la apoptosis. 3. Endurecimiento: Se hace sobre todo si tenemos que cortar. Es dar consistencia a la muestra biológica y así permitir la obtención de cortes histológicos. 4. Corte: Obtener secciones histológicas delgadas, para teñir o visualizar. No es siempre necesario, si hacemos microscopía de barrido no se corta.  5. Tinción: Dotar de contraste a las estructuras biológicas y marcar lo que queremos ver. No es dar color, es dar contraste. Tampoco es necesario siempre y realizaremos una tinción u otra en función de lo que queramos observar o discernir. 6. Montaje: Permitir la observación al microscopio óptico o electrónico. También sirve para preservar la muestra evitando que entren patógenos que degraden la muestra. 7. Visualización: Usar el aparataje oportuno para ver muestras muestras tras el procesamiento requerido. 3. Fijación Objetivos ➔ Detener los procesos que ocurren tras la muerte celular por autolisis. La velocidad de degradación depende de la riqueza de enzimas y de la temperatura. ➔ Inmovilizar las moléculas, mediante puentes cruzados o desnaturalización, para mantenerlas tal y como estaban en la célula cuando ésta estaba viva. ➔ Preservar la composición química y la estructura original de los tejidos, de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo. ➔ Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en la muestra. ➔ Dotar a la muestra de cierta consistencia. Fijación física - Fijación por calor. Se alcanzan temperaturas elevadas por aproximación a una llama u horno microondas. El objetivo es desnaturalizar las proteínas. Se utiliza calor leve, ya que si uso mucho calor me cargo la muestra porque desnaturalizo todo, mi intención solo es separar las enzimas. Es un método poco preciso que tiene baja penetración. Solo sirve para microscopía óptica. - Fijación por congelación (criofijación). Consiste en una congelación rápida de la muestra. Usamos nitrógeno líquido, que está a -196ºC. Detiene los procesos celulares e inmoviliza las moléculas. Se utilizan agentes crioprotectores (ej. glicerol, isopropanol…) para evitar la formación de cristales de hielo. Siempre hay que utilizar equipamiento especial porque si te cae en algún sitio se congela automáticamente y se te mueren todas las células. Sirve para microscopía óptica o biología molecular. No es lo más normal, pero se puede usar para observar exovesículas en el microscopio electrónico. Fijación química Es el método de fijación más efectivo y utilizado. Se utilizan compuestos químicos que poseen grupos aldehído en disolución acuosa. Son sustancias que pueden establecer puentes cruzados con las enzimas/proteínas cambiando su estructura tridimensional, lo que hace que pierdan su conformación nativa y por tanto se desnaturalicen. Se pueden modificar enzimas, lípidos y lugares antigénicos. Ambos tipos sirven tanto para microscopía óptica como microscopía electrónica. - Fijación química por inmersión. Se introduce el tejido en un bote para que el compuesto vaya introduciéndose en el tejido, que está sumergido en él. Lleva un tiempo. Solo se utiliza para muestras pequeñas o muestras que tengan agua dentro para que pueda esparcirse rápidamente. No puedo meter muestras grandes porque cuando llega el fijador el músculo ya se ha degradado. - Fijación química por perfusión. Consiste en sustituir la sangre del animal por fijador, aprovechando el bombeo del corazón. Dicho de otra forma, es hacer pasar una solución fijadora a través del sistema circulatorio del animal. ¿Cómo se hace? Se le da una sobredosis de anestesia al animal. Se abre el animal, se rompe la pleura y el animal muere por muerte cerebral. Se hace un agujero en la aurícula derecha. Se introduce un tubito por la aurícula izquierda con una aguja conectada a una bomba peristáltica que introduce solución de lavado para quitar la sangre. Una vez se ha limpiado (toda la sangre ha salido por la aurícula derecha) se sustituye la solución de limpiado por solución fijadora. Cuando se ha acabado la fijación el animal queda totalmente tieso. Cuando hemos obtenido el órgano que nos hace falta se vuelve a fijar (post-fijación) por inmersión. Propiedades de los fijadores 1. Evitar la degradación del tejido por ataque microbiológico y procesos de autolisis (enzimas lisosomales). 2. Mantener las propiedades del tejido. - Evitar distorsiones y retracciones de los tejidos. - Conservar la reactividad química de los tejidos (sitio de unión del colorante, actividad enzimática, capacidad de formar complejos antígenos-anticuerpos, etc.) Tipos de fijadores Sirven tanto para inmersión como para perfusión. 1. Microscopía óptica: Formol, ácido pícrico, metanol, ácido acético, etanol, solución de Bouin (mezcla de ácido pícrico, formol y ácido acético glacial), paraformaldehido 4% (sirve para cualquier microscopio). 2. Microscopía electrónica: Paraformaldehído 16-32% y glutaraldehído (es muy necesario para muestras muy finas del microscopio de transmisión). Cuando esterilizas con alcohol la superficie de trabajo estás fijando la pared celular de las bacterias, de forma que no pueden llevar a cabo sus procesos fisiológicos. 4. Endurecimiento Congelación - Congelación lenta. Se realiza con nieve carbónica (trocitos de hielo a una temperatura muy baja) o directamente al congelador a -20ºC o a -80ºC. En los dos casos se necesita crioprotección. Necesito preparar el tejido para las temperaturas bajas, para evitar la rotura de las membranas por congelación. Se hace con azúcar, sacarosa o glucosa, mediante un gradiente de concentraciones (5% a 30%). Sirve para microscopía óptica. - Congelación rápida. Se hace con nitrógeno líquido. Al congelar en nitrógeno líquido vuelvo a la muestra frágil. Por ello, no se utiliza cuando se quiere hacer un corte. Está a -196ºC. Inclusión Metemos el tejido en una sustancia para darle dureza y consistencia. Consiste en la infiltración dentro del tejido de un material líquido que por polimerización o enfriamiento se solidifica. En la inclusión estamos haciendo que la sustancia de endurecimiento entre en la muestra, por lo que hacemos un gradiente creciente, como cuando deshidratamos, para que se produzca intercambio entre la muestra y el medio y la sustancia pueda penetrar en la muestra. - Inclusión en parafina La parafina es una mezcla de hidrocarburos insoluble en agua, sólida a temperatura ambiente y líquida a 60ºC. Se utiliza para microscopía óptica. Le da bastante dureza (dureza media) a la muestra. Es un bloque duro pero si lo aplastas con fuerza tiene cierta flexibilidad. La parafina implica que vamos a aumentar la temperatura, por lo que no sirve en todos los casos. En algunos casos la muestra no puede someterse a temperaturas altas porque se desnaturalizan proteínas o la muestra se estropea en general. Me permite cortar con el microtomo de parafina, dando lugar a cortes de 5-20 μm. - Inclusión en resina La resina es líquida a temperatura ambiente y polimeriza con calor, es insoluble en agua y suelen ser acrílicas o epoxi. Es muy muy muy muy dura. Sirve para el microscopio electrónico de transmisión. Para cortarla hace falta una cuchilla de diamante porque es el único material que me permite hacer cortes muy precisos. Me da unos cortes muy muy muy delgados. Se hacen con un ultramicrotomo, genera cortes ultrafinos. Como mucho los cortes para el microscopio electrónico son de 50 nm. Cuando recogemos los cortes se recogen en rejillas de 3mm de diámetro. Hay que cuadrar la colocación del corte de manera que cuando vayamos a verlo al microscopio la rejilla no me tape la zona que me interesa. Inmersión - Inmersión en agarosa Dureza baja. Se utiliza para microscopía óptica. Tiene estructura de gelatina. Se usa para muestras fijadas muy muy blandas, para que no haya grandes diferencias entre el medio y la muestra a cortar. O bien para muestras vivas. El aparato que utilizo para cortar muestras inmersas en agarosa se llama vibratomo, que da lugar a cortes de 30-200 micras. El vibratomo también sirve para cortar muestras no fijadas, como cultivos. En el vibratomo el bloque de la muestra se pone en vertical, fija, y la cuchilla es la que se mueve. Los cortes se recogen en un tampón, se quedan flotando en una sustancia que permite que la muestra siga viva. - Inmersión en OCT El OCT es una composición de glicoles y resinas hidrosolubles que proporcionan una matriz adecuada de la muestra para el seccionamiento del criostato en temperatura de –10 °C e inferiores. Es gel a temperatura ambiente y sólido a -20ºC. Se elimina en medio acuoso. Se utiliza para el microscopio óptico. Se mete la muestra en OCT, luego se pone en hielo seco (CO2 sólido, nieve carbónica), que es muy frío, y solidifica el OCT. Cuando la muestra está congelada se utiliza un aparato llamado criostato, que además mantiene la muestra a la temperatura adecuada. Tiene un funcionamiento similar al microtomo de parafina. Permite hacer cortes muy finos, de 4 a 40 micras. 5. Corte El objetivo del corte es obtener secciones histológicas delgadas que puedan ser atravesadas por los fotones o electrones. El aparato que se utiliza para realizar cortes histológicos es el microtomo. Microtomo Ranvier o de mano Solo se utiliza para órganos vegetales. Microtomo de parafina Se utiliza para obtener corte de material incluido en parafina. Se obtienen secciones de 5-10 micras para microscopio óptico. Criostato Se utiliza para cortar material congelado, esté fijado o no. Da lugar a cortes de 5-40 micras para microscopio óptico. La cuchilla y la muestra se encuentran en una cámara a -25ºC. Vibratomo Se utiliza para cortar material fijado o sin fijar (fresco). La muestra SUELE estar encastrada en gelatina, agarosa, etc. Se obtienen secciones de 30-200 micras para microscopio óptico. La cuchilla avanza con un movimiento de cizalla (vibración). Ultramicrotomo Se utiliza para cortar material fijado e incluido en resina. Se obtienen cortes semifinos para el microscopio óptico (0,5-1 micras) o ultrafinos para el microscopio electrónico (50nm). La cuchilla es de vidrio o de diamante. 6. Montaje Sirve para preservar y conservar la muestra teñida para visualizarla al microscopio óptico. El corte histológico (que está sobre un portaobjetos) se cubre con un cubreobjetos que se adhiere con una resina sintética. Las resinas suelen ser insolubles en agua, por lo que se requiere una deshidratación del corte histológico. El medio de montaje es hidrofóbico para evitar que crezcan los microorganismos, a excepción de casos puntuales en los que sí que se necesita un medio hidrofílico (microscopía de fluorescencia; en este caso se sella la muestra después de aplicar el medio de montaje con pintauñas transparente). FROTIS Hay muestras que no requieren inclusión ni corte para su estudio, como es el caso de muestras de sangre, esputo (moco espeso), orina, lavado bronquioalveolar, etc. Consiste en extender las células en una monocapa sobre un portaobjetos, con o sin centrifugación previa. Las células quedan separadas, lo que facilita su estudio. Se fija la preparación secándola al aire y se tiñe con colorantes específicos según la naturaleza de la muestra.