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IMMUNOLOGIA IMMUNITÀ INNATA SISTEMA IMMUNITARIO È un sistema di cellule specializzate, molecole solubili, organi e tessuti linfoidi. Utilizza il sangue come rete di trasporto. [Innato si riferisce al fatto che questo sistema pre-esiste al contatto con il patogeno.] Composizione del sangue: 5 mil...

IMMUNOLOGIA IMMUNITÀ INNATA SISTEMA IMMUNITARIO È un sistema di cellule specializzate, molecole solubili, organi e tessuti linfoidi. Utilizza il sangue come rete di trasporto. [Innato si riferisce al fatto che questo sistema pre-esiste al contatto con il patogeno.] Composizione del sangue: 5 milioni di globuli rossi e **7 mila leucociti** - 70% neutrofili: primi ad extravasare - 20/30% linfociti B e T: raggiungono gli organi linfoidi secondari in cerca dell'antigene - Piccola percentuale di monociti, eosinofili e basofili RISPOSTA INNATA Il patogeno entra in periferia e viene riconosciuto dalle cellule residenti che attivano la risposta innata per 12/24 ore. Successivamente viene attivata la risposta adattiva. 1. fase preformata= strutture fisiche già presenti per evitare l'entrata del patogeno (cute, mucose) 2. fase indotta= patogeno rilevato da **macrofagi** *(tramite PRR)* che richiamano i **neutrofili** rilasciando citochine, agiscono anche le **[cellule linfoidi innate]** (natural killer) meccanismi effettori: - attivazione del complemento - fagocitosi - lisi della cellula target - infiammazione vengono rilasciate citochine (TNF e IL1/IL6) 3. fagocitosi= prima si forma il fagosoma, che poi si fonde con il lisosoma e distrugge il patogeno tramite pH acido e ROS prodotti dal **complesso della NADPH ossidasi** I recettori dei macrofagi per fagocitare sono: - recettore per il mannosio - **recettori PRR** sulla superficie, sulla membrana degli endosomi, nel citosol; altamente conservati e riconoscono i PAMP - recettore del complemento - recettori per porzioni F~c~ degli anticorpi: parte dell'immunità adattiva perché sono già stati sviluppati gli anticorpi - recettore per citochina (interferone gamma): attiva produzione di ROS per l'eliminazione del patogeno Il sistema immunitario riconosce self e non-self: - teoria self/non-self: vengono riconosciuti gli antigeni che normalmente non sono sulle cellule - teoria del pericolo: il SI reagisce quando rileva qualcosa di potenzialmente pericoloso *non tutti i recettori attivano lo stesso pathway intracellulare* Ogni cellula infiammatoria (neutrofili, macrofagi, ecc.) è in grado di riconoscere l'intero spettro di PAMP e DAMP perché ogni cellule esprime tutto il repertorio di PRR. MACROFAGI Sono cellule dell'immunità innata localizzate nei tessuti periferici. Riconoscono il patogeno mediante PRR e hanno capacità di fagocitare. **Esprimono MHC di classe II** sono cellule APC Possono derivare da: - Monocita che si è transdifferenziato - Precursore che è arrivato dal fegato o dal sacco vitellino nello sviluppo embrionale Diversi tipi di macrofagi nei vari tessuti: - **Microglia**: difesa immunitaria sistema nervoso - **Cellule di Kupffer** nel fegato - **Macrofagi alveolari** nei polmoni - **Macrofagi sinusoidali** nella milza - **Osteoclasti** NON si possono spostare dai loro siti periferici CELLULE DENDRITICHE Le cellule dendritiche hanno una duplice funzione: fagocitaria e presentazione dell'antigene. Hanno origine [ematopoietica mieloide] ed esprimono un marker specifico **Zbtb46**. Alcuni sottotipi derivano da precursori ematopoietici provenienti dal sacco vitellino o fegato fetale. Si differenziano in: - Dendritiche classiche: sia in periferia sia negli organi linfoidi secondari - Dendritiche plasmacitoidi produzione interferone-alpha, presenti in circolo, meno dendriti - Dendritiche infiammatorie: derivano da monociti differenziati, NON hanno il precursore di cellule dendritiche nel midollo - Cellule di Langerhans: derivano da fegato fetale, portano antigeni dalla cute agli organi linfoidi **Possono spostarsi dai siti periferici fino agli organi linfoidi secondari** Per quanto riguarda l'immunità innata hanno due caratteristiche: - Presentare l'antigene ai linfociti T - *Indicare da dove provengono*= dove si trova l'infezione L'antigene può arrivare agli organi linfatici secondari trasportato dalle DC oppure in forma libera. MATURAZIONE Le DC in assenza di infezione sono in forma immatura. Quando arriva il patogeno vanno incontro a maturazione e diventano **APC professionali**. Ci sono diverse fasi: 1. Aumento espressione MHC di classe I e II 2. Aumento espressione molecole costimolatorie (ICOSL, CD40, CD70) 3. Espressione molecole per la migrazione (CCR7) 4. Attivazione dei PRR e produzione citochine per direzionare la risposta immune IMMUNITÀ INNATA/ADATTIVA L'immunità innata è più veloce (entro 12 ore), mentre quella adattiva è più specifica per ogni patogeno. Hanno anche diversi recettori che le caratterizzano: - [Innata: PRR] sulla membrana plasmatica o sugli endosomi intracellulari - [Adattiva: recettori dei linfociti T e B che riconoscono l'antigene] sulla superficie della cellula Solo l'immunità adattiva dispone di una memoria immunitaria. Innata Adattiva --------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------- Pre-esiste al contatto con il patogeno Memoria immunologica PRR e TLR Protezione più vasta Neutrofili, macrofagi, mastociti Più lenta ma più specifica Immediata ma poco specifica Necessita contatto con il patogeno= priming Tutte le cellule infiammatorie riconoscono tutti i PAMP e DAMP perché esprimono tutti i PRR Un singolo linfocita riconosce un singolo antigene tra centinaia di milioni Molto probabile incontro tra patogeno e cellula infiammatoria Bassa probabilità di incontro tra linfocita e antigene troppo specifici quindi sono pochi IMMUNITÀ ADATTIVA La differenza fondamentale tra immunità innata e adattiva è la **memoria** oltre alla specificità, infatti l'immunità adattiva è specifica per ogni patogeno. La memoria immunologica consente anche il trasferimento degli anticorpi dalla mamma al feto. Consente protezione per un numero molto più vasto di patogeni, compresi i parassiti intracellulari obbligati. La risposta adattiva è formata da due componenti: - **Risposta umorale** mediata da linfociti B - **Risposta cellulare** mediata da linfociti T riconoscimento antigeni cellulari con complesso MHC RISPOSTA 1. Linfociti T (tramite cellule dendritiche) e B riconoscono patogeno e iniziano a proliferare e a differenziarsi 2. 3 effetti: - Linfociti B producono anticorpi - Linfociti T helper favoriscono proliferazione linfociti B - Linfociti T citotossici lisano le cellule infette 3. Una parte dei linfociti prodotti diventa quiescente LINFOCITI Le cellule dell'immunità adattiva sono: - **Linfociti B**: producono abbondanti anticorpi - **Linfociti T**: divisi in - CD4 (helper): producono interleuchine che promuovono proliferazione e differenziamento degli altri linfociti - CD8 (citotossici): uccidono cellule del nostro organismo che esprimono l'antigene entrambi provengono da precursori ematopoietici [La loro maturazione avviene nel timo (T) e nel midollo (B)], due organi linfoidi primari. Successivamente escono e colonizzano organi linfoidi secondari (milza e linfonodi). Differenze importanti nella maturazione: - Linfociti B: la maturazione avviene durante tutta la vita - Linfociti T: si formano tutti entro i primi anni di vita I linfociti B hanno bisogno dell'aiuto dei linfociti T helper per cominciare a produrre i loro anticorpi. **Sono le cellule T a determinare lo spettro di antigeni per cui sviluppiamo una risposta immune efficace**. I linfociti sono molto specifici ogni linfocita ha un singolo antigene che può legare. Per ogni antigene (singola proteina del patogeno) ci sono poche proteine specifiche, quindi *[è bassa la probabilità che il patogeno incontri l'antigene]*. Ci sono due soluzioni: - Organi linfatici raggruppano gli antigeni - Processo di **amplificazione clonale**: dopo il primo contatto con il rispettivo antigene la cellula inizia a proliferare massivamente si creano cloni della proteina specifica per quell'antigene Durante il processo i linfociti attivano anche un [programma differenziativo]: - Linfociti T funzione citotossica - Linfociti B diventano plasmacellule= fabbriche di anticorpi solubili Una piccola quota di linfociti attivati nella parte iniziale della risposta diventano subito quiescenti= sono i **linfociti della memoria**. Saranno i primi ad attivarsi se l'antigene si ripresenta. Linfociti T Linfociti B ---------------------------------------------------------------- ------------------------------------- Maturazione primi anni di vita Maturazione per tutta la vita Promuovono proliferazione linfociti e uccidono cellule infette Producono anticorpi **Servono CELLULE DENDRITICHE per riconoscere antigene** Riconoscono direttamente l'antigene TEORIA DELLA SELEZIONE CLONALE Ci sono 4 *postulati della selezione clonale*: 1. Ogni linfocita porta un solo tipo di recettore con una specificità unica 2. Quando un recettore si lega ad alta affinità con una molecola non-self questo si attiva 3. All'attivazione del linfocita segue una proliferazione clonale accompagnata da differenziazione 4. I linfociti che riconoscono molecole self vengono eliminati  SISTEMA LIFATICO - **Primari**: dove originano le cellule del SI (midollo osseo e timo) - **Secondari**: dove si accumulano le cellule del SI in assenza di infezione (linfonodi e milza) setacci per evitare che il patogeno arrivi alla circolazione sistemica *La risposta immune vera e propria avviene negli organi linfoidi secondari*, che possono essere: - Capsulati: linfonodi (drenano cute e mucose), milza (drena sangue) - Non capsulati: aggregati linfoidi I linfociti nella milza e nei linfonodi sono detti **naive**= completamente maturi ma non hanno visto ancora un antigene. Migrano attraverso gli organi linfoidi secondari in cerca del loro antigene. I linfociti si trovano anche come aggregati nei tessuti periferici = MALT - GALT: nella mucosa digerente - BALT: nelle mucose del respiratorio LINFONODI = Organi linfatici secondari incapsulati. Sono delle **stazioni di controllo** dei vasi linfaticià ricevono la linfa dai vasi linfatici afferenti che si aprono nel seno sottocapsulare, la setacciano e poi la rimettono nel circolo sistemico. Sono suddivisi in due zone: - Follicoli B dove si trovano i linfociti B - Area T dove si trovano i linfociti T La suddivisione tra aree T e B è presente anche negli altri organi perché massimizza la possibilità di incontro con l'antigene. La separazione tra queste aree è determinata dalle chemochine che richiamano linfociti T o B. - Le cellule dell'area B si chiamano cellule follicolari dendritiche e producono la chemochina [CXCL13], che attrae i linfociti che esprimono il recettore CXCR5. - Le cellule dell'area T invece si chiamano cellule reticolari fibroblastiche, che producono due chemochine [CCR19 e CCR21], che richiamano i linfociti con il recettore CCR7. Hanno due funzioni: - Impedire che i microorganismi possano diffondere a livello sistemico - Massimizzare la possibilità di incontro tra antigene e linfocita Sono costituiti da capsula, zona corticale e zona midollare. I linfociti circolano nel sangue ed entrano nel linfonodo tramite **HEV= high endothelial venules**, che hanno endotelio cuboidale invece che piatto. i linfociti entrano tramite vasi sanguigni ed escono tramite vasi linfatici MIDOLLO OSSEO Tessuto spugnoso nelle ossa lunghe dove avviene la maggior parte dell'**ematopoiesi**. Contiene diversi tipi di cellule: - Cellule staminali: contenute in particolari nicchie - Cellule stromali: secernono fattori di crescita e citochine che agiscono sulla nicchia staminale Differenziamento: - **Precursore comune delle cellule linfoidi** (CLP): dà origine a - Linfociti B - Linfociti T - Cellule natural killer - **Precursore mieloide** (CMP): dà origine a - Megacariociti producono piastrine - Cellule mieloidi polimorfonucleate o mononucleate - Monociti si differenziano in macrofagi *Tutti i precursori tranne quello dei linfociti T maturano nel midollo. Quelli dei linfociti T invece raggiungono il timo* Ci sono dei [fattori di crescita] importanti per il mantenimento dei vari tipi cellulari nel midollo: - C-kit ligand: mantiene in vita le staminali - Interleuchina 7: per i linfociti T - **GM-CSF**: stimola colonie granulociti e monociti - **M-CSF**: stimola colonie monocitiche - **G-CSF**: stimola colonie granulociti MILZA La milza riceve solo sangue, *NON riceve circolazione linfatica*. È suddivisa in: - **Polpa rossa**: sede dell'emocateresi (eliminazione globuli rossi vecchi) - **Polpa bianca**: filtra il sangue Il sangue arriva tramite l'arteriola centrale che sfocia nel seno marginale, sopra l'area B. L'area T si trova intorno all'arteriola ed è anche detta PALS. LOCALIZZAZIONE DELL'INFIAMMAZIONE Le **cellule dendritiche** nei linfonodi hanno due funzioni: - Presentare l'antigene ai linfociti T - Indicare dove si trova il sito di infiammazione MEMORIA TOPOGRAFICA= i linfociti T successivi cercano l'antigene direttamente nella sede in cui è entrato in contatto con l'ospite evita di girare nei vari tessuti per cercarlo I linfociti primed (= primo incontro con l'antigene) acquisiscono la capacità di migrare nella lamina propria intestinale o nel derma. La cute e la mucosa intestinale sono sede di produzione di: - Cute: **vitamina D3** - Mucosa intestinale: **vitamina A** Anche le cellule dendritiche del derma e della lamina basale dell'intestino sono produttrici di queste vitamine e istruiscono i linfociti T naive fanno esprimere delle molecole di adesione che si legano alle selectine e alle integrine del tessuto mantenendo i linfociti in quell'organo. RECETTORI - Linfociti T= TCR necessita delle cellule dendritiche per riconoscere l'antigene - Linfociti B= BCR riconosce direttamente l'antigene PRESENTAZIONE DELL'ANTIGENE Una differenza tra immunità innata e adattiva è la specificità nel riconoscimento degli antigeni: - Immunità innata: **recettori PRR** riconoscono determinate strutture molecolari microbiche NON è un riconoscimento fine - Immunità adattiva: recettori TCR e BCR riconoscimento molto specifico - **BCR**= riconoscono l'antigene così come si trova sulla superficie della cellula - **TCR**= riconosce l'antigene solo tagliato in piccoli peptidi e presentato da MHC Quindi i linfociti T riconoscono, più che il patogeno, le cellule self infettate da quel patogeno= ***altered self***. Inoltre *le cellule self che vengono riconosciute sono diverse da individuo a individuo*, quindi un TCR che riconosce le cellule dell'individuo A infettate dal virus X non è in grado di riconoscere quelle dell'individuo B infettate dallo stesso virus. Questa caratteristica è definita restrizione genetica. CELLULE PRESENTANTI ANTIGENE (APC) Due tipi di molecole MHC (major Histocompatibility Complex): - **Classe I**: espresse da tutte le cellule nucleate - **Classe II**: espresse solo da [cellule APC]= cellule che, presentando tutte le possibili tipologie di peptidi, possono fare priming e attivare i linfociti T Le cellule APC utilizzano MHC di classe II per attivare i linfociti T, mentre le cellule nucleate normali utilizzano MHC di classe I per essere riconosciute dai linfociti T nella fase effettrice. Possono essere cellule APC: - [Cellule di derivazione mieloide]: monociti, macrofagi, cellule dendritiche - [Linfociti B]: presentano l'antigene dopo una fase di riconoscimento tramite BCR hanno bisogno di essere riconosciuti dai linfociti T helper Originano dall'*ematopoiesi*: - Nel sacco vitellino, fegato e milza primi mesi sviluppo embrionale - Nel midollo osseo dal secondo trimestre di gestazione e nella vita MOLECOLE MHC Variabilità cellule MHC. È alla base del problema dei **rigetti**. Il locus dove si concentrano i geni che conferiscono queste differenze genetiche inter-individuali responsabili dei rigetti (e della restrizione genetica dei TCR) si trovano nel **braccio corto del cromosoma 6**. Questo è definito locus MHC o locus HLA. I geni MHC sono raggruppati in 3 classi, ma solo 2 sono responsabili dei rigetti: - Classe I che contiene i geni **HLA-A, HLA-B e HLA-C** - Classe II che contiene i geni **HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR** ognuna di queste sottoclassi ha 2 geni α e β Questi geni codificano per proteine trans-membrana appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline. Nel caso della classe I le proteine prodotte devono essere associate con la β2microglobulina= piccola molecola secretoria di trasporto. **Le molecole MHC-I sono espresse da tutte le cellule nucleate dell'organismo**. Nel caso della classe II invece durante il trasporto nella via esocitica si formano degli eterodimeri formati dal prodotto di un gene α e di un gene β. **Le molecole MHC-II sono espresse solo nelle varie sottopopolazioni di macrofagi, tra cui le cellule dendritiche, dalle APC e dai linfociti B.** Il locus MHC contiene i geni più polimorfici della specie umana. Per questo sono quelli che conferiscono le disparità genetiche inter-individuali riconosciute dal sistema immunitario. Queste disparità consistono in: - Polimorfismo allelico= individui diversi hanno sequenze amminoacidiche diverse - Numero di geni coinvolti nel riconoscimento immunitario= in totale sono 9 geni che però possono produrre un numero di combinazioni molto maggiori, quindi formare tantissime proteine diverse - Espressione co-dominante= ereditiamo un set di geni HLA dalla madre e uno dal padre che formano un aplotipo che viene ereditato in blocco dai ciascuno dei due genitori (i geni HLA non si separano). Quindi noi esprimiamo i prodotti proteici dei geni presenti sia sul cromosoma della madre sia del padre Quindi il rigetto dell'organo avviene perché questo esprime delle MHC diverse da quelle dell'individuo in cui viene impiantato, che infatti le riconosce come non-self. Ogni individuo esprime due alleli per ciascun gene delle due classi di MHC= un allele dal padre e uno dalla madre. Inoltre nella popolazione ci sono diverse varianti possibili per questi due alleli. Struttura: - **MHC di Classe I**: formata da due polipeptidi - Prima catena detta beta2 microglobulina - Seconda catena costituita da 3 segmenti tasca che può contenere solo peptidi corti - **MHC di Classe II**: formata da due polipeptidi costituiti da due porzioni - Alpha 1 e beta 1= parte polimorfica e tasca di legame per peptidi lunghi - Alpha 2 e beta2= sito di legame per CD4 dei linfociti T Immagine che contiene testo, design Descrizione generata automaticamente *ogni molecola MHC può legare un solo peptide alla volta* I TRC legano le MHC in base alla capacità di legare la parte non polimorfica (invariante): - CD4 lega MHC di classe II - CD8 lega MHC di classe I È importante sottolineare, quindi, che tutte le cellule dell'organismo sono potenzialmente riconoscibili da CD8 perché tutte esprimono MHC-I. Infatti tutte sono sensibili alla sua attività citotossica. Invece solo le cellule specializzate APC, che normalmente esprimono MHC-II sono riconoscibili dalle cellule CD4 (helper). CELLULE DENDRITICHE L'antigene viene trasportato dalla periferia all'**area T** degli organi linfoidi secondari dalle cellule dendritiche. Queste trasportano MHC associato all'antigene verso i linfociti T. *I linfociti T legano il complesso MCH/antigene tramite TCR specifici sia per l'antigene sia per MHC.* PRESENTAZIONE DELL'ANTIGENE [Per la cellula T l'antigene è un complesso formato da una molecola MHC e dall'antigene stesso (**pMHC**)]. Questi due elementi vengono riconosciuti da un unico recettore TCR. La molecola altered self che viene riconosciuta è appunto la molecola MHC che cambia conformazione quando lega l'antigene. *ogni MHC non lega un solo patogeno (antigene) ma può legare anche antigeni provenienti da patogeni diversi.* Questo soltanto se vengono mantenute delle caratteristiche specifiche di ogni allele di MHC. Per esempio allele I di MHC di classe I lega solo antigeni che hanno alla posizione 2 un amminoacido carico negativamente. Questi residui conservati per il legame con ciascun allele sono detti ancora, e sono quelli che stabiliscono il **contatto allele-specifico** dell'antigene. Le molecole MHC NON fanno distinzione tra peptidi derivanti da proteine self e non-self. Anche in assenza di infezione sono legate a peptidi. La capacità di distinguere self e non-self spetta ai linfociti T. quindi normalmente legano peptidi della cellula, ma quando c'è infezione legano peptidi provenienti dal patogeno, quindi antigeni. Le molecole MHC processano l'antigene in due modi (dove si forma il complesso MHC-antigene): 1. [Via endogena] **MHC di classe I** si associano al peptide nel lume del RE In assenza di infezione i peptidi a cui si legano provengono da proteine citoplasmatiche neo-sintetizzate che sono state disintegrate in gruppi di pochi amminoacidi dal proteasoma. Il proteasoma agisce nel citosol, poi la **proteina TAP** lega i residui e li porta nel lume del RE con un meccanismo ATP-dipendente. Poi delle amminoproteasi del reticolo, come **ERAP1 e 2**, permettono al complesso di arrivare alla membrana plasmatica. 2. [Via esogena] inizialmente le **MHC di classe II** sono specializzati nel legame con peptidi derivanti da proteine internalizzate dall'ambiente extracellulare Queste proteine vengono veicolate ad un *compartimento endocitico multivescicolare* acido all'interno che facilita l'operato di MHC-II. Questo compartimento è molto sviluppato nelle APC. LINFOCITI T RECETTORE TCR I linfociti convenzionali esprimono TCR che sono costituiti da catena α e catena β. Le due catene hanno struttura simile: - Porzione N-terminale molto variabile= sito di legame a MHC - Porzione costante prossima alla membrana - Porzione trans-membrana idrofobica - Cortissima coda intra-citoplasmatica NON permette al TCR di trasdurre autonomamente il segnale (devono abbinarsi ad altre molecole) Complesso del TCR Il recettore TCR ha bisogno di essere abbinato ad altre molecole per la trasduzione del segnale. - **Due molecole CD3** - **Due catene ξ** Questi elementi contengono dei motivi ITAM: fosforilabili dalle tirosin-chinasi e capaci di trasdurre il segnale. Il compesso TCR si avvale anche di co-recettori: **[CD4]** (monomero) per i linfociti T CD4 e **[CD8]** (dimero) per i linfociti T CD8. Questi due recettori possiedono la chinasi Lck che fosforila le code dei motivi ITAM attivando la vera e propria cascata di trasduzione del segnale. La **sinapsi immunologica** è l'area in cui la membrana del linfocita T e la cellula APC si trovano molto ravvicinati. In questa area interagiscono il complesso TCR e i complessi MHC/peptide. Si forma dopo l'interazione tra recettore CD4 (lega MHC-II) e CD8 (lega MHC-I). RIARRANGIAMENTO Il repertorio altamente variabile del recettore TCR è dovuto ad un processo stocastico: la ricombinazione delle catene. La regione variabile della catena β è composta dai segmenti V, D e J, mentre nella catena α sono i segmenti V e J. Nell'uomo: - Locus genico catena β: **cromosoma 7** - Locus genico catena α: **cromosoma 14** Il processo di ricombinazione prevede la scelta casuale di un gene V, un segmento J e D (se presente) e il loro riarrangiamento a formare un unico esone che codifica per la regione variabile di un recettore. Il riarrangiamento inizia quando la cromatina viene resa accessibile e permette agli enzimi di legarsi al DNA in punti particolari= RSS (Recombination Signal Sequences). Le RSS sono composte da: - 7 nucleotidi - Uno spaziatore di 12 o 23 nucleotidi - Altri 9 nucleotidi *Una RSS con spaziatore di 12 si ricombina sempre con una RSS con spaziatore di 23* Il legame degli enzimi alle due sequenze di ricombinazione RSS fa creare un **loop nel DNA** il cui contenuto viene tagliato via, mentre le estremità vengono unite. Il processo richiede 4 fasi: 1. *Synapsis*: formazione del loop 2. *Cleavage*: intervento enzimi RAG1 e RAG2 tagliano il DNA creando double strand breaks che si richiudono nella **harpins** 3. *Hairpin opening and end-processing*: enzima Artemis riapre le harpins e TdT aggiunge nucleotidi per chiudere le estremità 4. *Joining*: ricongiunzione finale delle estremità Il riarrangiamento avviene prima nella catena β che, una volta completata, arriva alla membrana trasportata da una proteina invariante che "surroga" la subunità α. Si forma così il pre-TCR, che poi si lega a **CD3** e inizia a trasmettere segnali intracellulari. Successivamente avviene il riarrangiamento anche nei loci genici che codificheranno per la catena α. Al termine del processo si ha la trascrizione in RNA di una catena α e una catena β diversa per ogni linfocita e questi possono riconoscere tantissimi linfociti diversi. Il TCR completo infine inizierà a co-esprimere CD4 o CD8. MATURAZIONE LINFOCITI T *I linfociti derivano dalle cellule staminali ematopoietiche presenti nel midollo osseo*. Successivamente, in base a dove si recano i precursori, se rimangono nel midollo oppure vanno nel timo, si ha differenziamento in linfociti B o T. TIMO Il timo è un organo bilobato che tende a rimpicciolirsi con il passare del tempo. Al suo interno ci sono zone corticali e zone midollari e tende a rimpicciolirsi con il passare del tempo. È vascolarizzato e possiede [vasi linfatici unicamente efferenti]. - **Zona corticale**: entrano i linfociti T tramite il circolo sanguigno, le cellule epiteliali producono IL-7 (fattore di crescita) - **Zona midollare**: contiene cellule presentanti l'antigene che educano i linfociti e prevengono autoimmunità I linfociti passano dalla zona corticale alla midollare e alla fine della maturazione escono come linfociti T naive nel circolo sanguigno per raggiungere gli organi linfoidi secondari. Il linfocita T naive è maturo e ha un TCR funzionale. Immagine che contiene testo, schermata, Carattere Descrizione generata automaticamente - Precursore pro-T= cellula doppio negativa (DN) non ha TCR e non esprime né CD4 né CD8 Si trova nella zona corticale e sopravvive grazie a IL-7. I timociti riarrangiano la catena β tramite RAG1 e RAG2, che poi si associa alla catena provvisoria pre-α. - Precursore pre-T: hanno la catena β riarrangiata legata alla catena pre-α La **catena pre-α** serve per dare stabilità al pre-TCR, che manda segnali intracellulari: - Segnale di proliferazione - Stimolazione della ricombinazione della catena α finale - Segnale di esclusione allelica solo uno dei due alleli della catena β viene riarrangiato così NON vengono espressi due tipi di catene diverse - **DP= cellula doppio positiva** può esprimere sia CD4 che CD8 EDUCAZIONE TIMICA Processo fondamentale affinchè i linfociti T riconoscano molecole non-self da self. Se non ci fosse questo processo i linfociti sarebbero [autoreattivi]. Per questo problema si sono evoluti meccanismi di **tolleranza centrale e periferica**= i linfociti T autoreattivi vengono eliminati. Il timocita DP va a testare il suo TCR sulle cellule presentanti l'antigene nella zona midollare con 4 possibili risultati: 1. Il TCR NON riconosce alcun antigene apoptosi del timocita 2. Il TCR lega ad alta affinità un peptide self eliminato perché autoreattivo= **selezione negativa** 3. Il TCR lega a bassa affinità un peptide self= in periferia lega ad alta affinità quelli non self matura completamente e inizia ad esprimere CD4 o CD8= **selezione positiva** 4. Presenta affinità intermedia tra 2 e 3= diventa cellula T regolatoria **L'affinità dei TCR viene valutata nel timo nei confronti di antigeni self** Per *linfociti T autoreattivi nei confronti di antigeni che NON si trovano nel timo* le cellule MTEC esprimono il fattore di trascrizione AIRE che porta antigeni anche non specifici del timo Tutti i linfociti T naive del nostro organismo, quindi, sono risultato della selezione positiva= sono tutti potenzialmente autoreattivi a bassa affinità. Per questo ci sono ulteriori meccanismi di tolleranza periferica. - ANERGIA: se il linfocita riceve solo il segnale 1 ma NON il segnale 2, il suo TCR inizia a trasdurre ma NON può proliferare Per l'attivazione i linfociti devono avere 2 segnali: 1. Riconoscimento antigene tramite TCR 2. **Co-stimolazione**= molecole nella membrana della cellula dendritica comunicano al linfocita T di attivarsi (perché le molecole MHC potrebbero aver legato anche un peptide self) La mancata attivazione dei linfociti T può essere dovuta all'assenza del segnale 2, ma anche all'attivazione di recettori inibitori presenti su linfociti T come PD1 e CTLA-4= **molecole di checkpoint**. - SOPPRESSIONE: avviene per mezzo delle cellule T regolatorie che possono derivare dal timo oppure essere indotte localmente in risposta a segnali citochimici Le cellule Treg possono agire in modi diversi: - Se il segnale costimolatorio è troppo basso sulle cellule dendritiche Treg competono con i linfociti T per il legame - Competono per il legame delle citochine che permettono la proliferazione dei linfociti T - Secernono citochine immunosoppressorie (IL-10) che riducono l'attivazione del sistema immunitario - DELEZIONE: se il linfocita T CD8 lega antigene self ad alta affinità ma non riceve co-stimolazione muore per apoptosi RECETTORI PER L'ANTIGENE LINFOCITI T E B DIVERSITÀ RECETTORIALE Ogni cellula T o B matura esprime un recettore per l'antigene con un'unica specificità diversa da cellula a cellula Le unità che riconoscono gli antigeni sono associate a molecole accessorie per la trasduzione del segnale e formano il complesso recettoriale antigenico. Fanno parte della famiglia delle **[immunoglobuline]**, i cui archetipi sono gli anticorpi. Sono tutti recettori trans-membrana che permettono alle cellule di interagire con l'ambiente esterno. L'elemento strutturale comune è il dominio immunoglobulinico Ig fold= coppia di **foglietti β** formati da due filamenti β che circondano un nucleo centrale idrofobico, c'è un *singolo ponte disolfuro* tra due cisteine. *Nel caso di TCR e BCR SOLO il dominio amminoterminale verso l'esterno della cellula è ipervariabile* varia per creare le diverse ricombinazioni per gli antigeni. Questa regione ipervariabile si chiama: - Clonotipo per TCR - Idiotipo per BCR I due recettori hanno strutture diverse: - BCR è formato da: - Due catene leggere - Due catene pesanti: formano la struttura principale e definiscono il tipo di anticorpo - TCR è formato da: - [Una catena α leggera] raramente γ - [Una catena β pesante] raramente δ I TCR sono formati da due tipi di sequenze: - **Dominio variabile V**: dominio amminoterminale verso l'esterno - **Domini costanti C**: verso la membrana uguali in tutti i TCR Il recettore è un [eterodimero] formato da due subunità (α e β), ciascuna con una regione C e V. PROCESSO DI RICOMBINAZIONE Nel genoma ci sono numerose varianti del segmento V e un numero inferiore di varianti dei segmenti D e J. A monte di questi segmenti c'è la regione costante C (da 1 a 4 domini immunoglobulinici). 1. Un segmento casuale D e uno J vengono uniti il materiale in mezzo forma un loop e viene tagliato 2. Viene aggiunto un segmento casuale V **Sulle catene leggere la ricombinazione è VJ mentre su quelle pesanti V(D)J.** I segmenti V(D)J si riarrangiano nel genoma, che poi viene trascritto e tradotto per formare le catene pesanti o leggere dei recettori. Quindi ci sono determinati cromosomi che contengono i 3/2 segmenti che andranno a formare la regione variabile della catena pesante o leggera a seconda del cromosoma. Nel BCR i loci che contengono i segmenti sono su 3 diversi cromosomi: - Cluster genico IgH (catena pesante) sul **cromosoma 14** - Cluster genico IgK (una catena leggera) sul **cromosoma 2** - Cluster genico IgL (seconda catena leggera) sul **cromosoma 22** Il taglia e cuci del genoma durante la ricombinazione è effettuato dagli [ENZIMI RAG] Nel TCR i geni soggetti a ricombinazione si trovano su 3 loci: - TCRA/D: geni codificanti per subunità α e δ - TCRB: geni codificanti per subunità β - TCRG: geni codificanti per subunità γ *I loci TCRA e TCRG NON contengono segmenti D.* Questi riconoscono brevi sequenze conservate NON codificanti dette ***RSS***, che separano ogni singolo segmento V, D e J. Ogni RSS è costituita da: - Un eptamero - *Uno spacer di 12 o 23 paia di basi* - Un nonamero L'eptamero e il nonamero sono le sequenze a cui si legano le RAG. Lo spacer può essere di 12 o 23 cromosomi e la ricombinazione segue la **regola del 12/23**= si possono appaiare soltanto segmenti che hanno RSS una di 12 e una di 23 coppie di basi. Questa serve per evitare appaiamenti tra omologhi. [Riarrangiamento del cluster IgH (pesante)] - Il segmento V1 viene unito ai segmenti DJ precedentemente riarrangiati - Avviene il taglio a doppia catena del DNA in corrispondenza della giunzione tra sequenza codificante dei segmenti= **NHEJ** - Il DNA tra i due segmenti viene eliminato in un processo di looping out - **Enzima TdT** aggiunge o toglie dei nucleotidi per sistemare le imprecisioni del NHEJ Nei 2/3 dei casi l'esito della ricombinazione è un *frameshift* che interrompe la sequenza codificante e impedisce la formazione della proteina. Se non si forma un recettore funzionante la cellula T o B viene eliminata. Differenza tra TCR e BCR: - TCR la specificità antigenica rimarrà sempre la stessa una volta finita la maturazione timica - BCR possono subire ulteriori riarrangiamenti nei centri germinatici degli organi linfoidi secondari, questi possono interessare: - Regioni VDJ precedentemente riarrangiate= **ipermutazione somatica** - Regione C: determina la classe dell'anticorpo= **class switch recombination** LEGAME ANTIGENE-RECETTORE Il primo incontro tra linfocita e APC, mediato da TCR, può avere conseguenze diverse a seconda del contesto in cui avviene: - Nel timo può portare all'apoposi della cellula T in maturazione che produce delezione clonale delle cellule T autoreattive - In un organo linfatico secondario determina proliferazione e differenziamento - In un tessuto periferico (ci sono T già differenziate) si attiva la funzione effettrice L'interazione tra TCR e MHC è regolata da una soglia di affinità quando l'affinità è sufficiente i TCR formano dei **microcluster**= *decine di recettori ravvicinati in un'area ristretta*. Questi si concentrano in un'area di contatto tra le due cellule, lì sono presenti anche [co-recettori] (CD4 o CD8) e [molecole di co-stimolazione] (CD28). Intorno al microcluster si forma un anello con molecole di adesione e integrine chiamato **sinapsi immunitaria**: - "cuore" della sinapsi è chiamato cSMAC: contiene TCR e co-recettori - L'anello periferico è chiamato pSMAC: contiene molecole di adesione Nella sinapsi immunitaria, sulla membrana plasmatica si trova un arricchimento di **sfingolipidi** e **colesterolo** che formano delle zattere rafts lipidiche. Queste hanno solitamente code lipidiche con aggiunte post-traduzionali come [palmitoilazione] e [isoprenilazione], che le rendono in grado di spostarsi facilmente nel doppio strato lipidico. *I raft si formano nel momento e nella sede in cui il TCR ingaggia il suo ligando* TRASDUZIONE DEL SEGNALE MEDIATA DA TCR I TCR NON hanno attività catalitica propria, per questo hanno bisogno della sinapsi immunologica che concentri tutte le molecole necessarie in un unico punto. *Il primo ad agire è **LCK***. È costutivamente associato alla regione dei co-recettori CD4 o CD8, e quando questi vengono ingaggiati da MHC, LCK viene trascinata nel cSMAC dove [fosforila] i suoi substrati. I suoi substrati sono i **residui di tirosina di ITAM** (CD3), che successivamente diventano appetibili per proteine con domini SH2, come la tirosin chinasi **ZAP70**, che a sua volta va a fosforilare le tirosine di **LAT**. LAT fosforilata si lega a molecole di signaling: - Adattatori GRB2 e SLP76 - **Fosfolipasi Cγ1**: idrolizza PIP2 in DAG e IP3 che aprono i canali al **calcio** della membrana; il calcio libero poi attiva **calmodulina e calcineurina**, che a loro volta attivano **NFAT** che induce IL2 - Regolatori del citoscheletro actinico: VAV Questo porta ad un rimodellamento del citoscheletro actinico e all'*appiattimento del linfocita T*. Regolazione di LCK: contiene due residui di tirosina che, se fosforilati, uno porta inattivazione e l'altro attivazione - *Tyr505*: inibita dalla fosforilazione - CSK fosforila - CD45 defosforila - *Tyr394*: attivata dalla fosforilazione - Auto-fosforilata da LCK - Defosforilata da SHP1, SHP2, PTPN22 AMPLIFICAZIONE CLONALE In seguito al legame tra i recettori e l'antigene, quindi in seguito all'infezione, avvengono 3 processi: 1. Amplificazione clonale: vengono prodotti milioni di cloni della cellula T con stessa identica specificità antigenica 2. Contrazione: una volta eliminato il patogeno il 90-95% di quelle cellule T vengono eliminate 3. Memoria immunologica: le cellule T rimaste diventano cellule T della memoria *L'amplificazione avviene in una o poche stazioni linfatiche*, per questo si ha iperplasia dei linfonodi I fattori determinanti sono: - **Espressione di IL2R**= recettore per il fattore di crescita delle cellule T - **Produzione di IL2** da parte delle cellule T CD4: può agire in modo autocrino o paracrino In questo processo ha un ruolo fondamentale il [fattore di recettore NFAT], che stimola l'espressione dei geni IL2R e IL2. NFAT è il bersaglio farmacologico della **Ciclosporina A**= immunosoppressore usato nei trapianti. Questa inibisce la calcineurina, impedendo l'attivazione di NFAT. TOLLERANZA IMMUNOLOGICA Con tolleranza si intende l'eliminazione di tutti i linfociti T potenzialmente auto-reattivi. I meccanismi di tolleranza possono essere: - Centrali - Periferici TOLLERANZA CENTRALE La maturazione dei linfociti avviene nel timo principalmente durante lo sviluppo embrionale= *condizioni sterili in cui l'unica componente a cui è esposto il SI è il self*. Dopo il riarrangiamento del TCR e la formazione del complesso con catena α e β riarrangiate i timociti (linfociti nel timo) iniziano a **co-esprimere CD4 e CD8** (doppi positivi). A questo punto gli unici ligandi sono complessi MHC legati a molecole self Quindi se il doppio positivo lega un pMHC il complesso TCR/CD3 inizia a trasdurre il segnale. Il legame è stabilizzato da uno dei due co-recettori CD4 o CD8: - Se il pMHC è di classe I allora CD8 - Se il pMHC è di classe II allora CD4 Questi due recettori interagiscono con regioni non polimorfiche dei complessi MHC. Dopo il legame il timocita diventa **singolo positivo** perché l'altro co-recettore viene silenziato. L'effetto finale dei segnali intracellulari può essere diverso: - Se l'affinità del recettore per il complesso pMHC supera una certa soglia i segnali trasdotti attivano un programma apoptotico nel timocita= **AICD (Activation Induced Cell Death)** troppo reattivo per il self - Se l'affinità è bassa/intermedia i timociti sono selezionati positivamente e ricevono segnali di survival escono dal timo e migrano in periferia (*1-2% di tutti i timociti che maturano*) *Come si fa a verificare se i timociti sono auto-reattivi anche per auto-antigeni che NON sono presenti nel timo?* **AIRE** è una proteina regolatorie espressa solo dalle cellule epiteliali dello stroma timico nella zona midollare (**cellule mTEC**). Si lega alla lisina 4 dell'istone H3 e porta alla deconvoluzione della cromatina. Questo porta alla [trascrizione di geni che normalmente NON sono espressi nel timo]= geni del fegato, delle ghiandole endocrine. Le cellule mTEC sono quindi una "vetrina" che espone antigeni self anche non tipici del timo Per aumentare l'esposizione di questi auto-antigeni tessuto specifici (**TSA**) le mTEC fanno apoptosi e vengono fagocitate dalle cellule dendritiche. Queste successivamente espongono i peptidi derivati sui loro MHC. *Una volta in periferia i linfociti T maturi come riconoscono antigeni estranei?* La regione più variabile del TCR (**CDR**) prende contatto direttamente con il peptide nella tasca dell'MHC. I legami che si formano sono relativamente deboli ma sono molti. Poi altre parti del TCR si legano direttamente alla molecola MHC. Quindi l'affinità del legame tra pMHC e TCR è alta ma non altissima Questo è compensato dal fatto che la cellula che presenta l'antigene esprime molti pMHC identici, che quindi ingaggiano più TCR contemporaneamente. **Un determinato TCR poi può cross-reagire anche con peptidi leggermente diversi tra loro**. Quindi esiste un certo grado di degenerazione e plasticità. TOLLERANZA PERIFERICA La tolleranza periferica evita che un certo TCR possa reagire ad alta affinità con un complesso pMHC che non ha mai incontrato. Ci sono diversi meccanismi all'origine della tolleranza periferica: - **Gli auto-antigeni tessuto-specifici (periferici) sono poco accessibili al riconoscimento da parte delle cellule T naive** In condizioni normali le cellule T naive NON entrano in contatto con questi antigeni. Infatti per attivare la cellula T naive ci deve essere un contatto protratto con una cellula dendritica che espone il pMHC. Infatti le DC prelevano l'antigene dalla periferia, dove si trova, e lo portano agli organi linfoidi secondari, dove può avvenire il contatto con il TCR. I linfociti T naive NON circolano in periferia NON vengono in contatto con questi antigeni. Infatti solo dopo che sono stati attivati proliferano e migrano in periferia. - **Le DC immature sono tollerogeniche** Le DC immature (assenza stimolo infiammatorio o infezione), anche se sono legate ad un peptide self, NON sono in grado di attivare le cellule T naive. Anzi se sono legate ad antigeni self non solo non sono in grado di attivarle ma le inducono in uno stato di protratta anergia funzionale. Teoria del danger: il SI può tollerare antigeni estranei se questi sono presentati dalle cellule T in assenza di infiammazione - **Cellule T regolatorie** Il **fattore di trascrizione FOXP3** è espresso da una sottopopolazione di CD4 che [NON vengono selezionate negativamente ma legano ad alta affinità antigeni self]. Quindi questi raggiungono la periferia e in risposta al contatto con auto-antigeni iniziano a proliferare e a produrre citochine che sopprimono la funzione delle cellule T. Per questo sono dette cellule T regolatorie. Qualora in fase di danger venga erroneamente presentato un antigene self, le T regolatorie spengono i linfociti T auto-reattivi. Il 95% di queste T regolatorie viene prodotta nel timo, mentre una piccola percentuale viene indotta direttamente in periferia. FUNZIONE EFFETTRICE La risposta adattiva mediata dalle cellule T si innesca tramite vari meccanismi: 1. Maturazione delle DC 2. First date tra cellule T naive e DC 3. Polarizzazione cellule T 4. Caccia all'antigene MATURAZIONE DELLE DC Il patogeno deve essere internalizzato dalle cellule DC residenti nel tessuto dell'infezione. Se non avviene NON si organizza neanche una risposta adattiva primaria efficace. Dopo il riconoscimento avviene la maturazione delle DC. Il primo passo per la maturazione delle DC è l'espressione sulla loro membrana di **CCR7**, un recettore per le chemochine **CCL19 e CCL21**. Il gradiente di queste chemochine fa migrare la DC dal sito di infezione, dove ha legato l'antigene, verso i linfonodi vicini. Mentre sono in viaggio completano la loro maturazione: - Processano l'antigene legandolo ai complessi MHC - Esprimono varie molecole co-stimolatorie per l'attivazione delle cellule T: **CD80, CD86, ICOSL, CD40** LINFONODO Il linfonodo è il setaccio delle cellule immunitarie e ce ne sono 500-700 in tutto il corpo. I vasi linfatici afferenti drenano gli organi e i tessuti e raggiungono il linfonodo nel **seno sottocapsulare**, dove risiedono macrofagi specializzati che captano eventuali sostanze che sono sfuggite alle DC. La zona esterna contiene i **follicoli** ricchi di linfociti B. Nella parte più centrale invece ci sono le cellule T naive che arrivano dal sangue tramite le HEV (High Endothelial Venules). Le T naive sono attratte in questa zona da particolari chemochine omeostatiche, come **CXCL12**, che vengono prodotte anche in condizioni di non infiammazione. FIRST DATE - Se il linfocita T NON incontra un antigene con complesso pMHC riconoscibile abbandona il linfonodo tramite i vasi efferenti e rientra in circolo. Può farlo perché esprime il recettore per la **Sfingosina 1 fosfato (S1PR)** che fa uscire i linfociti dal linfonodo seguendo il gradiente della S1P, concentrata nei linfatici efferenti e abbondante nel plasma. - Se invece il linfocita T incontra l'antigene riconosciuto l'interazione T-DC si protrae a lungo perchè si crea la [sinapsi immunitaria]. In questa sinapsi sono coinvolti anche i co-recettori CD4 o CD8 oltre ad altri recettori di co-stimolazione: **CD28 e ICOS**. La zona periferica è poi stabilizzata da recettori di adesione, come l'**integrina leucocitaria LFA-1**. A questo punto la cellula T spegne l'espressione di S1PR in modo da rimanere nel linfonodo, dove poi comincia l'amplificazione clonale. I fattori determinanti di questa amplificazione sono: - Espressione di **IL2R** - Produzione IL2 da parte delle cellule T CD4 agisce in modo autocrino Questi due elementi portano all'attivazione di fattori di trascrizione. Per esempio **NFAT**= espresso dalle cellule T e bersaglio farmacologico della Ciclocporina A. L'interazione tra TCR e complesso pMHC è regolato da una [soglia di affinità] e quando è sufficiente i TCR formano dei **microcluster**= insieme di recettori in un'area ristretta. In questa area ci sarà un numero uguale di pMHC identici che servono per attivare il linfocita T. A questo punto si forma la sinapsi immunologica. La membrana della sinapsi immunitaria ha una grande quantità di **sfingolipidi e colesterolo** formano dei rafts lipidici con delle modificazioni che fanno sì che le molecole che ci si trovano possano muoversi rapidamente in quello spazio. *Molte proteine coinvolte nella trasduzione del segnale sono concentrate su questi rafts= LCK, FYN, ZAP-70, LAT*. Il recettore TCR, poi, NON ha attività catalitica propria e il signalosoma si forma grazie all'assemblaggio istantaneo di recettori, co-recettori e adattatori. *Il primo ad agire è **LCK***. È costutivamente associato alla regione dei co-recettori CD4 o CD8, e quando questi vengono ingaggiati da MHC, LCK viene trascinata nel cSMAC dove [fosforila] i suoi substrati. I suoi substrati sono i **residui di tirosina di ITAM** (CD3), che successivamente diventano appetibili per proteine con domini SH2, come la tirosin chinasi **ZAP70**, che a sua volta va a fosforilare le tirosine di **LAT**. LAT fosforilata si lega a molecole di signaling: - Adattatori GRB2 e SLP76 - **Fosfolipasi Cγ1**: idrolizza PIP2 in DAG e IP3 che aprono i canali al **calcio** della membrana; il calcio libero poi attiva **calmodulina e calcineurina**, che a loro volta attivano NFAT che induce IL2 - Regolatori del citoscheletro actinico: VAV In questo processo ha un ruolo fondamentale il [fattore di recettore NFAT], che stimola l'espressione dei geni IL2R e IL2. NFAT è il bersaglio farmacologico della **Ciclosporina A**= immunosoppressore usato nei trapianti. Questa inibisce la calcineurina, impedendo l'attivazione di NFAT. REGOLAZIONE LCK LCK contiene due residui di tirosina che, se fosforilati, uno porta inattivazione e l'altro attivazione - *Tyr505*: inibita dalla fosforilazione - CSK fosforila - CD45 defosforila - *Tyr394*: attivata dalla fosforilazione - Auto-fosforilata da LCK - Defosforilata da SHP1, SHP2, PTPN22 La regolazione rapida del signaling mediato da TCR è centrata sulla modulazione positiva o negativa della funzione di LCK. REGOLAZIONE TARDIVA Per quanto riguarda i meccanismi di *[regolazione negativa]* delle cellule T successivi al legame con l'antigene sono importanti due proteine: - **CTLA4**= recettore di membrana con gli stessi ligandi di CD28 (CD80 e CD86) ma con alcune differenze: CD28 CTLA4 ---------------------------------- ----------------------------------- Costitutivo nelle cellule T Indotto da stimolo Affinità più bassa per i ligandi Affinità molto alta per i ligandi Attiva cellule T Inibisce attivazione - **PD1**= espresso solo dopo l'attivazione mediata dal TCR, ha due ligandi: - PD1L1: espressione tissutale molto diffusa - PD1L2: espresso solo nelle APC Entrambe queste molecole si legano a **SHP2**= tirosina-fosfatasi che defosforila vari adattatori del signaling del TCR. La defosforilazione di questi porta all'interruzione della trasduzione del segnale. Ci sono due differenze fondamentali nella modalità d'azione di PD1 rispetto a CTLA4: 1. PD1 esercita attività inibitoria solo se viene ingaggiato contemporaneamente il TCR 2. L'inibizione di PD1 è efficace SOLO sulle cellule T differenziate e ha luogo principalmente nei tessuti periferici POLARIZZAZIONE CELLULE T Nelle cellule T attivate dall'antigene inizia un programma di differenziamento. Differenziamento in CD8: conferisce la capacità di perforare la membrana plasmatica delle cellule bersaglio. Sono fondamentali due molecole: - **Perforine**: si inseriscono nella membrana creando dei pori-canale - **Granzimi**: penetrano nei pori-canale e attivano le pro-caspasi apoptotiche Per questo le cellule T CD8 sono dette **citotossiche**. Differenziamento in CD4: i fattori che influenzano il destino delle CD sono: - Molti microrganismi di origine virale e batterica inducono l'espressione di citochine come IL12 e IL27, che agiscono su recettori delle CD4 e attivano un fattore di trascrizione **T-bet** induce queste cellule a esprimere *IL2, TNFα e IFNγ*: antivirali e aiutano i linfociti B Queste sono le cellule T helper 1= assistono l'espansione delle altre molecole della risposta adattiva - Alcuni endoparassiti agiscono su altri recettori inducendo la produzione di IL4, IL25 e IL37 che stimolano l'attivazione di **GATA3** che a sua volta fa produrre altre citochine Queste sono le cellule T helper 2= assistono le cellule B nella produzione di anticorpi IgE - Vari stimoli infiammatori inducono la massiva attivazione dell'inflammasoma e la produzione di IL1β, IL6, IL21, IL23 attivano il fattore di trascrizione **RORγt** Queste sono le cellule T helper 17= programmano le cellule T a produrre stabilmente citochine pro-infiammatorie *IL17 e IL22* - Stimoli diversi inducono la produzione di TGFβ attiva **FOXP3** Queste sono le cellule T regolatorie= regolano negativamente la risposta immune CACCIA ALL'ANTIGENE Oltre alla produzione di specifiche proteine i linfociti T differenziati cambiano anche corredo di molecole di adesione e di recettori chemiotattici. Il risultato è che queste cellule (**T effettrici**) perdono la capacità di circolare direttamente dal sangue ai linfonodi, ma *acquisiscono la capacità di migrare in tessuti periferici*. Questo è possibile grazie all'aumentata espressione di determinate **integrine** MEMORIA TOPOGRAFICA= i linfociti T successivi cercano l'antigene direttamente nella sede in cui è entrato in contatto con l'ospite evita di girare nei vari tessuti per cercarlo I linfociti primed (= primo incontro con l'antigene) acquisiscono la capacità di migrare nella lamina propria intestinale o nel derma. La cute e la mucosa intestinale sono sede di produzione di: - Cute: **vitamina D3** - Mucosa intestinale: **vitamina A** Anche le cellule dendritiche del derma e della lamina basale dell'intestino sono produttrici di queste vitamine e istruiscono i linfociti T naive fanno esprimere delle molecole di adesione che si legano alle selectine e alle integrine del tessuto mantenendo i linfociti in quell'organo. MEMORIA IMMUNOLOGICA La risposta secondaria è così efficace che generalmente la re-infezione NON si manifesta nemmeno a livello clinico. Al ridursi della concentrazione di antigene il 90% delle cellule T muore per apoptosi. Anche al picco della fase di espansione alcune cellule T revertono ad uno stato di quiescenza e sopravvivono. Queste cellule che sopravvivono sono i linfociti T della memoria. Secondo alcune teorie queste vengono generate anche precocemente tramite divisione asimmetrica= solo una delle due cellule figlie riceve fattori trascrizionali che la mantengono in questo stato. Esistono vari fenotipi delle cellule T-memoria: - **stem cell memory**: negli organi linfoidi, lunghi periodi di quiescenza ma veloce rientro in circolo - **central memory cell**: passano incessantemente da sangue a linfonodi - **effector memory e tissue resident**: nei tessuti periferici, attivano rapidamente la funzione effettrice quando l'antigene si presenta in circolo Ci sono delle differenze tra cellule T della memoria e naive: - soglia di attivazione: per le cellule della memoria basta pochissimo antigene - emivita: le cellule della memoria hanno emivita breve ma continuano ad essere sostituite LINFOCITI B Il BCR è un anticorpo dotato di una [regione trans-membrana] e associato ad un complesso di molecole di segnalazione. Ha una forma ad Y ed è composto da: - **due catene leggere LC** che possono essere di due tipi: κ e λ - **due catene pesanti HC** che possono essere di 5 tipi: [μ,](https://it.wikipedia.org/wiki/Mi_(lettera)) [δ,](https://it.wikipedia.org/wiki/Delta_(lettera)) [γ,](https://it.wikipedia.org/wiki/Gamma_(lettera)) [α,](https://it.wikipedia.org/wiki/Alfa_(lettera)) [ε](https://it.wikipedia.org/wiki/Epsilon) Ciascuna ha una porzione costante al C-terminale. **La regione costante della HC è responsabile delle funzioni effettrici** della molecola. Infatti le catene pesanti sono quelle che determinano la classe a cui appartiene l'anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA, IgE. All'*N-terminale* invece c'è la regione variabile, che è responsabile del legame con l'antigene. Questa struttura è tenuta insieme tramite legami disolfuro. A differenza del TCR, i BCR oltre ad esistere in forma di membrana sui linfociti B, possono essere *secreti quando questi si attivano e si differenziano in plasmacellule*. In questo caso prendono il nome di **anticorpo** e sono privi della porzione trans-membrana al C-terminale. Quindi quando diciamo regione costante ci riferiamo alla forma secreta senza porzione trans-membrana e cosa citoplasmatica. I ponti disolfuro conferiscono flessibilità all'anticorpo. Questa regione infatti si chiama **hinge region** e consente alle due braccia della Y di formare un angolo di ampiezza variabile. I due siti di legame per l'antigene si trovano sulle due braccia e sono identici. Quindi l'*[anticorpo è bivalente]*= una molecola di anticorpo può legare due molecole di antigene, oppure due siti identici sullo stesso antigene. Due concetti fondamentali per descrivere un anticorpo sono: - **affinità:** forza dell'interazione tra un singolo sito di legame e l'antigene - **avidità:** misura della forza totale di interazione di ogni singolo sito dell'anticorpo con gli antigeni (un anticorpo può avere fino a 10 siti di legame) Il legame con l'antigene è mediato da *forze tutte NON covalenti:* forze elettrostatiche, ponti idrogeno, forze di Van Der Waals. Il BCR riconosce l'antigene in forma nativa (peptide in forma quaternaria), mentre il TCR lo riconosce solo tagliato in forma lineare e associato ad una molecola MHC ESPERIMENTO PROTEASI Sono stati fatti degli studi in cui si è provato a digerire gli anticorpi con due proteasi: papaina e pepsina. Papaina: dalla digestione si formano 3 frammenti - due **Fabs** che legano l'antigene - un **Fc** che tende a cristallizzare in una struttura reticolare I Fabs hanno la stessa capacità di legare l'antigene di un'immunoglobulina ma hanno due vantaggi: 1. sono molto piccoli 2. NON hanno le funzioni effetrici Pepsina: dalla digestione si formano 2 frammenti - Un frammento **F(ab')2** che lega l'antigene conservando entrambi i siti di legame - Un frammento **pFc'** GENERATORE DIVERSITÀ Il repertorio anticorpale è vastissimo: 10^11^ diversi anticorpi. Questo perché avviene la ricombinazione, come nei TCR. I loci per le immunoglobuline sono 3: - 1 per le catene leggere di tipo κ - 1 per le catene leggere di tipo λ - 1 per le catene pesanti Per ciascun locus ci possono essere 3 tipi diversi di segmento: V, D e J. Nelle catene leggere ci sono solo i segmenti V e J. Nelle catene pesanti invece prima si riarrangiano i segmenti D e J, poi viene aggiunto un segmento V. Un ultimo evento di ricombinazione avviene nell'accoppiamento casuale delle catene leggere con le catene pesanti. Tutto il riarrangiamento è mediato da un sistema enzimatico molecolare che prende il nome di **V(D)J ricombinasi**. Le molecole chiave sono **RAG1e RAG2**. Tra ogni segmento ci sono le **RSS**, che consentono agli enzimi RAG si legarsi e di cominciare il processo. L'**enzima TdT** poi aggiunge ulteriore variabilità perché può sottrarre o aggiungere nucleotidi casuali nelle zone di giunzione. *[Sindrome di Omenn]*= deficienza di RAG per cui i bambini sono incapaci di produrre BCR, quindi di produrre linfociti B maturi. Quindi alla base della diversità del repertorio anticorpale ci sono: - Diversità combinatoriale data dalla ricombinazione V(D)J - Diversità combinatoriale data dall'accoppiamento tra catene pesanti e leggere - Diversità data dall'azione di TdT Nei BCR poi esiste una diversificazione secondaria= **[ipermutazione somatica]**. Questa avviene tramite l' induzione di mutazioni puntiformi nel BCR di cellule B già stimolate per la prima volta dall'antigene e in B della memoria riattivate dallo stesso antigene che le aveva inizialmente stimolate. CLASSI DI ANTICORPI La porzione costante delle catene pesanti determina a quale classe appartiene l'anticorpo. Ciascuna classe presenta delle **differenze strutturali**, per esempio IgM e IgE NON hanno la hinge region. Altre differenze sono a livello dei **pesi molecolari**, anche perché alcuni sono secreti come monomeri, altri come pentameri, quindi il BCR in membrana è solo uno ma se viene secreto come pentamero raggiunge un peso molecolare molto superiore. Le IgA sono monomeriche ma in alcuni casi vengono secrete come dimeri. Due molecole di IgA si uniscono tramite la regione Fc grazie alla molecola J chain, che fa da ponte. Le cellule epiteliali dell'epitelio delle basse vie respiratorie e dell'epitelio intestinale hanno recettori per questi dimeri e li possono internalizzare. Le IgA infatti formano una sorta di barriera protettiva per le mucose a contatto con l'ambiente esterno. I livelli di immunoglobuline presenti nel siero di un uomo adulto mostrano come le IgG siano le più secrete, seguite da IgM e IgA; mentre NON sono quasi per niente presenti le IgE e le IgD. FUNZIONI EFFETRICI Per quanto riguarda le funzioni effettrici della regione costante, se ne possono individuare 3: - Grazie al segmento Fc le immunoglobuline legate all'antigene possono legare il **Fc receptor** presente sulle cellule dell'immunità innata - Nel caso di macrofagi e neutrofili questo porta ad un aumento della fagocitosi tramite un processo detto **opsonizzazione** - Per quanto riguarda i basofili, i mastociti e gli eosinofili invece questo porta ad un aumento del rilascio dei mediatori infiammatori - Attraverso il segmento Fc le immunoglobuline legate all'antigene attivano il **sistema del complemento** - Il segmento Fc permette il trasporto di alcuni tipi di immunoglobuline in secrezioni mucose ma anche al feto Alcuni patogeni si sono evoluti per legare e inattivare la regione Fc dell'anticorpo. Poichè le diverse classi di anticorpi differiscono proprio per la regione Fc, non tutti presentano le medesime funzioni effettrici: - *Attivazione complemento*: IgG e IgM - *Via di attivazione alternativa del complemento*: IgA - *Capacità di legare Fc receptor*: IgE Il motivo per cui NON si trovano IgE libere nel siero è proprio perchè queste tendenzialmente si trovano legate all'Fc receptor di mastociti, basofili ed eosinofili. *[I linfociti B naive producono solo IgM e IgD]*. DIVERSIFICAZIONE SECONDARIA Avviene quando i linfociti B naive hanno già riconosciuto l'antigene. Avviene secondo 3 meccanismi: 1. **Ipermutazione somatica**= accumulo di mutazioni puntiformi nelle regioni variabili 2. **Class switch recombination**= modificazione della regione costante della catena pesante 3. **Gene conversion**= rimpiazzo di interi blocchi di sequenza delle regioni variabili con segmenti che provengono dal locus V(D)J IPERMUTAZIONE SOMATICA È mediata dall'enzima **AID**, che è attivo solo quando i linfociti B hanno incontrato l'antigene. Questo enzima agisce sul single stranded DNA, quindi in fase di trascrizione, e *[deammina le citidine e le uridine]*. Queste NON hanno un posto nel DNA, quindi vengono percepite come un mismatch e vengono reclutati vari sistemi di riparazione del DNA che lo riparano in maniera non accurata causando mutazioni. Questo processo avviene in microstrutture anatomiche che si chiamano centri germinativi. Le *mutazioni dell'ipermutazione somatica sono casuali*, alcune favorevoli al legame con l'antigene, altre sfavorevoli. Successivamente, infatti, avviene un processo di selezione per cui solo i linfociti più affini verranno mantenuti. Diversi cicli di ipermutazione e selezione porteranno alla presenza di soli antigeni iper-affini per l'antigene. AID viene controllato in due modi: 1. Viene espresso solo nel centro germinativo 2. Agisce solo su single stranded DNA CLASS SWITCH RECOMBINATION *Permette agli anticorpi di cambiare classe mantenendo però la specificità per un determinato antigene*. Ogni anticorpo ha una regione variabile VDJ che riconosce l'antigene e una regione costante Ch che determina la classe dell'anticorpo. Il gene delle immunoglobuline è organizzato in modo che le regioni variabili siano a monte, mentre quelle costanti Ch a valle. Le regioni Ch sono in fila, una per ogni classe di anticorpo: 1. Cµ che codifica per IgM 2. Cδ che codifica per IgD 3. Cγ che codifica per IgG 4. Cε che codifica per IgE 5. Cα che codifica per IgA Inizialmente i linfociti B producono anticorpi IgM e IgD perché hanno le regioni costanti più vicine alla regione variabile. Successivamente per cambiare classe avviene il CSR. Per fare questo, il linfocita B "taglia" il segmento CH per IgM (Cµ) e IgD (Cδ) e collega la regione variabile (VDJ) a uno degli altri segmenti CH (come Cγ per IgG o Cα per IgA). La scelta della nuova classe non è casuale ma dipende dall'ambiente in cui si trova l'anticorpo e dalle citochine presenti. Le cellule TFH (un tipo di cellule T) rilasciano citochine che attivano specifici promotori nei segmenti CH. Questo stimola la trascrizione di un segmento CH particolare, permettendo al linfocita B di passare a una classe specifica. CELLULE LINFOIDI INNATE Si tratta di una popolazione eterogenea di cellule che esprimono caratteristiche sia dell'immunità innata che adattiva. Questa popolazione comprende cellule linfoidi innate e linfociti innati, che differiscono perché le cellule linfoidi innate NON hanno un TCR, mentre i linfociti innati hanno dei TCR invarianti. I linfociti innati hanno dei recettori di tipo γδ oppure αβ semi-invarianti, perché subiscono un riarrangiamento molto limitato. Immagine che contiene schermata, testo, diagramma Descrizione generata automaticamente CELLULE LINFOIDI INNATE Le ILC si sviluppano nel midollo osseo da un **precursore linfoide**. Il precursore esprime il fattore di trascrizione Id2 e successivamente si può differenziare in 3 tipi diversi: - Se esprime citochine IL-15 e IL-7 diventa ILC1 - Se c'è solo IL-7 può diventare ILC2 e ILC3 Ci sono delle differenze tra i vari sottogruppi: - ILC1: esprimono il fattore di trascrizione **T-bet** e producono IFNγ. Le citochine IL-12 e IL-18 aumentano la loro funzione effettrice. Hanno funzione di difesa nei confronti dei virus o dei batteri (controparte delle Th1) - ILC2: esprimono il fattore di trascrizione **GATA-3** e producono citochine IL-5 e IL-13 Risposte agli allergeni o ai parassiti (controparte delle Th2) - ILC3: esprimono il fattore di trascrizione **RORγT** e producono citochine come IL-17 e IL-22. Le ILC3 comprendono anche le lymphoid tissue inducers cells= cellule che danno vita ai tessuti linfoidi mantenimento omeostasi degli epiteli (controparte delle Th17) Le ILC iper-attivate possono causare malattie infiammatorie intestinali. Le ILC3 inoltre possono essere associate a malattie dei polmoni o a manifestazioni infiammatorie coma la psoriasi. Molto spesso sono coinvolte in malattie autoinfiammatorie. I vari sottogruppi però hanno anche delle caratteristiche comuni: - Sono residenti nelle lamine proprie o tra le cellule epiteliali dei tessuti di barriera - Sono responsive alle citochine dell'ambiente in cui risiedono CELLULE NATURAL KILLER NK Le NK sono presenti nel sangue e negli organi linfoidi, ma sono abbondanti anche nel fegato e nell'utero gravido. Svolgono le loro funzioni importanti durante la risposta immunitaria innata, ma agiscono come supporto alla funzione effettrice anche durante l'immunità adattiva. Inizialmente venivano considerate ILC1, ma differiscono da queste sotto diversi punti di vista: - Possono secernere perforine e grazimi= molecole citotossiche che uccidono la cellula target - Sono la controparte innata dei linfociti T CD8, mentre le ILC1 lo sono delle Th1 Derivano da un **precursore linfoide Id-2 positivo nel midollo**. Questo si differenzia in **precursore pro-NK** grazie ai segnali di IL-15, FLT3-L e le interazioni con lo stroma del midollo osseo. La maturazione viene completata nel midollo. Le cellule NK esprimono due tipi di recettori: - **[Inibitori]**: riconoscono molecole MHC-I che si trovano su cellule self sane hanno **motivi ITIM** che reclutano inibitori della cascata di segnalazione - **[Attivatori]**: riconoscono segnali di stress su cellule anormali hanno **motivi ITAM** che reclutano tirosin-chinasi ed elementi della cascata di segnalazione I recettori inibitori interagiscono con molecole MHC legate a peptidi self e indicano alla cellula NK di proseguire altrove e completare la sua maturazione. L'educazione delle NK è quantitativa= quanto più i recettori inibitori legano le MHC-I, tanto più la cellula NK diventa tollerante per le cellule sane e si prepara ad esprimere recettori attivatori. Le cellule NK: - Se NON interagiscono con le cellule stromali attraverso i recettori inibitori NON maturano e diventano anergiche - Se interagiscono con MHC-I vanno incontro a maturazione - Se durante lo sviluppo legano ligandi per i recettori attivatori diventano anergiche I ligandi per i recettori attivatori sono le **regioni Fc degli anticorpi di classe IgG** oppure le proteine espresse da cellule stressate o infettate. Le NK quindi raggiungono il circolo esprimendo un set di recettori attivatori e un set di recettori inibitori. Se l'attivazione degli inibitori è preponderante saranno tolleranti, viceversa saranno citotossiche. Infatti quando NK riconosce una cellula sana, lega le sue MHC-1 con i recettori inibitori e trasmette un segnale che inibisce i recettori attivatori. Se invece incontra una cellula che ha perso l'espressione di MHC-1 e invece esprime molecole che comunicano infezione, si attivano i recettori attivatori e la NK può uccidere la cellula target. Le NK possono agire nei confronti di un patogeno secondo diverse modalità: 1. *Uccisione diretta della cellula target* rilasciano perforine e grazimi che creano por nella membrana e attivano l'apoptosi È una modalità simile alle CD8 ma la differenza è che queste hanno bisogno della mediazione delle molecole APC, mentre le NK legano direttamente il target 2. *Rilascio di IFNγ* producono questo interferone che ha proprietà antivirali e stimola i macrofagi 3. ***ADCC (antibody dependent cellular toxicity)*** il recettore attivatorio CD16 lega le porzioni Fc degli IgG, quindi in presenza di un patogeno già ricoperto da IgG si attivano e lo uccidono Ipotesi del missing self= le cellule NK non si attivano tanto per la presenza di un ligando riconosciuto sulla cellula target, ma piuttosto dall'assenza del "self", ovvero dei complessi pMHC-I, che vengono espressi meno nelle cellule tumorali. Per giustificare questa ipotesi gli scienziati ipotizzarono che le NK fossero inibite dalle cellule sane, ovvero quelle che presentano espressione normale di pMHC-I. Per questo devono presentare due classi di recettori, attivatori e inibitori. Successivamente questa ipotesi venne confermata dalla scoperta dei **KIR** (Killer Immunoglobulin Receptors)= recettori espressi specificatamente dalle NK. - I KIR formano un **aplotipo (**blocco di geni che viene ereditato insieme) perché vengono generati dalla duplicazione massiva di un unico gene in uno spazio piccolo - Esistono due sottotipi di KIR in base alla quantità di **domini Ig**: - Uno ne contiene 3= si dice 3D - L'altro ne contiene 2= si dice 2D - I ligandi KIR sono rappresentati dai diversi alleli HLA di classe I quando li legano esercitano la loro funzione inibitoria sulle cellule NK I KIR inoltre si distinguono in: - KIR-L (coda lunga)= inibitori Hanno nella loro coda citoplasmatica delle **sequenze ITIM**, che reclutano due tirosina-fosfatasi quando i KIR riconoscono i loro ligandi HLA di classe I. queste spengono i segnali di attivazione per le cellule NK. Quindi i KIR-L inibiscono l'azione delle cellule NK per evitare che attacchino cellule sane. - KIR-S (coda corta)= attivatori Hanno nella coda citoplasmatica delle **sequenze ITAM**, che reclutano tirosina-chinasi attivatorie. Quindi questi hanno funzione attivatoria. Oltre ai KIR, le cellule NK esprimono costitutivamente un recettore inibitorio chiamato **KLRC1**, che ha un dominio ITIM nella regione citoplasmatica. Questo recettore riconosce la molecola ***HLA-E***, che segnala alle cellule che è tutto in ordine legando peptidi derivato dalle HLA di classe I. Se riesce a legare i peptidi significa che le HLA sono regolarmente espresse, quindi la cellula è sana. *Cosa succede se una cellula NK con KIR-S riconosce una cellula normale, che però esprime i ligandi HLA per KIR-S?* Per contrastare questo problema esiste un meccanismo di educazione delle cellule NK. *NON tutte le NK esprimono gli stessi KIR, l'espressione avviene in modo casuale* In realtà circa il 20% delle NK non esprime nessun KIR, ma solo KLRC1. L'espressione è regolata da un silenziamento epigenetico dovuto alla metilazione dei promotori di specifici KIR (ogni KIR è un'unità trascrizionale indipendente). Inoltre l'espressione dei KIR è anche del tutto indipendente da quella di HLA, quindi è possibile che ci siano delle cellule NK con KIR attivatori che riconoscono alleli HLA self. Per la maturazione della NK è fondamentale il contatto nel midollo tra KIR inibitori e i loro ligandi HLA-I self, questo affinché questi KIR non attacchino cellule self sane. Quanti più contatti il KIR inibitorio ha con HLA-I self, tanto più competente sarà la cellula NK. Successivamente, in periferia, le cellule NK che hanno superato questa prima selezione in base al contatto potranno attivarsi solo in determinate condizioni: - Riduzione o assenza di molecole HLA-I sulla membrana della cellula bersaglio - Presenza di ligandi attivatori in alta concentrazione sulla cellula bersaglio RUOLO DELLE CELLULE NK IN INFEZIONI E TUMORI - Funzioni principali: - Le NK contrastano infezioni (soprattutto virali) e tumori grazie alla loro funzione citotossica e alla produzione di citochine come IFN-γ. - Sono particolarmente efficaci contro cellule fenotipicamente alterate. - Deficit selettivi delle NK (Primary NK Deficiencies, pNKD): - Rari pazienti con mutazioni genetiche (GINS1, RTEL1, MCM4) mostrano deficit specifici delle NK. - Questi pazienti presentano: - Alta suscettibilità a infezioni da Herpes Virus (es. Varicella Zoster, Citomegalovirus, Epstein-Barr Virus). - Possibile associazione con tumori legati a infezioni virali, come linfomi associati a Epstein-Barr o HPV. - Altri linfociti (T e B) sono generalmente conservati in questi pazienti Ruolo delle cellule NK nei trapianti allogenici - Trapianto allogenico di midollo osseo: - Utilizzato per trattare alcune leucemie dopo mieloablazione (chemioterapia e radioterapia ad alte dosi). - Due fenomeni principali possono coinvolgere le NK: 1. Graft versus Host Reaction (GvHR): - Le cellule NK del donatore possono riconoscere il ricevente come \"non self\" e attaccarlo. - Questo accade quando i KIR inibitori delle NK del donatore non riconoscono gli HLA-I del ricevente. 2. Graft versus Leukemia (GvL): - Le NK del donatore attaccano efficacemente le cellule leucemiche residue nel paziente, riducendo il rischio di recidiva. - Implicazioni: - La disparità genetica tra donatore e ricevente negli HLA può avere effetti sia benefici (GvL) che dannosi (GvHR). - Questi dati sono promettenti ma richiedono ulteriori conferme LINFOCITI INNATI CELLULE T NATURAL KILLER (NKT) Le cellule NKT sono linfociti che hanno caratteristiche sia delle NK che dei linfociti T. Hanno un **recettore di tipo αβ invariante o semi-invariante**, per questo rientrano nel gruppo dei *linfociti innati*. riconoscono ligandi di tipo lipidico o glicolipidico presenti su MHC non classiche, in particolare **CD1d** Si sviluppano nel timo e, a differenza dei linfociti T, riconoscono l'antigene su altri timociti he esprimono molecole MHC non classiche. Quindi l'interazione tra due timociti può portare allo sviluppo di una NKT. Possono esprimere CD4 oppure no, ma **NON esprimono MAI CD8**. Per quanto riguarda la funzione possono modulare la loro attività in base al microambiente in cui si trovano: - le NKT possono interagire con le DC, promuovendo il DC licensing. Quando la DC non è sufficientemente attivata, può ricevere un aiuto da parte delle NKT, tramite la coppia di co-stimolazione CD40- CD40L, che è l'unica espressa sulle DC (di solito sono su linfociti T). In questo modo, le DC aumentano i loro livelli di MHC sulla superficie, aumentano la loro capacità di costimolare e, tramite IL-12, attiveranno la polarizzazione delle T naive verso le Th1 - produzione di IFNg e attivazione delle NK, dei macrofagi, delle Th1, e delle CD8 - produzione di IL-2 a promuovere la proliferazione delle cellule T - produzione di IL-4 a promuovere l'attivazione delle Th2 - produzione di IL-10 ad attivare le cellule Treg LINFOCITI T γδ Sono dei linfociti T innati che presentano un **recettore di tipo γδ,** dove: - γ assomiglia alla catena α dei linfociti T convenzionali - δ assomiglia alla catena β dei linfociti T convenzionali Originano da precursori dei linfociti T del **midollo**, poi migrano nel **timo** dove continuano la loro maturazione. Quando i timociti sono nello stadio doppio negativo attraversano delle sottofasi chiamate DN1, DN2, DN3 e DN4. *La scelta se diventare γδ avviene di solito a DN3*. In questo momento vengono riarrangiate le catene γδ anziché quelle classiche. Successivamente dal timo si dirigono in periferia verso le mucose, infatti si collocano soprattutto a livello della pelle e della mucosa gastrointestinale. [Per ogni distretto in cui si trovano il recettore γδ è diverso] Questi recettori riconoscono **antigeni di tipo lipidico** e pirofosfati batterici presentati da **MHC-I non classiche**. Inoltre possono riconoscere anche antigeni NON presentati su MHC. Oltre a questa categoria di recettori esprimono anche altri recettori innati: **TLR, Dectin 1 e NKG2D**. quindi queste cellule possono rispondere a stimoli diversi e, a seconda di questi, intervenire nella risposta immunitaria: - Secernono perforina, grazimi e citochine citotossiche - Producono IL-2, IFNγ promuovono l'attivazione dei macrofagi - Producono IL-4, IL-5, IL,13 promuovono class switch degli anticorpi Inoltre possono intervenire sia in "modo innato" all'inizio dell'infezione, sia durante, sia dopo che il patogeno è già stato eliminato e bisogna riparare il tessuto. CELLULE DEL GALT Le cellule linfoidi innate sono molto presenti anche nei **tessuti linfoidi associati alle mucose**, come il GALT. Questo perché è necessario un controllo efficace dei patogeni in questi siti di entrata. La mucosa intestinale è costituita da un solo strato di cellule epiteliali e da un sottile strato di tessuto connettivo sottostante= lamina propria, dove si trovano alcuni linfociti innati. Altri si trovano tra una cellula epiteliale e l'altra e sono i primi ad avvertire la presenza del patogeno. Queste cellule possono essere presenti già alla nascita oppure possono essere reclutate in seguito. MALATTIE AUTOIMMUNI Si tratta di *[malattie infiammatorie croniche]* con manifestazioni cliniche molto variabili. Lo stimolo all'origine della risposta infiammatoria è sempre presente perché fa parte del nostro organismo= **auto-antigene**. La distribuzione degli auto-antigeni è il fattore che determina le manifestazioni cliniche della malattia: - **Malattia organo specifica**: reazione autoimmune diretta contro uno o pochi tipi cellulari (*Morbo di Graves, tiroidite di Hashimoto, diabete di tipo I*) - **Malattia sistemica** (*artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico*) - **Malattie a patogenesi dubbia**: simile ad autoimmune ma mancano gli auto-anticorpi (*morbo di Crohn, colite ulcerosa, celiachia*) Le AID sono presenti nel 4-5% della popolazione, con netta prevalenza nel sesso femminile. La maggior parte di queste malattie sono causate da predisposizioni genetiche e fattori ambientali, ma ci sono malattie più rare di tipo [monogenico mendeliano]: - APS-1 gene mutato AIRE - IPEX gene mutato FOXP3 Queste sono le cosiddette poliendocrinopatie autoimmuni, in quanto gli organi bersaglio più comuni sono le ghiandole endocrine. Esperimento dei gemelli: un parametro fondamentale nelle malattie autoimmuni è la **concordanza**= in una coppia di gemelli in cui uno è affetto indica la frequenza con cui il fratello inizialmente sano si ammala di una determinata malattia. Si confronta la concordanza nella coppia di gemelli monozigoti e dizigoti se c'è una forte componente genetica ci si aspetta che nei monozigoti sia alta, mentre se prevalgono fattori ambientali allora non ci saranno differenze significative. Ci sono delle ipotesi che affermano che ci sia una *correlazione tra il decrescere delle malattie infettive e l'aumento delle malattie autoimmuni*= il venir meno di risposte immuni dirette contro certi patogeni, debellati dagli antibiotici, dalle vaccinazioni e dalle migliori condizioni igieniche, ha "deviato" la risposta immune contro antigeni innocui in soggetti predisposti. Ci sono dei polimorfismi che predispongono a malattie autoimmuni nella popolazione europea, che invece non sono presenti in quella africana. Ci sono due ipotesi sul motivo della distribuzione dei polimorfismi dell'autoimmunità: - Con le migrazioni sono cambiate le **abitudini alimentari**, che hanno esposto gli individui a cibi mai visti prima, che potrebbero aver slatentizzato risposte infiammatorie - Al cambiamento di zona geografica corrisponde un cambiamento di **agenti infettivi** STUDI GWAS Gli studi GWAS hanno identificato il locus predisponente principale nelle AID= **locus HLA**. Questo si trova sul **cromosoma 6** e codifica per le **molecole MHC**. Certe varianti alleliche codificanti per molecole MHC sono fortemente predisponenti per le malattie autoimmuni, altre varianti invece risultano protettive. Spondidolite anchilosante= rara malattia autoimmune delle articolazioni vertebrali l'allele HLA-B27 conferisce un rischio di sviluppare la malattia 87 volte maggiore rispetto a coloro che non la hanno. L'allele HLA predispone a malattie autoimmuni perché lega auto-antigeni con molta efficienza e li espone al riconoscimento nelle sedi periferiche. Malattia celiaca= il 100% dei pazienti ha uno o entrambi gli alleli di HLA di classe II. L'antigene che scatena la malattia è un peptide derivato dalla **gliadina**, un costituente del glutine, che si lega fortemente a HLA e fa si che venga presentato l'antigene molto efficacemente per il riconoscimento da parte dei linfociti T. L'allele HLA associato al rischio di malattia autoimmune può essere predisponente in due modi opposti: 1. Legando con [maggiore] affinità il peptide self in periferia rompendo la tolleranza periferica 2. Legando con [minore] affinità il peptide self a livello timico Nella tabella ci sono i principali polimorfismi predisponenti a malattie autoimmuni. I più frequenti sono a carico del gene PTPN22, CTLA4 (regolatore negativo della risposta immune), dei recettori per le citochine come IL23 e del recettore a bassa affinità per IL2. Le varianti che riguardano il gene codificante per **IL23** sono fortemente collegate alla *psoriasi, alla spondilite anchilante e a malattie infiammatore intestinali*. Mentre varianti del gene **PTPN22** predispongono al *diabete di tipo I e all'artrite reumatoide*. La maggior parte di questi polimorfismi casca in regioni regolatorie che alterano quantitativamente i livelli di espressione dei geni associati alla risposta immune, come l'aumento della produzione di varie citochine. PTPN22 I polimorfismi legati a questo gene sono secondi solo al locus HLA come predisposizione a malattie autoimmuni. In particolare è pericolosa una variante nel [codone 620] che porta alla sintesi di **triptofano** al posto di **arginina**. Si tratta di un cambiamento strutturale importante perché Arg è un piccolo amminoacido carico positivamente, mentre Trp è grosso e idrofobico. I soggetti omozigoti per questo polimorfismo hanno maggiore rischio di diabete. La mutazione in omozigosi comporta un mancato funzionamento del meccanismo di inattivazione di LCK, che comporta un'iperattivazione del segnale intracellulare del TCR. PATOGENESI DELLE AID Le AID sono malattie molto eterogenee, ma alla base hanno meccanismi patogenetici simili: 1. Presenza di linfociti T autoreattivi 2. Presenza di autoanticorpi circolanti 3. Presenza di immunocomplessi= complessi antigene-anticorpo LINFOCITI T AUTOREATTIVI Possono riconoscere e uccidere una cellula causando anche diminuzione o perdita della funzionalità di un organo. La possibilità di un antigene di legarsi alla molecola HLA dipende da concentrazione e affinità. Alcuni auto-antigeni sono definiti **criptici** perché sono prodotti in quantità così basse che non possono associarsi a molecole HLA viene ignorato dalle cellule T. per scatenare una risposta autoimmune servono peptidi self qualitativamente e quantitativamente adeguati AUTO-ANTICORPI-LINKED RECOGNITION Se un linfocita B riconosce un proprio antigene X e questo è parte di un complesso molecolare insieme all'antigene Y, la cellula B anti-X è in grado di internalizzare il complesso molecolare X-Y. Quindi sia peptidi derivati da X che da Y saranno generati e associati a molecole MHC-II saranno richiamate cellule T specifiche sia per Y. *le cellule T anti-Y possono fornire help alle cellule B anti-X* Se l'antigene X è un autoantigene, le cellule T anti-Y aiutano una reazione di autoimmunità. Artrite reumatoide: il fattore reumatoide è un autoanticorpo diretto contro la **regione costante delle IgG**. Le cellule B che esprimono questo BCR autoreattivo internalizzano complessi formati dalle IgG insieme a microrganismi. Quindi cellule T reattive contro i peptidi derivati dal microrganismo forniscono aiuto alle cellule B contro la regione costante delle IgG. Lupus eritematoso sistemico (LES): il processo della linked recognition spiega la genesi di autoanticorpi contro il DNA caratteristici di questa malattia, ma in questo caso anche le *cellule T sono autoreattive*, non solo le cellule B. Un linfocita B che ha un anticorpo autoreattivo che riconosce il DNA, internalizza quest'ultimo insieme a tutto ciò a cui è complessato (proteine istoniche). Poi questo linfocita presenta i peptidi derivati dalla proteina istonica ad un linfocita T auto-reattivo. Quindi il linfocita B riceverà help da queste cellule T e produrrà **anticorpi anti-DNA**. Miastenia gravis: malattia che si manifesta come debolezza della muscolatura striata (oculomotori, mimica facciale e respiratori). È dovuta ad autoanticorpi che riconoscono i recettori colinergici e paralizzano la trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuro-muscolare. IMMUNOCOMPLESSI Per avere un ruolo patogenico l'immunocomplesso deve essere di grandi dimensioni e alto peso molecolare, per questo l'antigene deve essere **multivalente**. Questa multivalenza può significare due cose: - Meno probabile: la stessa molecola di antigene presenta tante identiche strutture ripetute riconosciute da tanti anticorpi - Più probabile: gli antigeni sono complessi molecolari che vengono riconosciuti da tanti auto-anticorpi anche con specificità diverse Gli immunocomplessi possono fare danno innescando una serie di **reazioni infiammatorie** importanti. Per esempio se si deposita sulla *[parete di un vaso]* può attirare cellule come neutrofili, monociti e cellule NK, che si attivano e rilasciano i propri mediatori pro-infiammatori e lesivi per i tessuti. La conseguenza clinica di questa precipitazione, quindi di infiammazione massiva locale, è la vasculite, che si manifesta come lesioni tondeggianti, rosse e rilevate soprattutto negli arti inferiori. Un'altra regione dove spesso avviene precipitazione di immunocomplessi è il *[glomerulo renale]*, con conseguenza la nefrite. Inoltre si possono formare anche immunocomplessi extravascolari, successivi a quelli intravascolari, che possono attivare i neutrofili nello stesso modo causando infiammazione. Sindrome di Goodpasture: sindrome autoimmune che presenta emorragia alveolare e gromerulonefrite provocate da anticorpi anti-membrana basale gromerulare. Tendenzialmente si sviluppa in soggetti geneticamente suscettibili e fumatori. I sintomi comprendono dispnea, tosse, astenia, emottisi ed ematuria. La prognosi è buona se si inizia il trattamento prima della comparsa di insufficienza respiratoria o renale. Il trattamento include scambi plasmatici, corticosteroidi e immunosoppressori. RIGETTO TRAPIANTI Ci sono diverse tipologie di trapianti: - **Trapianto autologo** (isotrapianto): trapianto di un tessuto dallo stesso individuo donatore e ricevente coincidono (cute, tendini, ossa, midollo) - **Trapianto allogenico** (allotrapianto): individui geneticamente diversi ma della stessa specie - **Trapianto isogenico**: individui geneticamente identici (gemelli monozigoti) - **Trapianto xenogenico**: donatore e ricevente di due specie diverse Il rigetto è mediato dal sistema immunitario, in particolare da quello adattivo. Si verifica solo nei pazienti immunocompetenti ed è collegato al grado di diversità dei geni HLA tra ricevente e donatore. Graft versus host disease: un tessuto immunocompetente contenente linfociti T viene trapiantato in soggetto immuno-compromesso le cellule trapiantate attaccano quelle dell'ospite Inoltre i trapianti possono essere: - *[Trapianto unrelated]*: il donatore è un cadavere geneticamente diverso rispetto al ricevente - *[Trapianto living related]*: donatore e ricevente sono imparentati e il donatore è vivente. Tipico dei trapianti di rene e di midollo ANTIGENI MINORI DI ISTOCOMPATIBILITÀ - Se si trapianta da topo rosso a blu (geneticamente diversi), si ha rigetto in 8/10 gg per la risposta immune adattiva - Se il trapianto è tra due topi geneticamente identici NON c'è rigetto Se si trapianta da topo maschio rosso a femmina rossa c'è rigetto ma con una cinetica più lenta il contrario (da femmina a maschio rosso) NON ha rigetto. Questo succede perché il cromosoma Y codifica per gli *H-Y antigens*, che vengono rigettati dalla femmina. Poi si è scoperto che in questa categoria rientrano tutti quei polimorfismi che NON risiedono su geni HLA. Questi antigeni sono quindi stati chiamati **antigeni minori di istocompatibilità** (mH). CINETICA DEL RIGETTO - **[Rigetto iperacuto]**: minuti o ore Avviene nel momento in cui il sangue del ricevente inizia a perfondere l'organo trapiantato. È legato alla presenza di *anticorpi alloreattivi preesistenti* i pazienti sono sensibilizzati nei confronti delle molecole MHC dell'organo trapiantato. Quindi, poiché i vasi dell'organo trapiantato esprimono MHC, appena entrano in contatto con il sangue del ricevente sensibilizzato gli anticorpi anti-HLA si attivano e danno infiammazione. L'endotelio viene danneggiato, viene esposta la matrice sottoendoteliale e si attiva massivamente la cascata emocoagulativa. In questi casi si trovano infiltrati neutrofili, anticorpi depositati sui vasi e microtrombosi. Dopo pochi minuti o ore il trapianto è completamente ischemizzato. - **[Rigetto acuto]**: 8/10 gg Mediato da meccanismi cellulari che coinvolgono sia linfociti CD4 sia CD8 del ricevente. Si trova un infiltrato leucocitario= i linfociti infiltrano l'organo e lo danneggiano. In base al numero di differenze tra HLA del donatore e del ricevente varia la percentuale di sopravvivenza del trapianto. Quando riceviamo un trapianto non abbiamo già dei linfociti T pronti ad eliminarlo, ma il sistema immune deve sensibilizzarsi verso gli antigeni del trapianto, per questo richiede comunque qualche giorno. I *linfociti T alloreattivi naive* devono subire il processo di maturazione imparando a riconoscere, in presenza delle giuste molecole costimolatorie, gli antigeni derivati dal trapianto, e le proprie funzioni effettrici. Il riconoscimento avviene in due modalità: - **Modalità diretta**: un TCR deve riconoscere il complesso MHC+peptide ma anche tutte le molecole di costimolazione, quindi il riconoscimento deve avvenire su una cellule APC del donatore. Nell'organo trapiantato ci devono essere delle APC che poi raggiungono le stazioni linfatiche del ricevente. Con questo tipo di riconoscimento [vengono primed sia linfociti CD4 che CD8], perché le APC esprimono sia MHC I che MHC II. Le APC che mediano questo riconoscimento sono dette passenger leucocytes - **Modalità indiretta**: materiale derivato dal trapianto (detriti cellulari e cellule apoptotiche) viene fagocitato da APC del ricevente, poi viene presentato su molecole MHC II del ricevente. Questo avviene negli organi linfoidi secondari e *vengono primed solo i linfociti CD4* Meccanismo diretto e indiretto cooperano tra loro APC del donatore presenti nel trapianto e vario materiale originato dal trapianto raggiungono le stazioni linfatiche dove si ha il priming della risposta. Sono coinvolti linfociti CD8+ naive alloreattivi, che riconoscono in modo diretto gli alloantigeni. Queste cellule CD8+ ricevono help da cellule CD4+ alloreattive con varie specificità: vi sono sia CD4 alloreattive che riconoscono direttamente complessi MHC II del donatore, sia CD4 alloreattive che riconoscono mH sottoforma di peptidi presentati dalle APC del ricevente. Una volta differenziate, le CD8+ alloreattive citotossiche raggiungono il trapianto e mediano la citolisi diretta delle cellule del donatore. - **[Rigetto cronico]** Dopo mesi dal trapianto si ha perdita del 5-10%. Si tratta di una sorta di declino progressivo della funzione dell'organo. *Come fa il nostro organismo a riconoscere antigeni estranei presentati da molecole MHC diverse dalle nostre, come nel caso dell'organo trapiantato?* Questo avviene perché, nonostante le molecole MHC dell'organo trapiantato siano geneticamente diverse dalle nostre, queste sono strutturalmente molto simili quindi i TCR riescono a riconoscere comunque gli antigeni che presentano. Infatti i TCR sono estremamente **plastici** e riescono ad adattarsi anche a complessi MHC+peptide diversi. TRATTAMENTO FARMACOLOGICO Il giorno prima e i 4/5 giorni successivi al paziente vengono infusi *[anticorpi contro i linfociti T]*. Vengono anche somministrati **steroidi** e almeno un **farmaco immunosoppressivo** (ciclosporina A o FK506). In alcuni casi viene aggiunto anche un altro immunosoppressore, il mycofenolato. RISPOSTE ALLERGICHE Le reazioni allergiche si manifestano perché il paziente acquisisce una particolare iper-reattività immunologica a sostanze presenti nell'ambiente e spesso innocue= **allergeni**. Questi scatenano una [risposta infiammatoria] in pochi minuti che parte dalla regione corporea con la quale l'antigene entra in contatto (epitelio e mucose respiratorie, cute e congiuntive, mucosa intestinale). C'è una forte componente vascolare: - Aumento permeabilità vascolare extravasazione fluidi ed **edema** - Iperemia= aumento afflusso sangue - Contrazione della muscolatura liscia Successivamente compaiono anche infiltrati di cellule infiammatorie. Quando poi l'antigene penetra in circolo, la reazione può diventare sistemica= anafilassi/shock anafilattico. CONTRIBUTO GENETICO le malattie allergiche sono **malattie complesse multifattoriali** più presenti in paesi con condizioni socio-economiche avanzate I loci nei quali si trovano varianti associate alle malattie allergiche sono maggiormente espressi nel polmone e nelle cellule del sistema immunitario. I polimorfismi più frequentemente associati a malattie riguardano gli **eQTL**, che comportano *alterazioni nei livelli di espressione dei geni adiacenti*, soprattutto delle cellule linfoidi. I geni la cui espressione è correlata agli eQTL sono regolatori del differenziamento linfocitario, in particolare dei **linfociti T~H~2**. Tra i geni la cui espressione è più elevata nei linfociti dei pazienti allergici troviamo: - ***GATA3***: codifica per un master gene per l'acquisizione del fenotipo T~H~2 - ***STAT6***: codifica per un trasduttore del segnale che media gli effetti di citochine come IL-4 e IL-13 coinvolte nella produzione di IgE FATTORI AMBIENTALI Alcuni fattori ambientali favoriscono lo sviluppo di allergie: maggiore inquinamento atmosferico, condizioni igienico-sanitarie migliori, famiglie poco numerose, molto tempo trascorso al chiuso e vita sedentaria. Inoltre le malattie allergiche sono più frequenti. PATOGENESI DELLE MALATTIE ALLERGICHE FASE PRECOCE Tra i meccanismi attivatori ed effettori della risposta allergica immediata i protagonisti sono: - Mastociti (MC)= cellule infiammatorie residenti nei tessuti (derma e mucose di barriera) che derivano da precursori midollari - Basofili= precursori ematopoietici e funzioni sovrapponibili a quelle dei mastociti, normalmente sono il 1-5% dei leucociti circolanti ma nei pazienti allergici il numero aumenta - IgE *il paziente allergico presenta una concentrazione maggiore di IgE specifiche per un determinato allergene* I MC hanno la funzione di riconoscere e rispondere ad agenti che penetrano dall'ambiente esterno, per questo si trovano in tessuti periferici. Mentre i basofili riconoscono sostanze che penetrano nel torrente circolatorio. Entrambi utilizzano *[recettori di membrana]* per riconoscere i vari stimoli: - TLR - Recettori per alcuni fattori del complemento solo MC - **Recettori per anticorpi IgE**: - ***FcεRI***= espresso selettivamente da MC e basofili, riconosce ad alta affinità in rapporto 1:1 la regione costante delle catene pesanti delle IgE sono costantemente legati alle IgE presenti in circolo - ***CD23***= riconosce la regione costante delle IgE ma in un sito diverso da FcεRI, è espresso in forma trimerica sulla membrana, quindi lega 3 IgE contemporaneamente NON è espresso sui basofili e sulle MC, ma si trova su cellule epiteliali, linfociti B e cellule presentanti l'antigene Un MC esprime da 5x10^3^ a 5x10^5^ FcεRI sulla sua membrana e almeno lo 0.2% di questi deve essere già legato a IgE specifiche per un determinato antigene affinchè questo possa innescare il rilascio dei mediatori infiammatori. *l'attivazione dipende dall'aggregazione di **almeno 2 recettori** legati allo stesso IgE* Per questo l'allergene deve essere multivalente= deve esporre un certo numero di strutture antigeniche con identica specificità (epitopi) riconosciute da anticorpi. Tanto maggiore è la concentrazione di IgE specifiche per un determinato allergene, tanto maggiore sarà la probabilità che un numero crescente di FcεRI su MC sia "armato" di queste IgE sulla membrana plasmatica MC è attivabile dall'allergene. Il FcεRI è un complesso di molecole che fungono da trasduttori e adattatori che innescano 3 meccanismi principali: 1. Rilascio di mediatori preformati presenti nei granuli di secrezione 2. Sintesi di mediatori lipidici pro-infiammatori generati dall'attivazione della fosfolipasi A~2~ 3. Trascrizione ed espressione (più lento) di geni codi