Cinétique de la catalyse enzymatique PDF 2022-2023

Ecole Nationale Supérieure de Biotechnologie - Taoufik Khaznadar, Constantine 3ème Année du cycle Ingénieur [Cours UE-SF 2 : Enzymologie (Module IV); La cinétique de la catalyse enzymatique. Chargés d’en...

Ecole Nationale Supérieure de Biotechnologie - Taoufik Khaznadar, Constantine 3ème Année du cycle Ingénieur [Cours UE-SF 2 : Enzymologie (Module IV); La cinétique de la catalyse enzymatique. Chargés d’enseignement: Enseignant responsable : Dr. MAROUF A., Mohamed Chargée de TD : Dr. MAKHLOUF Chargée de TP : Dr. GASMI Année universitaire 2022-2023 CONTENTS 01 Partie introductive 02 Cinétique Michaelienne à un substrat et à un produit 03 Cinétique Michaelienne à deux substrats 04 Facteurs physicochimiques influençant la réaction enzymatique 05 Mécanismes de régulation de l’activité enzymatique 01 Partie introductive  Partie introductive La cinétique enzymatique, c’est l’étude des variations des vitesses de la réaction en fonction de la concentration du substrat. A quoi ça sert ? Elle permet de déterminer : - Modélisation de l’activité enzymatique; - Équation de la vitesse; - Paramètres cinétiques et leurs significations; - Etudes en présence d’inhibiteurs, conditions optimales... Partie introductive Ordre des réactions enzymatiques Partie introductive Cinétique d'une enzyme au cours du temps Apparition du produit au cours du temps La vitesse peut être mesurée avec l'apparition du produit: v=dP/dt En enzymologie classique, on s'intéresse à la phase stationnaire (linéaire) en mesurant la vitesse initiale.  Partie introductive Mesure des constantes cinétiques Cinétique (phase stationnaire) en fonction de la concentration du substrat [P] = f (t) - Au début: réaction d'ordre 1 (dP/dt = cste) - Puis dP/dt diminue devient nul - Arrêt de la réaction (dP/dt = 0) dû à :  Epuisement de S  Réversibilité de la réaction  Inhibition par P … La V de la réaction enzymatique est influencée par: [S], [E], température, pH, effecteurs.  Partie introductive Cinétique en fonction de la concentration du substrat Aux faibles [S], la vitesse de la réaction est proportionnelle à celle du substrat (réaction d’ordre 1). Lorsque [S] augmente, la vitesse ne s’accroît plus dans les mêmes proportions (réaction d’ordre mixte). Aux fortes [S], la vitesse devient constante, indépendante de cette concentration (réaction d’ordre 0): l’enzyme est saturée par son substrat.  Partie introductive Traitement mathématique des cinétiques K1 K2 K3 E+S ES EP E+P K-1 K-2 K-3 Conditions: 1- On travaille à de très faible concentration de substrat [S]>>[P]. 2- Il y a beaucoup plus de substrat que d'enzyme que [S]>>[E]. 3- Les formes libres de l'enzyme et de l'enzyme liée au substrat sont en équilibre (rapide). Avec ces conditions, on peut simplifier la réaction K1 K2 E+S ES E+P Comme, il y a peu de produit le retour K-2 K-1 est négligeable, K2 =k cat est la constante catalytique  Augmentation de la concentration Produit Partie introductive ↓ P S + E (dans une période de temps déterminée)  Partie introductive  Le modèle de réaction s’écrit de la manière suivante : Partie introductive Différentes phases de la réaction enzymatique ES se forme vite et est détruit lentement V est nulle (V=0) V Constante Vitesse diminue progressivement T₃ Temps de réaction  Partie introductive Entre T1 et T2 Entre T0 et T1 - Correspond à une partie linéaire et constante, la quantité du produit formé est - Combinaison ES très rapide. proportionnelle au temps. - Imperceptible en réalité. - Toutes les molécules de l’enzyme sont occupées par les molécules du substrat, la [ES] est maximale et constante. > De T3 Entre T2 et T3 - La courbe devient parallèle à l’axe des - L a disponibilité du substrat baisse pour abscisses. l’enzyme. - Il n y a plus de transformation de S en P ; - La réaction inverse/retour commence à - Un équilibre s’instaure entre la formation concurrencer celle qu’on mesurait. de produit (ES E+P) et sa destruction (E+P ES).  Partie introductive Unité de l'activité enzymatique S → P mmole A.S: Rapporte le nombre d’unité s enzymatiques au poids (mg) de protéine purifiée. vo = [P] / min A.M: Est le nombre de moles de substrat transformé (ou de produit formé) par moles d’enzyme par mn. L'unité internationale (U.I) C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mmole de substrat par minute. K cat (K2) Constante catalytique qui représente le nombre de moles de P formé par seconde et par mole d’enzyme. Si l’enzyme possède plusieurs sites catalytiques, l’unité change et s’exprime par mole de sites. Kcat = Vmax / mole. 02 Cinétique michaelienne à un substrat et à un produit I. Cinétique michaelienne à un substrat 1. Modèle de base et équation de Henri  Etude de la cinétique enzymatique a commencé en 1902 avec les travaux de Adrian Brown et Victor Henri, qui pour interpréter la forme hyperbolique des courbes vitesse initiale de la réaction en fonction de la concentration initiale, suggérèrent l'hypothèse de la formation d'un Victor Henri (1872 – 1940) complexe enzyme-substrat en équilibre avec le substrat était nécessaire.  Le modèle de base de la cinétique enzymatique s'écrit ainsi :  E  l’enzyme  S le substrat P  le produit de réaction  ki  sont les constantes de vitesse des réactions élémentaires  Ce mécanisme implique :  une 1ère étape de fixation du substrat sur l’enzyme  Une seconde étape de conversion du substrat en produit, qui se déroule au sein du complexe enzyme-substrat  La seconde étape se termine par la libération du produit  Equilibre rapide s’établissant entre l’enzyme et le substrat et l’enzyme et le produit  Concentration du substrat est très supérieure à celle de l’enzyme Henri, à partir de ces considérations, il dérive une équation de vitesse :  S 0  k 2 E 0   d  p  Kd  v0   dt 1   S 0    K d 2. Equation de Michaelis-Menten En 1913, suite aux travaux de Victor Henri, Maud Menten et Leonor Michaëlis résolvèrent le système réactionnel en posant les hypothèses simplificatrices suivantes, suggérées par les études expérimentales : Maud Menten (1879 - 1960) Leonor Michaelis (1875 1949)  Réalisation des mesures dans des conditions de vitesse initiale « vi »  les mesures de cinétique seront toujours faites pour des concentrations de produit très faible  [P]≅ 0 et [S0]≅ [S0] où [S0] est la concentration du substrat à l'instant initial  Cette hypothèse permet de négliger la réaction inverse   « vi » : vitesse initiale  c'est-à-dire en absence de produit  vitesse mesurée avant que 10% de substrat n’ait été transformé en produit  pas d’inhibition de l’enzyme par le produit de la réaction ou dénaturation progressive de l’enzyme.  la concentration totale du substrat [S]0 est grande (>>) devant celle de l'enzyme [E]0.  Le schéma réactionnel s'écrit ainsi: ES  complexes de Michaelis-Menten k1 constante de formation du complexe ES  s’exprimant en mol-1.l.s-1 (réaction de second ordre) k-1  constante de vitesse de dissociation du complexe ES (s’exprime en sec-1) k2  dite également constante catalytique ou « Kcat » constante de vitesse de formation du produit «P»  elle s’exprime en sec-1  réaction du premier ordre par rapport à la concentration de ES. Méthode de détermination de la constante de Michaelis  vi = vmax [S]/ Km+[S] Equation de Michaelis-Menten Vmax Vitesse de réaction à saturation de l'enzyme. Km est une constante fondamentale pour les enzymes (constante de dissociation ES exprimée en moles/L) , est un index de l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Plus Km est petit, plus l’affinité est grande et inversement. Si Km faible, cela signifie que l'enzyme est étroitement associée au S car atteint Vmax rapidement. C'est une constante opérationnelle qui représente [S] lorsque vo = vmax/2 2.1. Calcul de la vitesse initiale « vi » ou « v0 »  La vitesse initiale de la réaction peut s’écrire  d  p v0   k2 ES ...1 dt  La vitesse globale de formation du complexe « ES » est égale à la différence entre les vitesse qui conduisent à sa formation et à sa disparition: d ES   k1 E S   k 1 ES   k 2 ES ...2 dt  L’équation (2) ne peut être explicitement intégrée sans faire au préalable quelques hypothèses simplificatrices:  Hypothèse du quasi-équilibre ou pré-équilibre  Hypothèse de l’état stationnaire (ou quasi-stationnaire) Ces deux hypothèses permettent d’obtenir la même équation de la vitesse initiale. a) Hypothèse de « l’état de l’équilibre » ou « Steasy state » (Michaelis et Menten, 1913) Dès l'addition de l'enzyme dans la solution de substrat  il s'établit un équilibre rapide entre les formes libres de l'enzyme, du substrat et du complexe  k-1>>> k2  Equation (2) peut ainsi être intégrée.  La vitesse de formation de « ES »  vF  k1E S   La vitesse de disparition de « ES »  vD  (k1  k2 )ES   [ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"): v f  vD  (k1  k2 )ES   k1E S ...3 b) Hypothèse de « l’état quasi-stationnaire » (Briggs et Haldane ,1925) Briggs et Haldane en 1925 postulèrent que la concentration du complexe « ES » reste pratiquement constante durant la plus grande partie de déroulement de la réaction : d ES   0 ( A.E.Q.S )  k1 E S   (k 1 ES   k 2 [ ES ])  0 dt  k1 E S   (k 1  k 2 )[ ES ])...3  Bien que [ES] soit constante  les quantités [ES] et de l’enzyme libre [E] ne sont pas pratiquement mesurables.  La Concentration de l’enzyme totale « [ET] » se détermine facilement: [ ET ]  ES   [ E ]...4 Equation de conservation  En combinant l’équation (2) avec l’équation (3) et (4), on obtient: k1 ET   ES S   (k1  k2 )ES   Après réarrangement: ES k1  k2  k1S   k1ET S   En divisant de part et d’autre par k1, on obtient la valeur de [ES]: ES   ET S  Km  k 1  k 2 K m  S  « Km »  constante de Michaelis k1  La vitesse initiale de la réaction d’après l’équation (1) peut être exprimée en fonction des quantités mesurables [ET] et [S]: d  p k2 ET S  v0   k2 ES   v0 ...5 dt K m  S   La vitesse maximum d’une réaction « Vmax » est obtenue pour de fortes concentrations en substrat  lorsque l’enzyme est saturée  quand elle se trouve entièrement sous la forme « ES » vmax  k2 ET ...6  En combinant l’équation (5) et (6), on obtient: Vmax S  v0  K m  S  Cette expression est l’équation de Michaelis-Menten  équation de base de la cinétique enzymatique. Elle décrit une hyperbole équilatère.  Récapitulation Il est possible de distinguer 3 étapes dans toute réaction enzymatique:  Etat pré-stationnaire  Etat stationnaire  Etat post stationnaire  Etat pré-stationnaire  ne dure que quelques millisecondes après l’addition du substrat à l’enzyme Enzyme mise en présence d’excès de substrat: Combinaison ES très rapide  Etat stationnaire  Enzyme saturée par le substrat  Combinaison ES est à concentration maximale Constante  Vitesse de la réaction est constante: Vitesse initiale (Reste constante tant que le substrat est à concentration saturante de l’enzyme)  Etat post stationnaire  la concentration de [ES] diminue ainsi que la vitesse de la réaction  2.2. Signification de Vmax , kcat , Km a) Vmax  Représente la vitesse initiale de la réaction lorsque toutes les molécules d’enzymes sont sous la forme ES  taux de catalyse maximal  Vitesse limite et non maximale  Elle est proportionnelle à la concentration de l’enzyme  intérêt en biologie clinique b) Kcat ou k2  Est appelée « Turn over» ou « vitesse absolue » ou « activité moléculaire » ou « activité catalytique ».  Elle représente le nombre de molécule de substrat transformé par une seule molécule d’enzyme et par unité de temps  nombre de cycles que l’enzyme réalise par unité de temps Vmax kcat  Elle se calcule pour une préparation d’enzyme homogène. ET   Kcat  s’exprime en « Temps -1 »  constante de vitesse du premier ordre.  1  la durée d'un cycle catalytique lorsque l'enzyme est saturé en substrat. k cat c) Km  Km  représente la concentration de substrat nécessaire pour saturer la moitié des sites de liaisons.  Km  c’est la concentration de S pour laquelle la vitesse initiale est égale à la moitié de la K m  S0   vi  vitesse maximale  Vmax 2  La valeur de « Km » est indépendante de la concentration et de l’enzyme et du substrat  1 « Km» est une constante caractéristique pour chaque enzyme.  affinité Km  Affinité de l’enzyme pour son substrat se définit comme étant l’inverse de « Km »  Dans la relation de Briggs-Haldane  la constante de Michaëlis est égale à : k 1  k 2 Km  k1 k 1  Dans la relation de Michaels-Menten  k2