KBI/TRA Tranzientní a stabilní transformace rostlin 2024/25 PDF

KBI/TRA Tranzientní a stabilní transformace rostlin 2024/25 Seminář vede: Mgr. Olga Šamajová, Dr. a Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D. Cvičící: Mgr. Olga Šamajová, Dr., Mgr. Maryna Tsinyk, Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D. a Mgr. Jiří Sojka, PhD. Obsah: 1. Stabiln...

KBI/TRA Tranzientní a stabilní transformace rostlin 2024/25 Seminář vede: Mgr. Olga Šamajová, Dr. a Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D. Cvičící: Mgr. Olga Šamajová, Dr., Mgr. Maryna Tsinyk, Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D. a Mgr. Jiří Sojka, PhD. Obsah: 1. Stabilní transformace Arabidopsis thaliana metodou "floral dip" 2. Selekce transformovaných semen Arabidopsis thaliana 3. Tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana metodou agroinfiltrace 4. Izolace a transformace protoplastů Arabidopsis thaliana pomocí PEG 5. Příklady na výpočet  1. Stabilní transformace Arabidopsis thaliana metodou „floral dip“ Teoretický úvod Transformace rostlin je genetická manipulace, při které dochází k vložení cizího genu do jádra rostlinné buňky. Gen je stabilně integrován do rostlinného genomu a transformované rostlinné buňky regenerují v transgenní rostliny. Transformace pomocí metody „floral dip“ využívá kmeny Agrobacterium tumefaciens k přenesení požadované DNA do genomu hostitelského organismu pomocí Ti-plasmidu. Jak vyplývá z názvu, tato metoda je založena na máčení květů rostlin A. thaliana v kultuře A. tumefaciens. Plasmid s požadovanou DNA vniká přes květ do vajíčka, následně je T-DNA vložena do chromozomu a po oplození vajíčka vzniká určitý počet transgenních semen, tzv. T1 generace. Metoda „floral dip“ je používána již po desetiletí a na rozdíl od tradičních transformačních technik má hned několik výhod. Jedná se o jednoduchou, časově a finančně nenáročnou metodu vyžadující jen několik speciálních reagencií. Úspěšnost transformace touto metodou nemusí být příliš vysoká, ale celkový hojný počet semen produkovaných rostlinou Arabidopsis zajistí dostatečný počet nezávislých transgenních linií rostlin. Materiál  glycerolové inokulum Agrobacterium tumefaciens, kmen GV 3101 (rezistence na rifampicin) nesoucí konstrukt pCSD1::CSD1:eGFP obsahující rezistenci na spectinomycin  rostliny Arabidopsis thaliana (1–2 měsíce staré, záleží na množství pupenů - ekotyp Columbia (Col-0). Média  LB médium tekuté: 25 g/l LB Broth, pH 7,2 (pomocí 3M KOH)  YEB médium tekuté: 16,3 g/l YEB, pH 7,2 (pomocí 3M KOH) Chemikálie  Antibiotika – rifampicin (RIF; 50 mg/ml), spektinomycin (SPE; 100 mg/ml),  Smáčedlo – Silwet STAR  70% ethanol Ostatní pomůcky a přístroje  pipety, sterilní špičky, sterilní Erlenmeyerovy baňky (250 ml), třepačka, spektrofotometr, kyvety, kádinky (100 ml), nůžky, černé igelitové sáčky, Falkonovy zkumavky (50 ml) Postup pro 2-denný protokol: 1. den První den si připravíme tzv. „startér“ kulturu. Po celou dobu pracujeme ve sterilním laminárním boxu (dále již flowboxu). Nedříve připravíme 10 ml tekutého LB médium do sterilní plastové tuby. Poté přidáme selekční antibiotika specifická pro daný konstrukt (výsledná koncentrace antibiotik): rifampicin 50 μg/ml l, spektinomycin 50 μg/ml. Odebereme 1 ml média s antibiotiky jako negativní kontrolu (kontaminace kultivace) a také jako referenční roztok (blank) pro měření optické hustoty buněk při 600 nm (OD600). Do připraveného kultivačního média pipetujeme 30 μl hluboce zmrazeného (-80 °C) glycerolového inokula A. tumefaciens, kmen GV 3101, které jsme si předtím vytáhli z mrazicího boxu (-80 °C) a nechali rozmrznout na ledu. Poté uzavřeme plastovou tubu, umístíme na třepačku a necháme kultivovat 24 hod při 28 °C, 180 RPM. Zásobní vzorek inokula zmrazíme v tekutém dusíku a uschováme v mrazicím boxu (-80 °C). Také je třeba připravit rostliny Arabidopsis thaliana, které budeme transformovat následující den. Rostliny si přeneseme z kultivační místnosti (dále již fytotronu) do laboratoře, aby se aklimatizovaly. Poté musíme ostříhat všechny již vytvořené šešule a opylené květy, což nám usnadní následnou selekci transformovaných semen. Pro transformaci jsou nejlepší ještě neotevřené květy. Po ostříhání šešulí budeme transformovat následující den, kdy by mělo dojít k zacelení ran tak, aby rostlina nebyla zbytečně vystavována stresu po vniknutí bakterií. 2. den Opět budeme celou dobu pracovat ve sterilním flowboxu. Připravíme si láhev se 100 ml sterilního YEB média, ze kterého si sterilně odpipetujeme 1 ml média, ten použijeme jako blank2 pro měření OD600. Poté do YEB média pipetujeme x ml „startér“ kultury, abychom naředili novou kulturu na OD600 = 0,15 (podle vzorce níže; např. „startér“ kultura má OD600 = 1,59 potom přidáme x = 9,43 ml „startér“ kultury do 90,57 ml YEB média). , = × = 9,43 ml , Do YEB media již nepřidáváme antibiotika, jelikož by byla toxická pro rostliny, které budeme transformovat. Rostliny transformujeme při požadované bakteriální OD600 = 0,8. Bakteriální kulturu necháme kultivovat na třepačce při 28 °C, 180 RPM až do naměření absorbance OD600 = 0,8 – 1 (nejlépe 0,8). Tato kultivace trvá přibližně 4 hodin. Rychlost růstu bakterií záleží od ředění startér kultury, vitality kultury – poměr živých a mrtvých bakterií v noční kultuře (viz obrázek níže – fáze růstu), také od druhu a kmene bakterií a dále také od samotného konstruktu a genu, který exprimuje. Pravidelně v 60 min intervalech měříme 0,5 ml kultury v kyvetách v spektrofotometru (používáme blank2 = YEB médium). Do protokolu přidáme růstovou křivku z naměřených dat podle vzoru (viz obrázek). Název a zdroj obrázku: Agrobacterium tumefaciens (LBA 4404) growth curves. In: Master Thesis 2003 (Agrobacterium-mediated transformation of oil palm suspension culture) - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: https://www.researchgate.net/figure/Agrobacterium-tumefaciens-LBA-4404-growth- curves_fig11_264417963 [accessed 28 Jan 2025]  Pokud dojde k přemnožení kultury, je možné ji naředit YEB médiem podle vzorce: např. OD600 = 1 = × − = , Pro samotnou transformaci do bakteriální kultury nesoucí požadovaný konstrukt přidáme smáčedlo Silwet STAR (100 μl/ 500 ml YEB média) a zamícháme. Stonky zbavené šešulí a květů rostliny namočíme do bakteriální kultury (v 50 ml Falkonových zkumavkách, nebo 100 ml kádinkách) a necháme ponořené maximálně 8 s, aby nedošlo k poškození rostliny. Poté pomocí ubrousku odstraníme z rostliny přebytečnou tekutinu, pomocí špejlí a provázku rostlinu svážeme a přikryjeme černým igelitovým sáčkem, aby nedošlo ke kontaminaci okolního prostředí. Nezapomeneme transformované rostliny řádně označit. Rostliny ponecháme přes noc ve tmě a na druhý den je přeneseme zpět do fytotronu.  2. Selekce transformovaných semen Arabidopsis thaliana Teoretický úvod Po úspěšném „floral dipu“ se na rostlinách A. thaliana vytvoří šešule plné semen T1, z nichž některé mohou být transformované a obsahovat tak požadovanou T-DNA s genem zájmu společně s genem selekčním. Selekční gen umožňuje transformované rostlině přežít, zatímco netransformovaná uhyne. Po dozrátí semen je nutné je sesbírat, sterilizovat a vyset na kultivační médium s obsahem selekční látky, nejčastěji antibiotika či herbicidu. Nejčastěji používané selekční geny jsou nptII pro neomycinfosfotransferasu, která fosforylací inaktivuje aminoglykosidická antibiotika, jako je kanamycin. Dalším je aphIV kódující hygromycinfosfotransferasu, která fosforylací inaktivuje antibiotikum hygromycin. Dosti využívaný je také gen bar pro fosfinotricinacetyltransferasu (PAT) inaktivuje fosfinotricin, který inhibuje enzym glutaminsyntetasu katalyzující převod glutamátu a NH3 na glutamin, což vede k toxické kumulaci amoniaku. Dalšími selekčními geny jsou IPT pro isopentenyltransferasu, zapojené do tvorby cytokininů nebo gen pro fosfomanosuisomerasu, která umožňuje využití manosy-6-fosfátu v glykolýze. Materiál  Rostliny Arabidopsis thaliana Col-0, semena T0 generace pocházející z květů transformovaných metodou „floral dip“ s Agrobacteriem tumefaciens nesoucím konstrukt pFSD1::FSD1:mRFP. Média  ½ MS médium tuhé: 2,15 g/l MS bez vitamínů, 1 g/l MES, 10 g/l sacharózy, 0,6% Gellan Gum pH 5,8 (pomocí KOH) Chemikálie  antibiotikum – tikarcilin (500 mg/ml),  herbicid – fosfinotricin (50 mg/ml)  70% ethanol, 96% ethanol, sterilní dd H2O Ostatní pomůcky a přístroje  pipety, sterilní špičky, kádinky, sterilní Petriho misky, sterilní filtrační papír, parafilm, chirurgická páska Postup Po dozrání semen tzv. T0 generace je nutné transformovaná semena selektovat od netransformovaných. Pro tuto selekci ku příkladu slouží gen rezistence na fosfinotricin (nebo hygromycin), který je součástí konstruktu vneseného do genomu rostliny. Proto transgenní semenáčky budou rezistentní k tomuto herbicidu nebo antibiotiku, a naopak semenáčky pocházející z netransformovaných semen zahynou. Připravíme si 250 ml rozpuštěného ½ MS média, do kterého přidáme fosfinotricin (40 µM) nebo hygromycin (15 µg/ml). Jelikož semena stále ještě obsahují určité množství kultury Agrobacterium, je nutné do média přidat také tikarcilin (1:5000), abychom předešli případným kontaminacím. Médium nesmí být příliš horké, aby nedošlo k degradaci antibiotik! Médium obsahující fosfinotricin/hygromycin a tikarcilin rozlijeme zhruba po 50 ml do čtvercových Petriho misek a necháme ztuhnout. Semena T0 generace vysterilizujeme podle následujícího postupu: 1. K semenům napipetujeme 1 ml 70% ethanolu. Poté protřepáváme 5 min. 2. Odpipetujeme ethanol. Napipetujeme 1 ml 96% ethanolu. Třepeme 1 min. 3. Odpipetujeme ethanol. 4. Semena třikrát promyjeme vodou: vždy napipetujeme 1 ml sterilní dd H2O, pak 5 min třepeme, načež celý postup opakujeme. Při třetím promytí vodu necháme v uzaviratelné plastové zkumavce (dále již eppendorfce). 5. Do víčka Petriho misky položíme sterilní filtrační papír. 6. 1 ml pipetou s odstřiženou špičkou nasajeme vysterilizovaná semena a napipetujeme je na filtrační papír. Petriho misku částečně přivřeme a počkáme na uschnutí filtračního papíru. Pokud máme připravená média a vysterilizovaná semena, můžeme semena T0 generace vyset na misky. Petriho misky zalepíme parafilmem a prodyšnou (chirurgickou) páskou a dáme na noc do lednice kvůli procesu stratifikace. Na druhý den umístíme misky se semeny do fytotronu. Zhruba po dvou týdnech bychom již měli rozeznat transgenní semenáčky, které přeneseme na ½ MS médium bez obsahu fosfinotricinu (neselekční médium), kde budou kultivovány 1-2 týdny. Po této době již můžeme transgenní rostliny přesadit do půdy a čekat na semena T1 generace.  3. Tranzientní transformace listů Nicotiana benthamiana metodou agroinfiltrace Teoretický úvod Bakterie rodu Agrobacterium tumefaciens jsou využívány nejen při stabilní, ale také při tranzientní transformaci rostlin. Tranzientní transformace zahrnuje infiltraci listů tabáku (Nicotiana benthamiana) suspenzí bakterií A. tumefaciens obsahující požadovaný konstrukt. Tato metoda transformace je využívána např. k určení subcelulární lokalizace určitého proteinu fúzovaného s GFP nebo k produkci velkého množství proteinu, aniž by musely být připraveny transgenní rostliny. T-DNA je přítomna v jádře, kde je přepisována, což vede k expresi daného transgenu v mezofylových buňkách tabáku. Materiál  glycerolové inokulum Agrobacterium tumefaciens, kmen GV 3101 nesoucí konstrukty: pFASTR-UBQ10::gANN1:gANN3:gANN4 pFASTR-UBQ10::gANN1:gANN3 pFASTR-UBQ10::gANN4 - všechny s rezistencí na rifampicin a spectinomycin a také konstrukt: p35S::eGFPs rezistencí na kanamycin  rostliny Nicotiana benthamiana s dobře vyvinutými listy (4-6 týdnu po vysetí semen). Média  LB médium tekuté: 25 g/l LB Broth, pH 7,2 (pomocí 3M KOH)  kokultivační médium (200 ml): 10 mM MES (pH 5,6), 150 μM acetosyringon, 10 mM MgCl2, sterilizovat přes filtr  ½ MS médium tekuté 2,15 g/l MS bez vitamínů, 10 g/l sacharózy, pH 5,8 (pomocí KOH) Chemikálie  antibiotika – rifampicin (50 mg/ml), kanamycin (50 mg/ml), spektinomycin (100 mg/ml)  100 mM MES (pH 5,6)  100 mM MgCl2  150 mM acetosyringon  70% ethanol Ostatní pomůcky a přístroje  pipety, sterilní špičky, sterilní zkumavky, třepačka, chlazená centrifuga, injekční stříkačky bez jehly, spektrofotometr, kyvety, černé igelitové sáčky, ochranné brýle  pro pozorování na mikroskopu: nůžky, podložní a krycí skla, kohoutkova voda nebo tekuté ½ MS pro dlouhodobé pozorování preparátu. Postup 1. den Pracujeme ve sterilním flowboxu. Do sterilních řádně označených 50 ml Falkonových zkumavek pipetujeme 10 ml LB média, do kterého přidáme selekční antibiotika specifická pro daný konstrukt (výsledná koncentrace antibiotik: rifampicin 100 μg/ml, kanamycin 25 μg/ml, spektinomycin 100 μg/ml). Nakonec přidáme 30 μl glycerového inokula A. tumefaciens s příslušnými konstrukty, které jsme předtím vytáhli z mrazáku na −80 °C a nechali rozmrznout na ledu. Zkumavky s LB mediem a bakteriemi umístíme do stojánku na třepačku a kultivujeme přes noc při 28 °C, 180 RPM. Zásobní vzorek inokula nejdříve krátce vortexujeme a následně opět zmrazíme v tekutém dusíku a uschováme v mrazicím boxu na −80 °C. Část média (2 ml) kultivujeme bez bakterií jak negativní kontrolu kontaminace a použijeme ho jako blank následující den. 2. den Rostliny tabáku přeneseme z fytotronu do laboratoře a dostatečně je zalijeme vodou (minimálně 2 hodiny před transformací), aby došlo k otevření průduchů na spodní straně listů. Následně namnožené bakteriální kultury centrifugujeme při 2000 x g, 10 min, 4 °C. Supernatant odlijeme a pelet resuspendujeme 2 ml čistého kokultivačního média a kulturu opět stočíme při stejných podmínkách. Tento krok je stěžejní pro odstranění zbytků LB média s antibiotiky. Pelet opět resuspendujeme 2 ml čistého kokultivačního média. Změříme optickou hustotu při vlnové délce 600 nm (OD600), jako blank použijeme 0,5 ml čistého kokultivačního média. Pro měření OD600 bakteriální kultury odebereme 50 μl z resuspendované bakteriální kultury a přeneseme do kyvety se 450 μl čistého kokultivačního média. Po naměření absorbance je důležité naředit bakteriální kulturu na OD600 = 0,7. Vypočet dle: naměřené OD600 * 10 * objem resuspendované kultury. Například: celkové OD600 v 5 ml = 3,5 (0,7 * 5)/ vypočtená hodnota * objem resuspendované kultury. Výsledkem je, že se přidá 1,4 ml bakteriální kultury do 3,6 ml čistého kokultivačního média pro přípravu 5 ml kultury s OD600 = 0,7. Bakteriální suspenzi inkubujeme 2 hod ve tmě, při pokojové teplotě (RT). Po inkubaci můžeme infiltrovat bakteriální suspenzi do tabákových listů. Suspenzi nasajeme do injekční stříkačky, přiložíme ke spodní straně listu a pomalu vtlačujeme suspenzi do listu. Jako negativní kontrolu použijeme čisté infiltrační médium. Poté si pomocí fixu na listu vyznačíme celou plochu, která byla infiltrována. Nakonec rostlinu řádně označíme podle toho, jakým konstruktem byla transformována, přikryjeme ji černým igelitovým sáčkem a ukryjeme na temné místo v laboratoři. Na druhý den můžeme rostliny přemístit do fytotronu. Mikroskopické pozorování provedeme 2. nebo 3. den po transformaci. 4. nebo 5. den Infiltrované plochy vystřihneme z listu a připravíme preparát pro pozorování epifluorescenčním mikroskopem. Poznámka: V místě poranění listu injekční stříkačkou dochází k aktivaci oxidačně-polymeračních procesů v buněčné stěně, což se projevuje zvýšením autofluorescence, která může být zaměněna za fluorescenci GFP, proto je důležitá negativní kontrola.  4. Izolace a transformace protoplastů Arabidopsis thaliana pomocí PEG Teoretický úvod Protoplasty jsou rostlinné buňky zbavené buněčné stěny. Díky tomu, že jsou u těchto buněk zachovány veškeré vnitrobuněčné složky spolu s plasmatickou membránou, a zároveň že postrádají bariéru v podobě buněčné stěny, mají protoplasty velký aplikační potenciál. Příklady využití protoplastů jsou: 1. Fúze protoplastů pocházejících z různých druhů v procesu zvaném somatická hybridizace. Dalšími typy fúze jsou: a. fúze normálního protoplastu s enukleovaným protoplastem (protoplast zbavený buněčného jádra), kdy vzniká cytoplazmatický hybrid (též cybrid). b. fúze dvou protoplastů, která není následována splynutím jader; v takovém případě vzniká heterokaryon. Naopak pokud po fúzi protoplastů dochází ke splynutí jader, vznikají pravé hybridní buňky. 2. Klonování jediné buňky. 3. Genetická transformace. 4. Izolace mutantů. 5. Izolace buněčných organel a chromozomů. 6. Studium membránových procesů (membránový transport, příjem látek). 7. Studium syntézy buněčné stěny a její úlohy při buněčném dělení. 8. Studium receptorových a informačních funkcí plasmatické membrány při přenosu signálů. Díky totipotenci rostlinných buněk je možné z jediného protoplastu, případně buňky vzniklé výše uvedenými metodami, regenerovat celou rostlinu. Protoplasty lze izolovat pomocí mechanické nebo enzymatické metody. Při mechanické metodě je kus epidermis uveden do hypertonického prostředí, ve kterém dojde k plazmolýze, tedy k odchlípení cytoplazmatické membrány od buněčné stěny. Následně jsou protoplasty manuálně vypreparovány. Mechanická izolace protoplastů je velmi náročná, přičemž výsledkem je izolace pouze malého počtu protoplastů s nízkou životaschopností. Proto se častěji využívá enzymatická metoda, která umožňuje získat velké množství nepoškozených protoplastů.  Při enzymatické metodě izolace protoplastů lze použít řadu různých tkání, nejčastěji se ovšem využívá listový mesofyl, kalus, či suspenzní kultury. Pro rozbití buněčné stěny se používají enzymy degradující složky buněčné stěny (tedy celulózu, hemicelulózu a pektiny). Řada celuláz, hemiceluláz a pektináz je komerčně dostupná. Enzymatické štěpení se provádí buď sekvenčně: nejprve je pektinázou (macerozymem) rozštěpena střední lamela, následně je buněčná stěna volných buněk štěpena celulázou; nebo simultánně: macerozym a celuláza jsou aplikovány současně. Po enzymatickém štěpení je vhodné vzorek přečistit filtrací. Na transformaci protoplastů se používá přímý přenos DNA umožňující rychlou analýzu tranzientní genové exprese, stejně jako generování stabilně transformovaných transgenních rostlin. Nejpoužívanější technikou přímého přenosu DNA je polyetylén glykolem zprostředkovaný příjem DNA. PEG v přítomností bivalentních ionů vápníku navodí destabilizaci plasmatické membrány protoplastů co následně umožní příjem DNA. Materiál  Rostliny Arabidopsis thaliana rostoucí na ½ MS mediu - Konstrukt p35S:eGFP (obsahující kanamycinovou rezistenci) Chemikálie  1 M mannitol (zásobní koncentrace)  1 M CaCl2 (zásobní koncentrace)  100 mM MES s pH 5,6 (upraveno KOH)  ddH2O  Enzymatický roztok: o 400 mM mannitol o 5 mM MES s pH 5,6 (upraveno KOH) o 8 mM CaCl2.2H2O2 o 1 % celuláza (Onozuka R-10) o 0,25 % macerozym (R10) Poznámka: enzymatický roztok je nutné připravit čerstvý a sterilizovat jej filtrací   Roztok W5: o 154 mM NaCl o 125 mM Ca(NO3)2 o 5 mM KCl o 5 mM glukóza o 2 mM MES o pH 5,6 (upraveno KOH)  MaMg roztok: o 400 mM mannitolu o 15 mM MgCl2 o 5 mM MES o pH 5.6 s KOH Ostatní pomůcky a přístroje  Žiletky, nůžky, pinzety, sterilní Petriho misky, sterilní zkumavky (50 ml), kádinky, Pasteurovy pipety, parafilm, alobal, třepačka, gáza  pro pozorování na mikroskopu: podložní a krycí skla, destilovaná voda Postup 1. den Listové růžice rozstříháme na jednotlivé listy v 500 mM mannitolu ve sterilní Petriho misce. Pomocí žiletky materiál nakrájíme na malé čtverečky (1-2 mm), přikryjeme misku vrškem a necháme plazmolyzovat 1 h při laboratorní teplotě. Mannitol opatrně odpipetujeme Pasteurovou pipetou, nesmíme však odpipetovat vše! Ke vzorkům přilijeme 10 ml enzymatického roztoku a aplikujeme vakuum pomocí vakuové pumpy a exikátoru po dobu 2 min. Poté misku přikryjeme víčkem, uzavřeme parafilmem a zabalíme do alobalu. Následně kultivujeme při 4 oC přes noc. 2. den Obsah misky přefiltrujeme přes gázu namočenou v 0,5 M mannitolu do 50 ml zkumavky, zaznamenáme objem prefiltrovaného roztoku a přidáme 200 mM CaCl2 v polovičním objemu. Centrifugujeme 5 min při 60 g. Pelet resuspendujeme v roztoku 500 mM mannitolu a 200 mM CaCl2 v poměru 1:2 a centrifugujeme opět 5 min při 40 g. Nakonec se pelet resuspendoval v 5 ml W5 media a uložil se na led na maximálně 30 min před transfekci. Poté protoplasty centrifugujeme 5 min při 40 g a resuspendujeme v 0,5 ml MaMg roztoku. Následně odpipetujeme 300 µl suspenze do středu Petriho misky a přidáme 25-35 µg plasmidové DNA (2mg.ml-1) a jemně promícháme. Po 5 min přidáme 300 µl roztoku PEG po obvodu kapky protoplastové suspenze a opatrně promícháme pomocí sterilní mikropipetové špičky. Po 10 min přidáme opatrně ke kapce protoplastové suspenze z boku 1 ml 400 mM mannitolu a pak v 2 min intervalech přidáváme po 2 ml za opatrného míchání tak, aby výsledný objem protoplastové suspenze byl přibližně 12 ml. Petriho misku uzavřeme parafilmem, zabalíme do alobalu a inkubujeme. Následně inkubujeme 24- 48 h při 22 oC. 3. den Na podložné sklíčko napipetujeme 50µl protoplastové suspenze, překryjeme krycím sklíčkem. Pozorováním v epifluorescenčním mikroskopu hledáme transformované protoplasty (protoplasty s fluorescenčním signálem). V případě vysoké úspěšnosti transformace protoplastů můžeme určit úspěšnost izolace a transformace protoplastů pomocí následujícího postupu: 1. Na podložní sklo pipetujeme 10 µl neředěného, případně ředěného vzorku. 2. Spočítáme počet protoplastů a počet protoplastů s fluorescenčním signálem. Poznamenáme si zředění vzorku i spočítané hodnoty. 3. Účinnost izolace protoplastů vyjádříme jako počet protoplastů/ml. Dále určíme úspěšnost transformace jako poměr transformovaných protoplastů ku všem pozorovaným protoplastům.  7. Příklady 1. Složení tuhého ½ MS média je: 2,15 g/l MS bez vitamínů, 10 g/l sacharózy, 1% phytoagar. Kolik gramů fytoagaru se použije při přípravě 1 l média? (viz protokol 2) 2. Složení kokultivačního média je: 10 mM MES, 150 μM acetosyringon, 10 mM MgCl2. Zásobní koncentrace roztoků: 100 mM MES, 100 mM MgCl2, 150 mM acetosyringon. Jaký objem MES, MgCl2 a acetosyringonu se použije na přípravu 200 ml kokultivačního média? (viz protokol 3) 3. Složení enzymatického roztoku je: 400 mM mannitol, 5 mM MES, 8 mM CaCl2, 1% celuláza, 0,25 % macerozym. Zásobní koncentrace roztoků: 1 M mannitol, 1 M CaCl2, 100 mM MES. Jaký objem mannitolu, MES a CaCl2 a jaké množství celulázy a macerozymu se použije na přípravu 100 ml enzymatického roztoku? (viz protokol 4) 4. Do 10 ml média máte přidat rifampicin a spectinomycin tak, aby výsledná koncentrace každého byla 50 μg/ml. Zásobní koncentrace rifampicinu je 50 mg/ml a spectinomycinu 100 mg/ml. Kolik rifampicinu a spectinomycinu přidáte do média? (viz protokol 1) 5. Mějme 100 ml bakteriální kultury v YEB médiu, u které změříme OD600 = 0,922. Kolik sterilního média musíme přidat, pokud chceme bakteriální kulturu zředit tak, aby OD600 = 0,8? (viz protokol 1) 6. Mějme 10 ml bakteriální kultury, u které změříme OD600 = 2,06. Chceme-li připravit 2 ml bakteriální kultury o OD600 = 0,5, kolik bakteriální kultury odpipetujeme do sterilní mikrozkumavky? (viz protokol 3) 7. Kolik µl fosfinotricinu (zásobní koncentrací 50 mg/ml) a ticarcillinu (zásobní koncentrace 500 mg/ml) přidáme do 250 ml média, abychom dosáhli finální koncentrace 10 µg/ml fosfinotricinu a 100 µg/ml ticarcillinu? (viz protokol 2) 8. Do 500 ml bakteriální kultury s YEB médiem přidáváme dle protokolu 100 ul smáčedla Silwet STAR. Kolik ul smáčedla přidáme do 125 ml kultury? (viz protokol 1) 9. V 10 ml „startér“ kultury bylo naměřeno OD600 = 1,88. Kolik ml téhle kultury je potřeba přidat do kolik ml YEB média abychom bakterie naředili na OD600 = 0,15 v 100 ml celkového objemu? (viz protokol 1)