Μηχανισμοί ανασυνδυασμών 2024 PDF

Mηχανισμοί ομόλογου γενετικού ανασυνδυασμού Κ. Μ. Παππά ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Βασικές έννοιες Οι ανασυνδυασμοί κατά τον επιχιασμό συμβαίνουν σε περιοχές ομολογίας μεταξύ των χρωμοσωμάτων και προϋποθέτουν σπάσιμο και επανένωση μορίων...

Mηχανισμοί ομόλογου γενετικού ανασυνδυασμού Κ. Μ. Παππά ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Βασικές έννοιες Οι ανασυνδυασμοί κατά τον επιχιασμό συμβαίνουν σε περιοχές ομολογίας μεταξύ των χρωμοσωμάτων και προϋποθέτουν σπάσιμο και επανένωση μορίων DNA. Άτυπα αποτελέσματα της ανάλυσης τετράδων στους ασκομύκητες και το φαινόμενο της γονιδιακής μετατροπής οδήγησαν στην ανάπτυξη μοριακών μοντέλων που εξηγούν τον τρόπο που γίνονται οι ανασυνδυασμοί κατά τον επιχιασμό. Τα μοντέλα αυτά, όπως το μοντέλο Holliday, περιλαμβάνουν κοινά στοιχεία: (α) την εισαγωγή εγκοπών στις αλυσίδες των συμβαλλόμενων DNAs, (β) την τοπική δημιουργία ετεροδίκλωνων (ή ετερόδιπλων) DNAs και τη διακλάδωση των συμβαλλόμενων μορίων, (γ) τη μετανάστευση της διακλάδωσης και την τοπική επέκταση της ετεροδίκλωνης κατάστασης, και (δ) την τελική λύση της ενδιάμεσης δομής με εισαγωγή νέων εγκοπών στις αλυσίδες του DNA. Ανάλογα με τα σημεία αυτών των εγκοπών δημιουργούνται εναλλακτικά προϊόντα ανασυνδυασμού. Τα ισχύοντα μοντέλα εξηγούν τα αποτελέσματα διάσχισης συνδεδεμένων γονιδίων σε διασταυρώσεις διαφορετικών οργανισμών. Αρκετά από τα ένζυμα που συμμετέχουν στον ομόλογο ανασυνδυασμό έχουν χαρακτηριστεί, στα βακτήρια κυρίως. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Η συμπληρωματικότητα των βάσεων είναι αυτή που εξασφαλίζει την ακρίβεια του αποτελέσματος ενός ανασυνδυασμού. Ανασυνδυασμός μπορεί να γίνει ανάμεσα σε οποιαδήποτε δύο βάσεις μιας αλληλουχίας, εντός και εκτός γονιδίων (βλ. πειράματα Benzer). Τα φαινοτυπικά αποτελέσματα του ανασυνδυασμού προκύπτουν όταν ανασυνδυάζονται ετερόζυγες, για συγκεκριμένες γενετικές θέσεις, μη αδελφές χρωματίδες κατά τη μίτωση ή μείωση (: μιτωτικοί ή μειωτικοί επιχιασμοί). Αυτό δεν σημαίνει ότι δεν μπορούν να ανασυνδυαστούν και οι αδελφές χρωματίδες, χωρίς όμως εμφανείς συνέπειες στον φαινότυπο. Yπάρχουν και μη ομόλογοι ανασυνδυασμοί – πχ κατόπιν δίκλωνων σπασιμάτων, ανασυνδυασμοί ειδικής θέσης ή αυτοί που προκαλούνται από μεταθετά στοιχεία. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Όρος: Ανασυνδυασμός - Recombination γενικευμένη χρήση: ανασυνδυασμός γονιδίων στους απογόνους πχ μειωτικός ανασυνδυασμός: διαδικασία κατά τη μείωση που δημιουργεί απλοειδείς γαμέτες των οποίων οι γονότυποι διαφέρουν από αυτούς των γονεϊκών, όπως διαφαίνεται σε περίπτωση ετεροζυγωτίας. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Ανασυνδυασμός - Recombination Μειωτικός Μειωτικός ανασυνδυασμός κατά ανασυνδυασμός μετά τον ανεξάρτητο από επιχιασμό διαχωρισμό ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Ανασυνδυασμός και Σύνδεση (Linkage): συχνότητες ανασυνδυασμού…. Πρώτη καταγεγραμμένη παρατήρηση διασταύρωσης διυβριδισμού με ετερόζυγους γονείς που αποκλίνει από το μεντελιανό πρότυπο. + Edith Saunders! ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Ανασυνδυασμός και Σύνδεση (Linkage): συχνότητες ανασυνδυασμού…. ? Εισάγετε τα δεδομένα της διασταύρωσης σε τετράγωνο Punnett για να ελέγξετε πώς διαμορφώθηκαν οι φαινοτυπικές αναλογίες της F2. Χαρτογραφείστε τα P/p και L /l βάσει των δεδομένων, για ομόπλευρη (cis) διάταξη των επικρατών PL. Φαινοτυπικές αναλογίες της F2 αν τα επικρατή P και L δεν είχαν ομόπλευρη (cis) διάταξη στους γονείς της πατρικής γενιάς, αλλά είχαν ετερόπλευρη (trans); (αντί για ‘coupling’, κατά τον τότε όρο, ‘repulsive’) ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Πειράματα Thomas Hunt Morgan και Alfred Sturtevant: Xρήση ομόζυγων υπολειπόμενων αρσενικών στις διασταυρώσεις (tester): ελέγχουν τους ανασυνδυασμούς ή τα ασύνδετα γονίδια στο θηλυκό Παρατήρηση συχνοτήτων ανασυνδυασμού ανάμεσα σε γενετικές θέσεις που έχουν προβλέψιμο και επαναλήψιμο χαρακτήρα (..αν αντιστραφεί η διασταύρωση ή η cis/trans διάταξη γονιδίων, αν ελεγχθούν οι συχνότητες τρίτης, τέταρτης θέσης σε σχέση με τις προηγούμενες...) Εισαγωγή της έννοιας της σύνδεσης των γενετικών θέσεων σε ‘χάρτη’ που φαίνεται να έχει γραμμική φύση και τελικά σε ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ φυσική οντότητα ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ - ικρίωμα (: το χρωμόσωμα) Δημιουργία χαρτών στη δροσόφιλα  T. H. Morgan: Nobel 1933 για τη διαλεύκανση του ρόλου των χρωμοσωμάτων στην κληρονομικότητα ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Ανασυνδυασμός και Σύνδεση (Linkage): συχνότητες ανασυνδυασμού…. ? Ποια είναι η χαρτογραφική απόσταση των θέσεων purple (pr) και vestigial (vg) βάσει των δεδομένων Morgan και πώς συγκρίνεται αυτό με τον χάρτη άνω (βλ. και επόμενη διαφ., χρωμόσωμα ΙΙ); Πού έγκειται η διαφορά; ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Σύνδεση και Χαρτογράφηση (Mapping) ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Πρώτες παρατηρήσεις στο καλαμπόκι (Creighton και McClintock, 1931) Διασταύρωση καλαμποκιού που φέρει μετατόπιση τμήματος του χρ. 8 στο χρ. 9 και εμφανή διαμόρφωση (κόμβο) στην άκρη του 9 (κυτταρογενετικοί δείκτες) και ετεροζυγωτία στις γενετικές θέσεις C (color, c: colorless) και Wx (starchy, wx: waxy). με στέλεχος cc. Wxwx (ή cc. wxwx - επόμενη διαφ.): Οι κυτταρογενετικοί δείκτες μεταφέρονται μαζί με τα παρακείμενα αλληλόμορφα στους ανασυνδυασμένους απογόνους. : φυσική σχέση των συνδεδεμένων γονιδίων με το χρωμόσωμα, που αποδεικνύεται κατά τις ανταλλαγές τμημάτων του ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Διασταυρώσεις Διασταυρώσεις στον αραβόσιτο, στη δροσόφιλα, Creighton & Stern 1931 McClintock 1931 Proof of physical exchange of genes on the chromosomes (2005) E. Coe and L. B. Kass. PNAS 102: 6641 ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Παρατηρήσεις ανασυνδυασμών στον φάγο λ (Meselson & Weigle, 1961) Δημιουργία ‘βαριών’ χρωμοσωμάτων φάγων με γονότυπο c mi (c, clear plaque - mi, minute plaque) καλλιεργώντας την E. coli που έχουν επιμολύνει σε πηγές με 13C και 15N (αντί για 12C και 14N). Μεικτές μολύνσεις E. coli με αυτούς τους φάγους και φάγους ++ ‘ελαφρείς’. Φυγοκέντρηση των απογόνων σε κλίση συγκέντρωσης CsCl. Παρατήρηση ζωνών στην κλίση με ανωτική πυκνότητα που αντιστοιχεί στα πατρικά χρωμοσώματα αλλά και μικτή. Οι φάγοι στις ζώνες αυτές είναι ανασυνδυασμένοι για τις c και mi θέσεις. Αν αντιστραφεί η σήμανση (: c mi φάγοι ελαφριοί και ++ βαριοί), ίδιο αποτέλεσμα. Απόδειξη της απαίτησης για φυσική σχέση του DNA κατά τον ανασυνδυασμό: σπάσιμο και επανασύνδεση ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Παρατηρήσεις ανασυνδυασμών στον φάγο λ (Meselson & Weigle, 1961) Δημιουργία ‘βαριών’ χρωμοσωμάτων φάγων με γονότυπο c mi (c, clear plaque - mi, minute plaque) καλλιεργώντας την E. coli που έχουν επιμολύνει σε πηγές με 13C και 15N (αντί για 12C και 14N). Μεικτές μολύνσεις E. coli με αυτούς τους φάγους και φάγους ++ ‘ελαφρείς’. Φυγοκέντρηση των απογόνων σε κλίση συγκέντρωσης CsCl. Παρατήρηση ζωνών στην κλίση με ανωτική πυκνότητα που αντιστοιχεί στα πατρικά χρωμοσώματα αλλά και μικτή. Οι φάγοι στις ζώνες αυτές είναι ανασυνδυασμένοι για τις c και mi θέσεις. Αν αντιστραφεί η σήμανση (: c mi φάγοι ελαφριοί και ++ βαριοί), ίδιο αποτέλεσμα. Απόδειξη της απαίτησης για φυσική σχέση του DNA κατά τον ανασυνδυασμό: σπάσιμο και επανασύνδεση ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Παρατηρήσεις χιασμάτων με τεχνική βαφής αδελφών χρωματίδων (Tease & Jones, 1978) Xρωμοσώματα σημασμένα με βρωμο- δεοξυουριδίνη (BrdU) (+ βαφή με Giemsa/φθορόχρωμα) Παρατήρηση μειωτικού ανασυνδυασμού σε κύτταρα ακρίδας, όπου η ανταλλαγή χρωματίδων κατά τον επιχιασμό γίνεται φανερή (a), κυρίως κατά και την έναρξη της ανάφασης (b και εικόνα δεξιά), λόγω της βαφής με BrdU. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Όρος: Ανασυνδυασμός Ο όρος ‘ανασυνδυασμός’ αναφέρεται πλέον κατεξοχήν σε φυσικό σπάσιμο και επανένωση χρωμοσωμάτων κατά τον επιχιασμό (crossing over) Morgan's illustration of crossing over from his 1916 A Critique of the Theory of Evolution..ή και κατά τις διαδικασίες άλλων επανενώσεων τμημάτων DNA, φυσικών ή τεχνητών (: ‘Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA’) ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Παρατηρήσεις γενετικής ανάλυσης που οδήγησαν στη διαμόρφωση μοντέλων ανασυνδυασμού Ανάλυση τετράδων σε ασκομύκητες…. Ο κύκλος ζωής της Neurospora crassa Μύκητες όπως η Neurospora και η Sordaria παράγουν ασκούς με διατεταγμένα ασκοσπόρια, οι πυρήνες των οποίων διατηρούν ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ τις θέσεις τους κατά τις διαιρέσεις.  Παρατηρήσεις γενετικής ανάλυσης που οδήγησαν στη διαμόρφωση μοντέλων ανασυνδυασμού Ανάλυση τετράδων σε ασκομύκητες…. Διάταξη σπορίων 4Α:4a ή 4a:4A Διάταξη σπορίων 2Α:2a:2A:2a ή 2a:2A:2a:2Α άνευ επιχιασμού ή 2Α:4a:2A ή 2a:4A:2a μετά από επιχιασμό Πρότυπο MI Πρότυπο ΜΙΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Περίπτωση διάταξης ασκοσπορίων 6:2;! (βέλος) Ασκοί και ασκοσπόρια περιθηκίου του ασκομύκητα Sordaria fimicola ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Αναλογίες ασκοσπορίων με άτυπους διαχωρισμούς αλληλομόρφων σε σχέση με τους κανονικούς 4:4 (ΜΙ) ή 2:4:2 ή 2:2:2:2 (ΜΙΙ) (παρουσιάζονται οι συνηθέστερες) Μοντέλο διάσχισης που εξηγεί τις αναλογίες 6:2 ή 5:3 (σε κύκλο, το αλληλόμορφο που έχει ‘μετατραπεί’) Στην 6:2 φαίνεται σαν να έχει μετατραπεί η γενετική θέση m της μίας χρωματίδας (a) Στην 5:3 σαν να έχει μετατραπεί η μισή χρωματίδα (b) ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Όρος φαινομένου: γονιδιακή μετατροπή (gene conversion) Το αλληλόμορφο που μετατρέπεται, μετατρέπεται πάντα στο έτερο της διασταύρωσης και με υψηλές συχνότητες - 0.1-1% σε ασκομύκητες ως 4% στη ζύμη: δεν πρόκειται για νέα μεταλλαγή 3:1:1:3 θυμίζει άτυπο 4:4 ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Γονιδιακή μετατροπή, πολικότητα και επιχιασμός Εκεί όπου υπάρχουν αναλυτικοί χάρτες σύνδεσης, παρατηρείται πολικότητα, δηλ. υψηλότερη συχνότητα γονιδιακών μετατροπών κοντύτερα στα σημεία των επιχιασμών. μείωση επιχιασμός Παράδειγμα: εδώ οι θέσεις γονιδιακή μετατροπή a/+ και m1/+ έχουν ανασυνδυαστεί στη θέση ανασυνδυασμού Ι. Κοντά σ’ αυτήν μετατρέπεται το m1 σε + με μεγάλη συχνότητα (μεγαλύτερη απ’ ότι το m2 ή άλλες τυχόν θέσεις καθοδικά). (Σχεδιάστε για ανασυνδυασμό στη θέση ΙΙ) ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Συν-μετατροπή (co-conversion) Γονιδιακή μετατροπή δύο ή περισσότερων θέσεων μαζί: τόσο συχνότερη όσο κοντύτερα βρίσκονται οι θέσεις ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Γονιδιακή μετατροπή Γονιδιακή μετατροπή και πολικότητα Πολικότητα και παρακείμενο σημείο επιχιασμού Συν-μετατροπή πολλαπλών θέσεων Μοντέλα ομόλογου γενετικού ανασυνδυασμού του DNA Μοντέλο Holliday (1964) Εγκοπές στις δύο αλυσίδες των εμπλεκόμενων χρωματίδων – χιαστές διεισδύσεις και δημιουργία ετεροδίκλωνου DNA εκατέρωθεν – μετανάστευση της διακλάδωσης Μοντέλο Meselson-Radding (1975) Εγκοπή σε αλυσίδα της μίας χρωματίδας και διείσδυση στην έτερη χρωματίδα – δημιουργία ετεροδίκλωνου DNA κατ’εξοχήν στη μία χρωματίδα Μοντέλο δίκλωνου σπασίματος και επιδιόρθωσης (Double-strand Break and Repair) (1985) Δίκλωνη εγκοπή και διεύρυνση του χάσματος στη μία χρωματίδα ως σημείο έναρξης ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Μοντέλο Holliday Εισαγωγή εγκοπής στη μία αλυσίδα έκαστης από δύο ζυγισμένες μη αδελφές χρωματίδες. Διασταυρωτή διείσδυση των μονόκλωνων 3’ άκρων και δημιουργία ετεροδίκλωνου DNA εκατέρωθεν. Γεφύρωση των αλυσίδων (cross-bridge) και ομοιοπολική συγκόλληση (: η δομή λέγεται ‘δομή Holliday’). Μετανάστευση της διακλάδωσης (branch migration). Ανάλυση της ενδιάμεσης δομής (resolution). Επιδιόρθωση αταίριαστης βάσης (mismatch repair). ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Ανάλυση της δομής Holliday: Η ανάλυση γίνεται με εγκοπές των απέναντι κλώνων στη δομή (a-b), που μπορεί να ειδωθεί και ως σταυροδομή (c-d), και επανασυγκόλληση των άκρων. Εναλλακτικές εγκοπές – οριζόντιες ή κάθετες στο (c) – δημιουργούν εναλλακτικά ανασυνδυασμένα μόρια (e): σε αυτά αριστερά δεν έχουν ανασυνδυαστεί οι θέσεις A/a και Β/b, ενώ στα δεξιά έχουν. Βάσει του μοντέλου, τυχόν ετεροδίκλωνο DNA που φέρει μεταλλαγή – εδώ η αρχική είναι AT- CG και στα τελικά προϊόντα (e), AC και ΤG ή GT – οδηγεί στο φαινόμενο της γονιδιακής μετατροπής, συναρτήσει της επιδιόρθωσης των αταίριαστων βάσεων. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Μεγέθυνση του σημείου γεφύρωσης και μετανάστευσης της διακλάδωσης κατά μήκος των ανασυνδυαζόμενων χρωματίδων Σταυροειδής διάταξη (‘σταυροδομή’) ανασυνδυαζόμενου πλασμιδιακού DNA, όπως φαίνεται στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Θεωρείται ότι αντιστοιχεί πλήρως με ανάλογες διατάξεις των χρωμοσωμάτων των ανώτερων οργανισμών κατά τους επιχιασμούς (βλ. εικ. προηγουμένως, διάταξη c). ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Προσαρμογή του μοντέλου Holliday σε αποτελέσματα διασταυρώσεων Η γονιδιακή μετατροπή και άτυπες αναλογίες 5:3 και 6:2 είναι αποτέλεσμα της επιδιόρθωσης των αταίριαστων βάσεων στα ετεροδίκλωνα μόρια (άνω και εικ. αριστερά). Το μοντέλο εξηγεί την πολικότητα και τη συν-μετατροπή. Η σπανιότητα των άτυπων 4:4 (3:1:1:3) σε σχέση με τα 6:2 οδήγησε στο επόμενο μοντέλο - ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Mοντέλο Meselson – Radding Η αλυσίδα της μίας χρωματίδας κόβεται και διεισδύει στην ομόλογη πλευρά της άλλης χρωματίδας, και η ίδιας πολικότητας αλυσίδα που εκτοπίζεται αποικοδομείται. Το ετεροδίκλωνο DNA το φέρει μόνο η μία χρωματίδα (και την πιθανότητα της γονιδιακής μετατροπής). Αν υπάρξει μετανάστευση της διακλάδωσης (σχήμα (e), δεξιά) τότε το αποτέλεσμα του μοντέλου θυμίζει αυτό του Holliday. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Παρατηρήσεις στις ζύμες: εισαγωγή πλασμιδίων σπασμένων (με δίκλωνα άκρα) οδηγεί σε 1000Χ αύξηση του μετασχηματισμού, δηλ. αφομοίωση του νεοεισερχόμενου DNA… Mοντέλο Szostak, Orr-Weaver και Rothstein δίκλωνων σπασιμάτων και επιδιόρθωσης Εγκοπές στις δύο αλυσίδες της μίας χρωματίδας και διεύρυνση του χάσματος με εξωνουκλεόλυση του 5’ άκρου. Διείσδυση του ενός ελεύθερου 3’ άκρου στην άκοπη χρωματίδα και εκτόπιση της ακέραιας και ίδιας πολικότητας αλυσίδας στο άνω χάσμα (δημιουργία D θηλειάς). Αντιγραφή DNA εκατέρωθεν (βλ. συνέχεια). ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Mοντέλο Szostak, Orr-Weaver και Rothstein δίκλωνων σπασιμάτων και επιδιόρθωσης Δημιουργία διπλού κόμβου Holliday και ανάλυση. Η επιδιόρθωση μπορεί να επιφέρει τη γονιδιακή μετατροπή (εδώ d σε D) και ανασυνδυασμό των εκατέρωθεν περιοχών των χρωματίδων (ce/CE προς cE/Ce, αριστερά) ή όχι (δεξιά). ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Mοντέλο Szostak, Orr-Weaver και Rothstein δίκλωνων σπασιμάτων και επιδιόρθωσης Eισαγωγή του όρου ‘double-strand-break’ (DSB) για το προτεινόμενο μοντέλο επιδιόρθωσης ή ανασυνδυασμού ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Επίσης: Επιδιόρθωση δίκλωνων χασμάτων με μοντέλο παρόμοιο με το DSB: Επιδιόρθωση SDSA (synthesis-dependent strand annealing) Υψηλής πιστότητας επιδιόρθωση που εξαρτάται από σύνθεση DNA με το χαρακτηριστικό ότι είναι εν μέρει συντηρητική (όχι ημισυντηρητική): καταλήγει σε τμήμα χρωματίδας με νεοσυντιθέμενες και τις δύο αλυσίδες και χρωματίδα-μήτρα, άθικτη. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Ο ενζυμικός μηχανισμός του ανασυνδυασμού Στο E. coli τον ανασυνδυασμό διεκπεραιώνουν κατά κύριο λόγο το σύμπλοκο πρωτεϊνών RecBCD (ExoV) και δευτερευόντως το RecFOR, σε συνεργασία με τη RecA, την κύρια πρωτεΐνη του ομόλογου ανασυνδυασμού. Η RecE (ΕxoVIII) μπορεί να αντικαταστήσει δραστηριότητες στο RecBCD μονοπάτι. Η ανάλυση κόμβων Holliday γίνεται από τις RuvABC. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Kατά τον ομόλογο ανασυνδυασμό, η RecA πολυμερίζεται πάνω στο μονόκλωνο DNA, δημιουργώντας νουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο (δεξιά: πολυμερισμός σε μονόκλωνο τμήμα δίκλωνου DNA με αντικατάσταση των Ssb πρωτεϊνών), και καταλύει τη διείσδυση αυτού στο δίκλωνο μόριο-στόχο. Το εισβάλλον DNA υβριδοποιείται με τη συμπληρωματική αλυσίδα και εκτοπίζει την αρχική, ίδιας πολικότητας, αλυσίδα (δημιουργία θηλειάς D). ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Ομοεξαμερές της RecA αποτελεί την πραγματική δομή πρόσδεσης στο μονόκλωνο νήμα Kαταδεικνύονται σε διαδοχή οι δραστηριότητες Ssb-τύπου πρωτεΐνης της RecA (δεξιά) και ΑΤΡάσης (αριστερά). Η υδρόλυση του ATP οδηγεί σε απελευθέρωση της RecA από τη ‘διακοσμημένη’ αλυσίδα, που τώρα υβριδοποιείται με τη συμπληρωματική. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Στην εικ. 19-18, και κατά τον ανασυνδυασμό, ανταλλάσσονται αλυσίδες στοιχισμένων ομόλογων δίκλωνων DNAs κατά Ηolliday. Έχει προηγηθεί η εγκοπή που επιφέρει η RecBC νουκλεάση και εκατέρωθεν διεισδύσεις. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Το σύμπλοκο RecBCD (εξωνουκλεάση V) σαρώνει το DNA για αλληλουχίες ‘χ’ (chi) – 5’-GCTGGTGG-3’ – κόβει σε αυτές και δημιουργεί μονόκλωνο υπόστρωμα για τη RecA. (λειτουργεί σε συμβατικό και επιδιορθωτικό ανασυνδυασμό) Με τη δράση του RecBCD (RecC πρωτεΐνης αναγνώρισης του ‘χ’, RecB και RecD ελικασών, επικράτεια RecB νουκλεάσης/στρατολόγησης της RecA), γίνονται ενέργειες όπως περιγράφονται στα (Α) και (Β): δημιουργία εισβάλλουσας 3’ αλυσίδας και μονόπλευρες διεισδύσεις ή χιαστί ανταλλαγές (Α - εκδοχές h, g). Ανάλογα με τις συνθήκες το σύμπλοκο μπορεί να λειτουργήσει και ως δίκλωνη εξωνουκλεάση μέχρι την εύρεση του ‘χ’.  Το σύμπλοκο RecBCD (εξωνουκλεάση V) σαρώνει το DNA για αλληλουχίες ‘χ’ (chi) – 5’-GCTGGTGG-3’ – κόβει σε αυτές και δημιουργεί μονόκλωνο υπόστρωμα για τη RecA. (λειτουργεί σε συμβατικό και επιδιορθωτικό ανασυνδυασμό) Καταδεικνύεται η λειτουργία δίκλωνης εξωνουκλεάσης του RecBCD συμπλόκου ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  To σύμπλοκο RecFOR διορθώνει κυρίως μονόκλωνα χάσματα ή δίκλωνα σπασίματα στη θέση του RecBCD (όταν αυτό είναι δυσλειτουργικό) (επιδιορθωτικός ανασυνδυασμός) Εδώ η εξωνουκλεάση είναι η RecJ, ελικάση η RecQ και οι RecFOR φορτώνουν τη RecA στο διεισδύον 3’ άκρο. Model for dsDNA break repair by the proteins of the RecF pathway. The exonuclease activity of RecJ resects duplex DNA by degrading in the 5′ → 3′ direction, stimulated by RecQ helicase and SSB. The resultant ssDNA tail is bound by SSB. (Left) The RecFOR complex binds at the ssDNA–dsDNA junction on the resected DNA, and loads RecA onto the ssDNA. (Right) The RecOR complex can also mediate exchange of RecA for SSB bound to ssDNA at sites away from the junction. The RecA-ssDNA nucleoprotein filament invades homologous recipient duplex DNA. RecJ can contribute to stabilization of the D-loop by degrading the displaced ssDNA after nicking (not shown), whereas RecQ helicase may disrupt recombination intermediates by unwinding from 3′ → 5′ direction. At this point (not shown), the joint molecule can be converted to a Holliday junction and resolved, or disrupted after DNA synthesis to anneal with the second end of a dsDNA break. Genes & Dev. 2009. 23:1234-1245 ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Η μετανάστευση της διακλάδωσης και η ανάλυση του κόμβου Holliday (Holliday junction) γίνεται με συμμετοχή των RuvAB και RuvC αντιστοίχως Η RuvA δεσμεύεται στη διασταύρωση (1-2 τετραμερή) και στρατολογεί εξαμερή των RuvB (ΑΤPάσες/ελικάσες – μοτέρ). Διμερές της RuvC εισάγει τομές για την ανάλυση. Χωροπληρωτικό μοντέλο των RuvA, RuvB και DNA σταυροειδούς διάταξης (σταυροδομής) Φαίνεται η προώθηση των αλυσίδων (μετατόπιση των θέσεων E, D, C) κατά τη μετανάστευση της διακλάδωσης ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Η μετανάστευση της διακλάδωσης και η ανάλυση του κόμβου Holliday (Holliday junction) γίνεται με συμμετοχή των RuvAB και RuvC αντιστοίχως Η RuvA δεσμεύεται στη διασταύρωση (1-2 τετραμερή) και στρατολογεί εξαμερή των RuvB (ΑΤPάσες/ελικάσες – μοτέρ). Διμερές της RuvC εισάγει τομές για την ανάλυση. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Εναλλακτικές εκδοχές λύσης του κόμβου Holliday στα βακτήρια Παρουσία της RecA, και στην κατεύθυνση της διείσδυσης της μονόκλωνης αλυσίδας, το σύμπλεγμα ελικάσης/ενδονουκλεάσης RuvABC μεταναστεύει και λύει τον κόμβο (πάνω δεξιά). Επίσης παρουσία της RecA, η RecG ελικάση συμβάλλει στην αντίθετη μετανάστευση του κόμβου (πάνω αριστερά). Όταν η RecA αποπολυμεριστεί από την αλυσίδα, η RecG λειτουργεί σαν τις Ruv και η Rus εισάγει τις τομές (κάτω αριστερά – οι RecG/Rus υποκαθιστούν δηλ. τις Ruv σε περίπτωση μεταλλαγής). Επίσης η Rus μόνη της αναλύει τον κόμβο Holliday επί τόπου (κάτω δεξιά). ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Η Rad51 είναι η ομόλογη της RecA στα ευκαρυωτικά Η δράση της κατά τον επιδιορθωτικό ή μειωτικό ανασυνδυασμό ρυθμίζεται από οικογένεια ομόλογων πρωτεϊνών. Στον επιδιορθωτικό ανασυνδυασμό, συμμετέχει η BRCA2, που επιβοηθά τη Rad51 στον πυρηνικό εντοπισμό, τον πολυμερισμό και άλλες λειτουργίες. Μειωτικός ανασυνδυασμός Μεταλλαγές στa γονίδιa BRCA2 και BRCA1 (δρα πρότερα από το BRCA2) προκαλούν κυρίως γυναικολογικούς καρκίνους που Επιδιόρθωση σχετίζονται με προβλήματα στην επιδιόρθωση του DNA ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Η Dmc1 είναι επίσης ομόλογη της RecA στα ευκαρυωτικά Στον μειωτικό ανασυνδυασμό η πρωτεΐνη Dmc1 (‘disrupted meiotic cDNA 1’) φαίνεται να συνεργάζεται με τη Rad51 στη διείσδυση και τις ανταλλαγές αλυσίδων. Θεωρείται η έτερη ομόλογη της RecA στα ευκαρυωτικά. Το εναρκτήριο έναυσμα το προκαλούν δίκλωνες εγκοπές που εισάγονται από την τοποϊσομεράση Spo11, με ακόλουθη νουκλεόλυση των 5’ άκρων. Οι μονόκλωνες 3’ προεξοχές καλύπτονται από τις Rad51/Dmc1 και σύμπλοκα άλλων πρωτεϊνών. H Dmc1 πρωτοχαρακτηρίστηκε στη ζύμη και ορθόλογές της υπάρχουν σε μύκητες, φυτά, θηλαστικά και άνθρωπο, όχι όμως σε όλους τους ευκαρυωτικούς. Πχ δεν έχουν βρεθεί γονίδια για Dmc1-τύπου πρωτεΐνες στη δροσόφιλα ή τον C. elegans. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Άνισοι επιχιασμοί και διπλασιασμοί ή ελλείψεις γονιδίων (συμβολίζονται εδώ με ++ ή - ) (++) (-) Περίπτωση όπου το γονίδιο της β- σφαιρίνης έχει διπλασιαστεί στο ένα χρωμόσωμα και εξαλειφθεί από το άλλο μέσω άνισου επιχιασμού. Αιτία, μια αλληλουχία Line 1 (L1 – long interspersed repeat element), που γίνεται υπόστρωμα ομόλογου (++) ανασυνδυασμού. (-) ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Mεταθετά στοιχεία και επαναλαμβανόμενο DNA: παγίδες ομόλογου ανασυνδυασμού ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Aνασυνδυασμός ειδικής θέσης (site-specific recombination): γενετικός ανασυνδυασμός σε συγκεκριμένες αλληλουχίες Cre-loxP ανασυνδυασμός Cre (causes recombination), loxP (locus of X-over P1) O φάγος Ρ1 χρησιμοποιεί την Cre ρεκομπινάση : ιντεγκράση (integrase) με ομολογίες δομής και λειτουργίας με τοποϊσομεράσες Ι, για να αναλύεται σε μονομερή και να ελέγχει τον αριθμό αντιγράφων του. Η Cre καταλύει τον ανασυνδυασμό ανάμεσα σε DNAs που φέρουν loxP θέσεις: παλινδρομικές αλληλουχίες 34 βάσεων ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-ATACGAAGTTAT, δημιουργώντας κατά τη διαδικασία δομές Holliday, που επίσης αναλύει. Δομή διμερούς της Cre πάνω σε DNA που φέρει loxΡ θέση ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Aνασυνδυασμός ειδικής θέσης (site-specific recombination): γενετικός ανασυνδυασμός σε συγκεκριμένες αλληλουχίες Π.χ. Cre-loxP ανασυνδυασμός Eφαρμογές του Cre-loxP συστήματος στη γενετική μηχανική: εκούσιες απαλοιφές γονιδίων που περιβάλλονται από loxP θέσεις παρουσία της πρωτεΐνης Cre. (εδώ, το γονίδιο που απομακρύνεται είναι αυτό της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης, gfp) Cre ρεκομπινάση ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Δημιουργία κυτταρικών σειρών και οργανισμών ‘floxed’ (με loxP-flanked DNA) για την παρατήρηση της γονιδιακής λειτουργίας κατόπιν ελεγχόμενων επεμβάσεων σ’ αυτήν (: επαγόμενη έκφραση Cre και ανασυδυασμών στις lox θέσεις). ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Ομόλογος ανασυνδυασμός για εισαγωγή ή απαλοιφή γονιδίων στη γενετική μηχανική (knock-ins και knock-outs) Εισαγωγή φορέα και διαγονιδίου (transgene) σε περιοχή DNA-στόχου, χρωμοσώματος πχ, μέσω μονού ανασυνδυασμού. Ο ανασυνδυασμός γίνεται ανάμεσα σε ομόλογες θέσεις (στο σχήμα, μπλε/γαλάζιες) και εισάγει όλο το ξένο μόριο στο DNA-στόχο (‘Campbell integration’). Ι Στο (ΙΙ) παρουσιάζεται περαιτέρω αφαίρεση αλληλουχιών φορέα με ανασυνδυασμό ανάμεσα σε θέση μετά το διαγονίδιο (πορτοκαλί) και περιοχή του χρωμοσώματος-στόχου (κόκκινη). ΙΙ Απαλοιφή (knock-out) γονιδίου με αντικατάσταση αλληλομόρφου (allele exchange) μέσω διπλού επιχιασμού. To γονίδιο-στόχος αντικαθίσταται με γονίδιο επιλογής (selection marker gene), πχ γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό. Η έννοια ‘αλληλόμορφο’ παραπέμπει στο ότι προηγείται κλωνοποίηση του γονιδίου-στόχου και ένθεση σ’ αυτό του γονιδίου επιλογής. Τεχνητή κατασκευή δηλ. που χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα ομολογίας για τον διπλό επιχιασμό.  HDR NHEJ A double-stranded break (DSB) in the DNA can be repaired through the process of homologous recombination (HR) or through the error-prone process of non-homologous end-joining (NHEJ). In HDR (homology-directed repair), a template is used to correct the DSB. HDR can be used to precisely introduce a gene or part of a gene or even a point mutation, whereas NHEJ can result in insertions and/or deletions (indels) around the DSB. An indel can lead to a frameshift and an early stop codon.  H Cas9 είναι ενδονουκλεάση απομονωμένη από Streptococcus pyogenes. Εισάγει δίκλωνa σπασίματα στο DNA, σε σημεία όπου καθοδηγείται από μικρό ολιγομερές RNA (sgRNA, single guide RNA) και υπάρχει ομολογία ανάμεσα στο sgRNA και την αλληλουχία DNA. Την εντομή ακολουθεί συνήθως επιδιόρθωση NHEJ, δηλ. εισαγωγή μεταλλαγών (γονιδιακό knock-out) και με μικρότερη συχνότητα HDR- εξαρτώμενη διόρθωση γονιδίου. Με επίσης χαμηλή συχνότητα, μπορεί να γίνει HR-εξαρτώμενη εισαγωγή γονιδίου (knock-in).  Tύποι ανασυνδυασμών: ομόλογος, μη ομόλογος (νόθος), ειδικής θέσης, ανασυνδυασμός ως αποτέλεσμα μετάθεσης μεταθετού στοιχείου http://www.bx.psu.edu ΣΗΜ. Τα μεταθετά στοιχεία μετατίθενται με μη ομόλογο ανασυνδυασμό, με ή χωρίς αντιγραφή του εαυτού τους (βλ. ύλη Μοριακής Γενετικής) ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ Επιτομή Ο ομόλογος γενετικός ανασυνδυασμός δημιουργεί νέους συνδυασμούς γονιδίων (ή μερών των γονιδίων) στα γονιδιώματα ανώτερων και κατώτερων οργανισμών Γενετικές, κυτταρογενετικές και φυσικοχημικές παρατηρήσεις οδήγησαν στην ιδέα του σπασίματος και επανένωσης των χρωμοσωμάτων Το φαινόμενο της γονιδιακής μετατροπής και η ανάλυση διατεταγμένων τετράδων στους απλοειδικούς μύκητες, όπου έκαστη χρωματίδα και αλυσίδα χρωματίδας διαχωρίζονται σε διαφορετικούς πυρήνες, σπόρια και οργανισμούς (!), οδήγησε στα σύγχρονα μοριακά μοντέλα ανασυνδυασμού. Αυτά περιλαμβάνουν κοινά σημεία: δημιουργία ετεροδίκλωνου DNA, σύνθετων δομών και ανάλυση αυτών, επιδιόρθωση αταίριαστων βάσεων. Πολλά γονίδια που συμμετέχουν στον ανασυνδυασμό, συμβατικά και εναλλακτικά, είναι καλά χαρακτηρισμένα στα βακτήρια. Στα ευκαρυωτικά, λιγότερα. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός ευθύνεται όχι μόνο για ισότιμες ανταλλαγές αλλά και για ανισότιμες, επιφέροντας ανακατατάξεις στα γονιδιώματα (διπλασιασμούς, αναστροφές, ελλείψεις). Δεν είναι όλοι οι ανασυνδυασμοί ομόλογοι: υπάρχουν και μη ομόλογοι (νόθοι), ειδικής θέσης και παραλλαγές αυτών (π.χ. αντιγραφικός στα μεταθετά στοιχεία). Τα μοριακά φαινόμενα και η ενζυμολογία κατά τον ανασυδυασμό και την επιδιόρθωση χρησιμοποιούνται στις σύγχρονες εφαρμογές τροποποίησης γονιδίων ή γονιδιωμάτων. ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Κατανομή έγχρωμων σπορίων σε ασκούς του μύκητα Sordaria fimicola. Tα χρωμοσώματά τους συμβολίζονται με παχιά γραμμή ? και το υπεύθυνο γονίδιο βρίσκεται στη γενετική θέση ‘1’. Quiz: σχεδιάστε μια Υποδεικνύονται φαινόμενα γονιδιακής μετατροπής και άτυπες διάσχιση γονιδίου για αναλογίες χρώμα/όχι χρώμα που να (Γενετική Δούκα – Τύπα σελ. 216). εξηγεί την οκτάδα ? ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ  Σε διασταύρωση μυκήτων τύπου: ? Μ +2 Ν ____________ όπου 1, 2 μεταλλαγμένες θέσεις γονιδίου θρέψης του οργανισμού και Μ, Ν γενετικές θέσεις εκατέρωθεν Χ ____________ m 1+ n συναντώνται σπάνιοι πρωτότροφοι τύποι (++) μετά από επίστρωση σε ελάχιστο θρεπτικό υλικό (ΜΜ, minimal medium). Τύποι M++n είναι οι πλέον συνηθισμένοι, αλλά μπορεί να βρεθούν και Μ++Ν και m++n: (1) Εξηγείστε την προέλευση αυτών βάσει μοριακών μοντέλων γενετικού ανασυνδυασμού (2) Αν τύποι Μ++Ν είναι συχνότεροι από m++n, τι μπορεί να σημαίνει αυτό; ΓΕΝΕΤΙΚΗ - ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΚΠΑ