Virus Pathogenesis - Microbiologia

LEZIONE 17: PATOGENESI VIRALE 1. INTRODUZIONE I virus sono parassiti obbligati che devono interagire con parti della cellula. Esistono virus che possono inibire la sintesi del DNA, dell'RNA... L’interazione del virus con la cellula altererà le funzioni della cellula: ➔ Effetto citopati...

LEZIONE 17: PATOGENESI VIRALE 1. INTRODUZIONE I virus sono parassiti obbligati che devono interagire con parti della cellula. Esistono virus che possono inibire la sintesi del DNA, dell'RNA... L’interazione del virus con la cellula altererà le funzioni della cellula: ➔ Effetto citopatico. La presenza di un virus nella cellula spesso causa cambiamenti morfologici. Per effetto citopatico si intende un qualsiasi cambiamento nella cellula ospite conseguente all’infezione virale. 2. EFFETTO DEI VIRUS SULLA CELLULA L’effetto citopatico può essere : Lisi cellulare: alcuni virus hanno effetto citolitico Distacco delle cellule dalla superficie, nelle cellule che aderiscono Formazione di sincizi: sono cellule multinucleate che risulta dalla fusione di più cellule individuali. Aggregazione cellulare: Nell'aggregazione, le cellule preservano la loro individualità. Ingrossamento e raggrinzimento cellulare Riarrangiamento del citoscheletro *Non confondere la fusione con l'aggregazione, poiché nella prima le cellule si fondono creandone una sola e nella seconda le cellule continuano a conservare la loro individualità. →Diversos tipos de alteracion del virus puede determinar los diferentes efectos de la celula. Efetto nell’apoptosis: L’apoptosi è un meccanismo che funge da difesa per prevenire la diffusione dell’agente patogeno. Si è visto che esistono alcuni virus che agiranno su questo meccanismo: - Molti virus inducono apoptosi (morte cellulare programmata). Questo può essere una difesa cellulare importante contro le infezioni virali (morte della cellula prima che il ciclo di replicazione virale sia completato). - Alcuni virus ritardano l’apoptosi per favorire la propria replicazione e propagazione. Effetto nell’espressione genica: Le alterazioni dell'apoptosi dipendono dall'interazione tra proteine cellulari e virali. Alcuni virus modulano l’espressione genica della cellula ospite a proprio vantaggio. L’effetto citopatico dipende dal virus e dalla cellula in cui cresce, e può essere utilizzato a scopo diagnostico. Lo stesso virus causerà infezioni diverse a seconda della cellula in cui agisce. 3. PATOGENICITÀ → La patogenicità è il processo con cui l’infezione virale causa malattia “Conflitto evolutivo” Da un punto di vista evolutivo, il virus deve replicarsi e diffondersi in tutta la popolazione, quindi l’evoluzione del virus con l’ospite tende a favorire infezioni a bassa patogenicità. Questo è anche il motivo per cui ci sono molti virus asintomatiche.  Fasi patogenesi 1. Ingresso 2. Impianto e diseminazione 3. Diffusione agli organi bersaglio: esto determina la oblacion de la porgenia 4. Eliminazione e trasmissione 1. Vie di ingresso Cute (traumi, punture, morsi, iniezioni) Via respiratoria (imp paesi occid): se considura la via fundamental en paises mas desarrollados economicamente. Via alimentare (imp paesi in via di sviluppo - epid. circuito oro-fecale) Tratto genitale Congiuntiva Transmissione verticale È la trasmissione dei genitori ai figli, puede ocurrir por diversos motivos: - Infezione delle cellule germinal - Infezione transplacentare (inf. intrauterina, ‘congenita’) (es. CMV, v. rosolia, HIV, HBV hepatitis B) - Infezione alla nascita (o ‘neonatale’) (es. HSV herpes simplex, HIV, HBV hepatitis B) - Infezioni tramite allattamento (inf. ‘perinatale’) (es. HIV, CMV, HBV) 4. TROPISMO È la affinità per specifici tessuti e tipi cellulari e sono stato determinato da diversi fattori: ❖ Barriere fisiche ❖ Temperatura (es. Rhinovirus nelle vie respiratorie superiori) ❖ pH (es. Enterovirus resistenti al passaggio in ambiente acido): infezioni di tipo gastrointestinale. ❖ Recettori di membrana (es. v. rabbia e recettore per acetilcolina) ❖ Fattori di modulazione della trascrizione che si legano alle zone di regolazione del genoma virale (es. HBV in epatociti, JCV in oligodendrociti) 5. INFEZIONE Una volta che e entrato si possono verificare diverse situazioni: - Infezione localizzata: Nel caso più semplice il virus raggiunge il sito di ingresso, infetta le cellule e genera una piccola infezione localizzata, senza diffusione capillare del virus. Un esempio di questo è il papillomavirus, che rimane localizzato e crea l'alterazione in una sede specifica. - Diffusione del virus attraverso il torrente circolatorio Infezione sistemica: Il virus si replicherà e si diffonderà attraverso il flusso sanguigno (viremia), questo porterà il virus all'organo bersaglio, che sarà dove rimarrà il virus. Potrebbero esserci anche organi secondari nell'infezione. Un esempio di ingresso e localizzazione nell'organo bersaglio è il virus dell'epatite, questo virus raggiungerà il suo organo bersaglio (fegato) attraverso vari mezzi. Diffusione del virus attraverso i nervi – infezione disseminata: Una volta che il virus si è diffuso, può raggiungere diversi organi e tessuti, incluso il sistema nervoso centrale (SNC) o i gangli. Alcuni virus, come quello della rabbia o l'herpes simplex, hanno la capacità di viaggiare attraverso i neuroni e arrivare al SNC, dove possono causare gravi malattie. 6. RILASCIO Una volta che il virus si è replicato dovrebbe essere rilasciato per diffondersi, fondato questo rilascio. Si manifesta in termini respiratori e alimentare, le principali modalità di trasmissione. Sangue (es. HIV, HBV, HCV, HTLV) Latte materno (es. HIV, HBV, CMV) Tratto genitale (es. HIV, HBV, HSV, HPV) Alcuni virus hanno sedi di rilascio multiple (es. HIV, CMV) In tutti i virus in cui è presente un elevato livello di setticemia, il virus potrebbe essere rilasciato attraverso il sangue questa (sebbene questa non sia la principale via di trasmissione). 7. PATOGENESI Requisiti: Superamento delle barriere fisiche Superamento delle difese aspecifiche e specifiche dell’ospiteDiffusione agli organi bersagli Moltiplicazione in quantità sufficiente per danneggiare l’organo o Citopatologia diretta (morte cellulare) o Induzione di rilascio di fattori tossici: pueden derivar del ospite o Innesco di reazioni immunopatologiche: La risposta immunitaria è molto importante per lo sviluppo della malattia. → Immunopatogenesi: Molti meccanismi immunologici per riconoscere ed eliminare virus ❖ Molti meccanismi immunologici per riconoscere ed eliminare virus ❖ Risposta immune può diventare nociva soprattutto se il virus persiste ▪ Ipersensibilizzazione agli Ag virali: alcuni virus danno una infezione persistente, la continua presencia del virus dara una resuesta_______ ▪ Sindrome da immunocomplessi (es. HBV, EBV, B19): Si è visto che la produzione eccessiva di immunocomplessi porterà ad una risposta del sistema immunitario molto forte. Ciò si verifica perché abbiamo un’esposizione molto elevata agli antigeni. Altri aspetti si verificano a causa del danno all'immunità cellulo-mediata. ▪ Danni da immunità cellulo-mediata (es. HSV, VZV, HBV, FLU) → Patogenesi a livello cellulare: 1. Virus e cellula competono per lo stesso apparato di sintesi delle macromolecole. 2. Equilibrio evolutivo fra la necessità di riprodurre i componenti virali e la necessità di mantenere efficiente l’apparato biosintetico cellulare. Debe esserci un equilibrio in cui il virus possa continuare a replicarsi, quindi non deve essere troppo letale per l'ospite. 3. Meccanismi vari per assumere il controllo dell’apparato biosintetico a favore della sintesi dei componenti virali. 4. Danneggiamento della cellula come ‘effetto collaterale’→ effetto citopatico, ciò è dovuto alle modifiche che il virus apporta alle cellule. 8. INTERAZIONE VIRUS-CELULA Ci sono due tipi di cellule a seconda interagiscono con il virus: Cellula sensibile: presenza recettori per quel virus. La cellula sensible può essere: - Permisiva: Se supporta la replicazione di quel virus. In queste cellule il virus può causare: o Infezione produttiva o Infezione restrittiva - Non permisiva: In questo caso la infezione non si verifica→ abortiva. Questo perché queste cellule non consentono al virus di subire il ciclo di replicazione. A volte una cellula può essere permissiva o non permissiva verso lo stesso patogeno a seconda del momento del ciclo in cui si trova: replicativa o differenziale. → Dobbiamo anche tenere presente che ci sono più situazioni intermedie. Tipi di infezioni ❖ Infezione citocida Alcuni virus raggiungono la cellula e la uccidono per replicarsi. Effetti morfologici (CPE), sulla fisiologia cellulare (messaggeri secondari, flussi ioni), sulla biochimica cellulare (attività trascrizionale, interazioni proteina-proteina), effetti genotossici (rottura, frammentazione e riarrangiamanto del DNA cellulare), effetti biologici (alterazioni antigeniche)  ➔ effetto citopatico (CPE): - Alterazioni del citoscheletro e cambiamento morfologia (es. arrotondamento) - Inclusioni nucleari o citoplasmatiche (addensamento di componenti virali anche associati a microfilamenti cellulari e microtubuli). - Formazione di sincizi (cellule giganti multinucleate generate da passaggio virus diretto da cellula a cellula) ❖ Infezione persistente Mancata eliminazione del virus dopo l’infezione primaria e permanenza a tempo indefinito. Puo durare settimane, mese o tutti la vita. Spesso coinvolti stadi di infezione silente e produttiva. Problema per le prime due: Possibilità di riattivazione della replicazione virale. Latente (espressione parziale del genoma virale) Il virus esprime alcuni geni ma non ci sarà produzione di progenie. - Cronica (produttiva ma intermittente o limitata a poche cellule). A differenza della precedente, in questa ci sarà produzione di progenie virale e a differenza di quella acuta i livelli saranno molto bassi. Non sarà come nell’infezione acuta (non persistente) in cui il virus si diffonde attraverso molte cellule, ma nell’infezione cronica il virus si replica in un numero limitato di cellule. - Lenta (lungo periodo di incubazione, ingravescente). Fattori implicati nelle infezioni persistenti Modulazione della risposta immunitaria (evasione) - Riconoscimento limitato - Alterazione attività linfociti / monociti (citochine) - Localizzazione in siti privilegiati (es. HSV, VZV in CNS) Modulazione dell’espressione del genoma virale - Proteine virali associate a latenza (es. EBV - EBNAs) - Trascritti virali associati a latenza (es. HSV - LATs): Estronga regolazione dell'espressione dei geni virali o di DNA non codificante che favorisce la permanenza del virus in forma latente. Infezione latente e riattivazione Alcuni virus hanno una reattivazione più frequente, mentre altri sono meno frequenti. Sappiamo che alcuni tipi di infezione possono promuovere la reattivazione, o che possono verificarsi eventi traumatici che inducono un equilibrio. Cambiamenti fisici o fisiologici che possono favorire la reattivazione: Altre infezioni (ad esempio, infezioni varie in pazienti HIV+) Trauma (ad esempio, HSV dopo intervento chirurgico al ganglio del trigemino) Cambiamenti fisici/fisiologici (ad esempio, temperatura, UV, cambiamenti ormonali) Immunosoppressione (chemioterapia antiblastica, trapianti, AIDS) Normalmente, cuando hay un sistema inmunitario menos activos, la reactivacion es mas posible Controllo delle infezioni virali persistenti Successo finora maggiore con antivirali che con metodi immunomodulanti ❖Potenziamento della risposta immune (‘vaccinazione terapeutica’) (es. sperimentali HSV, HIV) ❖ Interferone (es. HCV, HBV, HPV) ❖ Antivirali (es. HIV, HCV, HBV, HSV, CMV). In generale, abbiamo antivirali che sono limitati a pochi virus; per la maggior parte dei virus non esiste una terapia antivirale. Questi farmaci esistono per virus con un impatto sanitario significativo, come l'HIV, l'HCV, ecc. 9. TRANSFORMAZIONE CELLULARE La trasformazione neoplastica è un processo multifattoriale e multifasico causato da più eventi genetici sopravvenienti, che si accumulano nel DNA cellulare e che, alla fine, determinano la perdita del controllo fisiologico della replicazione cellulare. Es un evento che determina la perdita de una cellula dei meccanismi de controllo che regulano la replicazione. Questi eventi son quelli che avengono nell svirupo dei tumori. Hay virus que Caratteristiche delle cellule trasformate: - Capacità di moltiplicarsi illimitatamente in coltura (immortalizzazione): celulas inmortalizadas - Causare tumore in animale da esperimento singenico o immunodepresso. La proliferazione cellulare è normalmente controllata da fattori inducenti o inibenti denominati rispettivamente: Oncogeni: Promuovono la proliferazione, sopravvivenza, crescita e differenziamento cellulare (es. fattori di crescita, recettori per fattori di crescita, messaggeri secondari, fattori di trascrizione, inibitori dell’apoptosi). Geni oncosppressori: Controllano negativamente la proliferazione cellulare (es. p53 e Rb) promuovendo in molti casi l’apoptosi. Questi blocanno la proliferazione. Le proteine virali devono promuovere uno stato proliferativo della cellula per permettere la sintesi degli acidi nucleici e la replicazione virale Per fare ciò utilizzano diverse strategie: De-regolazione ciclo cellulare Inibizione apoptosi cellulare Interferenza con la risposta immunitaria In questo modo un virus può inavvertitamente iniziare il processo di trasformazione cellulare. Virus oncogeni: La trasformazione cellulare da virus si accompagna ad una infezione persistente/latente (non controllata dal sistema immunitario) con espressione solo di alcuni geni precoci del genoma virale che rimane nella cellula (integrato o episomiale). Virus, oncogeni e trasformazione ❖ Possibilità di trasformazione rapida grazie all’attività polifunzionale di alcuni loro geni (‘oncogeni’ virali) (es. retrovirus con oncogene) ❖ Alterata espressione di oncogeni cellulari ❖ Inattivazione di proteine ad attività anti-oncogena A traves los meccanismos va a alaterar el ciclo celular, puede actuar sobre las proteinas reguladoras, mensajeros secundarios… todos los sitemas que son importantes para controlar la omeostasis. Il virus puo indurre infezione che favoriscono il proceso de __ celulare. Si parla di virus onco___. en general el efecto de transformacion se socia a virus de infeccion latente / persstente ya qu ela transformacion requiere tiempo. Il virus remane, hay virus en los que : con espressione solo di alcuni geni precoci del genoma virale che rimane nella cellula (integrato o episomiale Alcuni virus possono contenere geni che funzionano come oncogene, il virus e in grado de alterare la exressione. Il virus inactiva proteinas estas situaciones crean un desequilibrio del ciclo celular. Cuales son los virus que seguramente tengan una __ en el hombre Es importante q se ha visto que una muchos virus que afectan a tumores. Estio es importante pq el contropl de tumor s epuede hacer dirigiendose hacia el virus ejemplo: con vacunas protegemos contra diferentes tiops de tumores. Ademas puede influenciar en el afect s Implicazioni dell’origine infettiva dei tumori Implicazioni in ambito di prevenzione, diagnosi e terapia  Controllo dei tumori mediante lo sviluppo di nuovi farmaci e di vaccini preventivi/curativi (es. HPV) Sviluppo di metodi diagnostici per la valutazione delle infezioni/trasformazione e per il management dei pazienti Possibilità di trattamento dei tumori agendo direttamente contro i virus o contro cellule che esprimono antigeni virali (es. Immunoterapia) Por lo que esto ha ampliado la posibilidad de intervenir. LEZIONE 18: ASPETTI GENERALI SUI FARMACI ANTIVIRALI 1. INTRODUZIONE I farmaci antivirali sono necessari per ridurre i danni (alla persona ed economici) arrecati dalle infezioni virali e per trattare il numero in continuo aumento di pazienti sottoposti a immunosoppressione e che sono ad alto rischio di infezione. Farmaco antivirale ideale dovrebbe: essere in grado di inibire selettivamente le funzioni virali senza danneggiare la cellula ospite ridurre i sintomi della malattia senza modificare l’infezione virale in modo da non ostacolare la risposta immunitaria dell’ospite. 2. MECCANISMO D’AZIONE Virucidi - inattivano il virione (es. UV, etere, freddo, …) Antivirali - inibiscono la replicazione virale a livello cellulare Immunomodulatori - modificano la risposta dell’ospite, favorendo una magliore effizenza nell confronti del virus. Tutte le fasi del ciclo replicativo del virus possono essere bersagli di diversi antivirali: alcuni inibiscono l'ingresso del virus, altri inibiscono la capsidazione, l'espressione di ac. Nuclei, processi di maturazione o possono inibirne il rilascio per impedirne la diffusione. Inhibitori della entrada: o Inhibitori della fusione; Enfuvirtide per HIV – peptide che interagisce con gp41. o Inhibitori dei corecettori (blocca l'interazione con le proteine di ricezione che bloccano l'ingresso): (Maraviroc per HIV – interagisce con CCR5). Inhibitori della scasidazione o Amantidina o Rimantadina → Entrambi sono usati contro i virus dell’influenza di tipo A. Farmaci attualmente usati per il trattamento del virus dell’influenza, inibiscono l’attività della proteina M2 Inhibitori della sintesis degli ac. Nucleici virali: o Inhibitori della DNA pol virale: aciclovir e gangluovir per herpesvirus o Inhibitori della transcrittasi inversa: es. analoghi nucleosidici –Azidotimidina; analoghi non nucleosidici o Inhibitori della RNA-Pol RNA dip: antiHCV e ribavirina Inhibitori dell’integrasi: Per HIV Inhibitori delle proteasi: Farmaci anti-HIV, -HCV, CoV Inhibitori del rilascio: Osealtamivir e zanamivir: oseltamivir e zanamivir.  3. RESISTENZA AGLI ANTIVIRALI La resistenza antivirale è stata documentata per molti farmaci ed è essenzialmente dovuta a mutazioni puntiformi o delezioni nel genoma virale. La maggior parte dei virus resistenti si sviluppa in pazienti immuno-compromessi. Inoltre, di solito è più comune nei virus che causano infezioni acute come l’influenza, poiché in queste situazioni il tempo di esposizione al virus aumenterà, dandogli più tempo per mutare in una forma resistente. La ricerca di mutazioni è essenziale in molti casi per stabilire l’appropriata terapia. La ricerca di mutazioni è essenziale in molti casi per stabilire l’appropriata terapia. I virus a RNA (la maggior parte dei virus) mutano più dei virus a DNA. 4. SISTEMA INTERFERON L’interferone fu descritto per la prima volta da Isaacs e Lindeman nel 1957 come un fattore in grado di bloccare la replicazione virale.«sistema interferon» insieme di proteine diverse dal punto di vista strutturale e funzionale che agiscono dalla protezione alle infezioni virali/parassitiche alla regolazione della crescita e del differenziamento cellulare (appartengono alla famiglia delle citochine). Sistema legato alla produzione di proteine interferone che vengono rilasciate in seguito alla stimolazione della presenza di proteine estranee. Le proteine sono mediatori importanti per indurre la risposta antivirale perché attivano una serie di geni che ostacolano la replicazione del virus. Interferone alfa: si esprime in tutti i tipi di cellule o quasi. Interferone beta: si esprime anch'esso in modo ubiquitario. Poi, altri interferoni possono essere espressi solo in alcune cellule, per esempio: Interferone gamma: si esprime nelle cellule del sistema immunitario come i linfociti T e le cellule natural killer (NK). Interferone lambda: prodotto da diversi tipi di cellule, come quelle epiteliali. La accion antiviran no es especifica, pues forma parte de los mecanismos de inmunidad innata. Los interferones van a ser muy especificos entre la especies Caractteristiche Tutti gli IFN hanno in comune le seguenti caratteristiche: Sono proteine inducibili da stimoli virali e anche da altri stimoli Inducono uno stato di resistenza nelle cellule con cui vengono in contatto tramite la produzione di proteine effettrici La loro azione non è specifica per il virus che li ha indotti (sono parte della difesa innata) Sono specie-specifici, possono agire al massimo su cellule di specie tassonomicamente molto vicine a quella che li ha prodotti  Persistenza limitata, ma lo stato antivirale permane per 24-48 ore dopo la loro eliminazi. Esto es importante ya que interviene en el estado inicial de la infecio, en un estado crítico. Inoltre, sono importanti nella modulazione del sistema immunitario. Influenzano anche le proprietà proliferative delle cellule e hanno un'attività differenziante. I componenti virali sono riconosciuti dai recettori dell'immunità innata, come i TLR (recettori tipo Toll), localizzati in diverse aree delle cellule, come la membrana cellulare o gli endosomi. Una volta che i TLR riconoscono questi componenti, attivano vie di segnalazione che portano all'attivazione di fattori di trascrizione, i quali inducono la produzione di interferoni. Questi interferoni vengono rilasciati e agiscono sulle cellule vicine, promuovendo l'espressione di recettori specifici per gli interferoni, che variano a seconda del tipo di interferone. Ciò attiva chinasi e fattori di trascrizione che avviano una risposta antivirale, creando uno stato di resistenza cellulare generando proteine antivirali efficaci che interferiscono con la replicazione del virus. Per gli IFN-α/β l’attivazione è molto rapida e si completa in circa 30 minuti, il livello massimo di protezione si raggiunge in circa 3- 5 ore. L’attivazione da parte di IFN-  è più lenta e richiede ore anziché minuti. Tra le proteine effettrici troviamo: 2’-5’ oligoadenilato sintetasi. Degradazione dell’RNA e apoptosi Protein kinase R (PKR). Blocco della sintesi proteica e apoptosi Proteina MxA. Degradazione del virioni P56. Inattiva il fattore eIF-3 bloccando la traduzione ADAR-1. Adenosina deaminasi RNA specifica che converte l’adenina in inosina alterando la sequenza nucleotidica e la funzione dell’RNA  Indoleamina2,3-diossigenasi. Indotta prevalentemente da IFN-γ, trasforma il Trp in N- fenilchinurenina eliminandolo dal pool. Inibiscono la replicazione virale anche mediante: Blocco della maturazione e liberazione dei virioni (glicosil-transferasi) Alterazione della fluidità delle membrane E presentano un’azione pleiotropica mediante incremento dell’espressione di recettori di superfice: MHC-I (IFN-α/-β e - ) e MHC-II (IFN- ) Recettore Fc su linfociti e macrofagi Recettori per citochine (IL-2 e il TNF) Meccanismi di evasione dal sistema IFN I virus hanno evoluto diversi meccanismi di evasione basati sul blocco: o della sintesi di IFN. o del legame al recettore cellulare o del segnale di trasduzione o dell’induzione ed attivazione delle proteine effettrici Meccanismi di elusione di PKR Molti virus sono in grado di bloccare PKR a vari livelli: - Legame competitivo dei dsRNA (es. NSP3 di rotavirus e NS1 di Flu) - Produzione di dsRNA che bloccano il dominio chinasico di PKR (es. Va 1-2 di adeno, EBER di EBV) - Sequestro di PKR (es. NS5A di HCV e Us11 di HSV) - Competizione con il legame a eIF-2 (es. TAT di HIV) - Defosforilazione di eIF-2 (es. 134.5 di HSV, E6 di HPV) - Degradazione di PKR via proteasi (es. poliovirus) Applicazioni terapeutiche degli IFN Tecniche di ingegneria genetica hanno consentito la produzione in quantità di interferoni ricombinati (alfa e beta in particolare). IFN-α: impiegato nel trattamento di epatiti croniche (HBV e HCV). Gli interferoni sono usati anche in terapia oncologica e per la sclerosi multipla LEZIONE 19: ADENOVIRUS 1. SCOPERTE Virus che infettano svariate specie e tessuti 1953 scoperti da Rowe e Hilleman che isolarono il virus da reclute con sindrome respiratoria acuta. 1962 Trentin scopre che sono oncogeni nel criceto (hamsters). Scoprì che alcuni virus potevano introdurre oncogeni in queste cellule, rendendole cancerose. Questa scoperta fu fondamentale per comprendere la relazione tra alcuni virus (chiamati virus oncogeni o retrovirus) e lo sviluppo del cancro. 1975 Roberts e Sharp hanno scoperto che gli mRNA degli adenovirus presentavano dellezioni rispetto alla sequenza di DNA del gene. Questo significava che alcune parti del DNA non venivano tradotte nella sequenza finale dell'mRNA, portandoli a concludere che le sequenze dell'mRNA non corrispondevano in modo continuo al DNA genomico. Questa scoperta delle delezioni ha portato alla scoperta che l'mRNA subisce un processo di splicing, in cui le sequenze non codificanti del DNA (chiamate introni) vengono rimosse dall'RNA primario e le sequenze codificanti (chiamate esoni) vengono uniti per formare un mRNA maturo che sarà tradotto in proteina. (Nobel 1993). 2. CLASSIFICAZIONE ADENOVIRUS UMANI Famiglia: Adenoviridae comprende 5 generi: 1) Aviadenovirus (aviario) 2) Mastadenovirus (mammiferi - uomo) 3) Atadenovirus (sia mammiferi sia aviari) 4) Siadenovirus (della rana e aviari) 5) Icthadenovirus (dei pesci) Famiglia: Adenoviridae, genere Mastadenovirus Gli adenovirus sono classificati in 7 specie (A-G), in passato dette «gruppi», in base alla omologia del DNA genomico (distanza filogenetica > 10%). Nelle specie sono compresi i sierotipi (55) sulla base della neutralizzabilità con antisieri specifici, oggi definiti su basi genetiche e detti anche tipi (genotipi) in base alle differenze genetiche nella regione della «fibra» 56-84 sono ricombinanti 3. STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS Virus senza envelope Capside a simmetria icosaedrica Diametro di 70-100 nm Genoma: dsDNA lineare Capside: o 252 capsomeri (240 esoni, 12 pentoni) o La fibra media (pentone) il contatto con il recettore cellulare o Proteine minori del capside (III, VI, VIII, IX) Core: o V, VII, Mu, IVa2, TP associate al DNA virale Proteasi importante per l’assemblaggio Struttura dell'adenovirus: È composto da capsidi proteici, che includono esoni, pentoni e fibre. Sono presenti anche proteine minori e proteine del nucleo. Fibre (trimeri della proteina IV): Sono fondamentali per il riconoscimento dei recettori cellulari, permettendo così l'ingresso del virus nelle cellule permissive (come quelle con CAR e integrine). Inoltre, queste fibre sono responsabili dell’emoagglutinazione. Meccanismo di interazione: FIBRE (trimeri proteina IV): mediano il riconoscimento dei, recettori sulla superficie delle cellule permissive (CAR, integrine); sono responsabili dell’emoagglutinazione Questo legame facilita l'adesione del virus e la sua successiva internalizzazione nella cellula. Recettori degli adenovirus AdV A (12, 18, 31) - CAR (membro della famiglia delle Ig), RDG delle integrine AdV B B1 (3, 7, 16, 21, 50) - CD46, CD80, CD86 B2 (11, 14, 34, 35) AdV C - CAR AdV D - Acido sialico 4. CICLO VITALE DEGLI ADENOVIRUS - Avviene soltanto nel nucleo delle cellule permissive (cellule di origine epiteliale), il ciclo ha una durata di circa 24 ore (ciclo litico). - Un unico ciclo di replicazione è in grado di sintetizzare almeno 10.000 virioni per cellula infettata; CAR è una proteina di adesione che è espressa ad alti livelli: fegato, rene, cuore, cervello, pancreas, colon, prostata, endotelio ma non in linfociti periferici, milza, muscolo scheletrico e fibroblasti - Adenovirus B riconoscono un recettore diverso dal CAR (CD46, un recettore per il complemento). - Adenovirus C di tipo 5 riconosce come recettore anche il dominio α2 del MHC di tipo I - Un dominio RGD esposto in un loop dei pentoni promuove l’interazione con le integrine promuovendo l’endocitosi - Il colesterolo gioca un ruolo nell’uptake virale e fuoriuscita dall’endosoma. 1. Legame alla cellula ospite (Binding) L'adenovirus si lega alla superficie cellulare attraverso l'interazione tra le proteine del capside e il recettore CAR (Coxsackie and Adenovirus Receptor) presente sulla membrana cellulare. Questo legame iniziale è fondamentale per l'ancoraggio del virus alla cellula. 2. Interazione con le integrine e spostamento (Drifting)  Dopo essersi legato al CAR, il virus interagisce con le integrine, proteine della membrana cellulare che facilitano l'adesione e la segnalazione cellulare. Questa interazione innesca cambiamenti nella membrana e nel citoscheletro cellulare (coinvolgendo actina e miosina-2), permettendo lo spostamento del virus sulla superficie della cellula. 3. Esposizione delle proteine di fusione e danno alla membrana (Shedding) Durante questo processo, alcune fibre del virus si rompono, esponendo proteine di fusione. Queste proteine inducono danni alla membrana cellulare, attivando meccanismi di riparazione e favorendo l'internalizzazione del virus. 4. Endocitosi mediata dalla clatrina L’interazione con le integrine attiva anche l’endocitosi mediata dalla clatrina, un processo in cui il virus viene inglobato in una vescicola rivestita di clatrina. Questa vescicola viene internalizzata nella cellula e successivamente perde il suo rivestimento, consentendo al virus di fuoriuscire nel citoplasma e proseguire il suo ciclo infettivo. Questo meccanismo garantisce che l’adenovirus possa entrare efficacemente nella cellula e rilasciare il suo materiale genetico per iniziare la replicazione. Se replica por via linfoide?¿? Pueden dr infecciones subclinicas: no importantes desde un ptop de vista clinico, esto favorece la propagacion La infezione primaria avviene nell’infazie Alcuni tipi sono piu frecuente en el tejido adenoide o tonsille Isolato dalle feci 5. GENOMA e REPLICAZIONE DEGLI ADENOVIRUS Il genoma è costituito da una molecola di DNA lineare a doppia elica di 30-40 kb, a seconda del gruppo preso in analisi. Alle estremità sono presenti le sequenze ITRs, inverted terminal repeats, che fungono da origini di replicazione e da promotori per alcuni geni. Vicino alla ITRs in 5’ vi è la sequenza segnale (sequenza Ψ) per l’inserimento del genoma all’interno del virione. (Ψ sito di incapsidazione) I geni vengono espressi con una precisa sequenza temporale (immediate-early, early, late genes) dalla RNA pol II cellulare. o I geni immediate-early sono E1A e E1B e servono ad innescare la replicazione nella cellula ospite. o I geni early servono per la replicazione del genoma virale o I geni late sono geni strutturali. La trascrizione bidirezionale mediata da RNA pol-II, si ottengono diversi mRNA grazie all’uso di diversi siti poli-A e per splicing alternativo. Gli RNA VA sono espressi dalla RNA pol III.  REPLICAZIONE DEGLI ADENOVIRUS 1. Inizio della Replicazione: La DNA polimerasi dell'adenovirus (Ad-Pol) si lega alla proteina terminale (pTP), che agisce da primer per la sintesi del DNA. Ad-Pol catalizza l'addizione covalente di un nucleotide di deossicitidil monofosfato (dCMP) alla serina 580 della pTP, formando il complesso pTP-dCMP (pTP-dC). Questo passaggio è cruciale perché fornisce un'estremità 3' libera per l'allungamento della catena di DNA. 2. Allungamento e Separazione: Una volta avviato il processo, Ad-Pol si dissocia dalla pTP, permettendo la continuazione della sintesi del DNA. Viral replication compartments (VRCs) I VRC rappresentano una strategia replicativa di molti virus a DNA che replicano nel nucleo cellulare Si ritiene che rappresentino dei siti in cui si concentrano fattori virali e cellulari necessari per una efficiente replicazione virale. Si formano in prossimità dei corpi nucleari (nuclear bodies), strutture di regolazione della riparazione del DNA, della trascrizione, etc Più VRC si formano durante l’infezione da AdV in maniera MOI dipendente fino ad un massimo (saturazione). 1VRC = 1 genoma  Assemblaggio degli adenovirus La maturazione proteolitica durante l'assemblaggio della progenie dell'adenovirus aumenta la pressione interna e, contemporaneamente, la rigidità del capside. La pressione aiuta la liberazione del DNA dopo l’ingresso. Verde: early genes Naranja: Late genes Early genes Regione E1: (orientamiento →) - Indurre la cellula ospite ad entrare nella fase S del ciclo cellulare - Sintetizzare i prodotti dei geni virali necessari per la replicazione del DNA virale - Down regola l’espressione dell’MHC I (effetto immuno regolatore) Regione E2: (orientamiento ) Orientamento suddivisa in 2 regioni trascrizionali separate: E2A ed E2B. La regione E2A codifica una proteina da 70 kDa che lega ssDNA (DBP), altamente fosforilata nella regione N-terminale e richiesta per la replicazione del DNA: probabilmente funziona come→ fattore di regolazione della trascrizione. La regione E2B codifica un precursore della proteina TP (76.5 kDa) che viene convertita in una proteina di 37 kDa durante l’assemblaggio virale. Questa regione codifica anche una → DNA polimerasi di 240kDa. Regione E3 (orientamiento →) (“cell death protein”) - codifica prodotti genici antiapoptotici e inibisce l’espressione di MHC - facilita il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate, - riduce la produzione di linfociti T citotossici Regione E4 (orientamento  ) - modula il metabolismo dell’ospite! - modula l’attività di trascrizione del virus - inibisce la sintesi proteica dell’ospite. Late genes Proteine tardive = componenti strutturali del virione - I geni tardivi sono trascritti a partire da un major late promoter (MLP) - A partire da un trascritto primario di 29.000 nucleotidi, circa 13 specie di mRNA sono prodotte in seguito a splicing alternativi, tali mRNA sono stati raggruppati in 5 famiglie classificate da L1 a L5 che hanno porzioni 5’ variabili. - Altri RNA (VA) vengono generati dalla polimerasi III e si possono attribuire diverse funzioni a questi RNA: o regolazione degli splicing degli mRNA tardivi o controllo degli stadi della migrazione dei peptidi tardivi o inibizione degli effetti dell’INF mediante blocco del legame dei dsRNA alle proteine chinasi cell. 6. PATOGENESI Il virus infetta principalmente le cellule mucoepiteliali del sito di ingresso ovvero della congiuntiva, del tratto respiratorio, gastrointestinale e genitourinario. Replicazione del DNA genomico intranucleare. Fasi di replicazione precoci e tardive a cui segue l’assemblaggio e il rilascio dei virioni. Danno diretto a cellule mucoepiteliali (tratto respiratorio, gastrointestinale, congiuntiva)  Tipologie di infezione 1. Litica: Cellule mucoepiteliali, porta alla morte cellulare. Produzione di 1x104 -1x106 virioni/cellula 1-5% dei virioni sono infettivi 2. Latente / persistente / occulta: Il virus permane in: tonsille, adenoidi, placche di Peyers. Scarsa produzione virale 3. Trasformazione oncogenica: Crescita cellulare e replicazione senza morte cellulare. Integrazione del DNA - Espressione costitutiva di geni E1A-E1B (importanti per immortalizzazione cellulare; inattivazione p53, Rb) - Ristretta ai criceti, virus del gruppo A. Potenziale oncogeno: 7. TRASMISSIONE Aerosol Contatto diretto Oro-fecale Eliminazione intermittente Diffusione interumana Aree affollate Diffusione mondiale 8. INFEZIONE Adenovirus replica nei tessuti linfoide-associati, la viremia può causare infezione secondaria in organi viscerali. La replicazione del virus causa un eccesso di componenti antigeniche liberate come antigeni solubili. Colorazione basofila intra-nucleare corpi inclusi nelle cellule. → Immunità: La immunità umorale blocca le particelle virali, neutralizzando il virus in circolazione, mentre l'immunità cellulare è cruciale per eliminare le cellule infette, impedendo che il virus si replichi e si diffonda nell'organismo. 9. SINTOMI Infezioni subcliniche** nella maggior parte dei casi Infezione primaria avviene nell’infanzia Tipi 1,2,5,6 tipicamente isolati dal tessuto adenoide o tonsille dei bambini Isolato dalle feci 5% malattie neonato, 3% tra i 2-4 anni di vita Frequente nelle caserme (cuarteles) Infección subclínica se refiere a una infección en la que el patógeno está presente y puede estar causando cambios en el cuerpo (por ejemplo, alteraciones a nivel celular o en la respuesta inmune), pero no se presentan síntomas detectables o suficientes como para hacer un diagnóstico clínico. A veces, incluso se pueden detectar cambios leves mediante pruebas de laboratorio, aunque el paciente no sienta nada. Infección asintomática implica que la persona está infectada, pero no presenta síntomas en absoluto. Es decir, no hay ningún signo observable de enfermedad, ni leves ni graves. A veces puede causar pulmonitis (infecciones profundas), estos sintomas se pueden confundir con otros virus: Patologia oculare: cherato congiuntivi Patologie renali e genito-urinarie. Patologia intestinale Più rare nell’individuo inmmunocompetente: meningiti, encefaloiti, rash cutaneo… 10. DIAGNOSI Basati sulla ricerca del virus Metodi molecolari Isolamento colturaleIn campioni di sangue (nalla fase viremica troviamo il virus nel sangue), secrezioni, tamponi nasali, tamponi oculari, feci, urine, liquor…. 11. USO DEGLI ADENOVIRUS Vectori per vacino: covid Vectori per cancer terapi: portare geni nell interno delle cellule tumorale Vectori per terapia genica LEZIONE 20: PARVOVIRUS 1. INTRODUZIONE I parvovirus infettano diverse specie animali di tutte le famiglie, ma solo uno può infettare l'uomo. In particolare, quelli di maggiore interesse sono, quelle con una freccia: Bocaparvovirus (assoziato a infezione respiratorie, non si sa come di importante è en la infezione) Possono essere suddivisi in due gruppi fondamentali: Virus autonomi, competenti per la replicazione. Causa malattia nei bambini. Virus difettivi, dipendono da un virus helper per la replicazione (es. AAV2). Necessitano della co-infezione con un altro virus, solitamente un adenovirus, per replicarsi. Sono anche chiamati virus adeno-associati. Tra i Parvovirus che infettano l’uomo: B19 è quello clinicamente rilevante (eritema infettivo - V malattia e altre sindromi), gli adenoassociati sono apatogeni mentre il ruolo del Bocavirus è ancora da definire chiaramente. Gli altri parvovirus umani sono poco diffusi e poco conosciuti. 2. STRUTTURA Formati da particelle icosaedriche, senza envelope. Il dominio della proteina del capside di alcuni virus ha omologia con la fosfolipasi A2, e questo dominio facilita il rilascio del DNA virale all'interno del citoplasma, il che è cruciale per la replicazione virale. E costituiti soltanto da proteine (50%), e DNA a singola elica (50%) 3 proteine di rivestimento (capside): VP1, VP2 (e VP3)1 o 2 proteine non struttural (roulo nella infezione, replicazione del virus)i: NS1, NS2.  3. VIRUS B19→ autonomi 3.1 CARATTERISTICHE Virus piccoli 18-26 nm (parvus) Virus senza envelope a simmetria icosaedrica o Estremamente resistente inattivazione o Stabile in solventi organici 90% del capside è costituito da VP2 (58kDa), è importante per la interazione con le cellule del ospite, poche molecole di VP1(84kDa). VP1 e VP2 Si assemblano in una struttura tridimensionale specifica per formare una capside virale completa e funzionale, il che è essenziale per l'infettività del virus → conformazione matura. VP1 e VP2 hanno proprietà antigeniche. Genome→ 3.2 REPLICAZIONE Anche se questo virus è autonomo, è fortemente influenzato dalla cellula bersaglio; infatti, la replicazione richiede che il virus si trovi in cellule in grado di replicarsi. (Se le cellule vengono bloccate, il virus non potrà replicarsi). Ha un target molto specifico: → Replica esclusivamente nelle cellule eritroidi. La suscettibilità alla replicazione del virus aumenta con la differenziazione → è massima nei progenitori eritroidi e negli eritroblasti (che sono le fasi finali proprio prima della formazione del globulo rosso). Induzione di effetti citopatici L’uomo è l’unico ospite → Recettore: Il virus B19 utilizza il globoside (un antigene sui globuli rossi, noto come antigene eritrocitario P) come recettore principale per l'infezione. Inoltre, le integrine agiscono come co- recettori, facilitando il processo. Il virus si lega alla parte glicidica di questi recettori sulla superficie cellulare per iniziare l'infezione. Tuttavia, le persone che sono geneticamente carenti di globoside sono resistenti a questo virus, poiché non possono essere infettate da esso. Importante la diapo 10 1. Ingresso del DNA parentale a filamento singolo nella cellula ospite: il genoma virale, formato da un singolo filamento di DNA (DNA a filamento singolo), entra nel nucleo della cellula ospite. 2. Conversione in DNA a doppio filamento: mediante la DNA polimerasi della cellula ospite, il DNA virale a filamento singolo viene convertito in una forma replicativa a doppio filamento, necessaria per la trascrizione e la replicazione. 3. Trascrizione e sintesi dell'RNA messaggero: l'RNA polimerasi della cellula ospite trascrive il DNA virale a doppio filamento e genera RNAm per produrre prima le proteine non strutturali, essenziali per la replicazione e dopo le proteine strutturali, che verranno utilizzate per assemblare nuove particelle virali. 4. Assemblaggio del virione: il DNA a filamento singolo della progenie e le proteine strutturali si assemblano per formare nuove particelle virali mature. Oltre alle cellule precursori dei globuli rossi (Progenitori eritroidi, Megacariociti, Eritroblasti), ci sono altre cellule che possono essere infettate perché hanno lo stesso recettore: le cellule endoteliali. Forma un DNA a doppio filamento che viene utilizzato per esprimere l'RNA. Con l'apparizione delle proteine non strutturali, viene anche indotta l'espressione del DNA per creare il filamento monocatenario, che viene liberato con l'effetto citopatico. Cellule permissive (progenitori eritroidi): Cellule non permissive: Il genoma virale viene trascritto, generando Il virus entra nella cellula, ma esprime solo RNA messaggero. geni non strutturali, che vengono prodotti in grande quantità. L'accumulo di proteine non Dopo il processo di splicing vengono prodotte strutturali ha un effetto tossico sulla cellula e proteine strutturali e non strutturali. induce la morte cellulare. Ma non si verificano Ciò consente la replicazione virale e la un'efficace replicazione del virus e virioni formazione di nuove particelle virali. funzionali. 3.3 EPIDEMIOLOGIA - Distribuzione mondiale, è più frequente fine inverno, primavera, inizio estate - Aumento infezione ogni 3-4 anni, andamento ciclici che hanno un pico di frecuenza___ questo - Diffusione dalle scuole elementari (fino a 40% di infetti) - 90% popolazione età avanzata anticorpi positiva (Ab +), perche è un virus ubiquitario - Importante per i bambini 3.4 TRANSMISIONE Trasmissione via respiratoria: o Virus presente nelle secrezioni respiratorie (nasofaringe) o Stretto contatto Sangue e prodotti del sangue o Difficilmente inattivabile o Viremia alta (1012particelle/ml) Trasmissione transplacentare: gravita 3.5 PATOGENESI l'efficacia del trattamento applicato non è molto elevata Il virus infetta e lisa i precursori delle cellule eritroidi. La malattia causata da B19 è dovuta alla lisi virusmediata di queste cellule e alla conseguente risposta immunitaria. Il virus diffonde attraverso secrezioni orali e respiratorie, poi diffonde tramite viremia al midollo osseo ed altri siti (può attraversare la placenta) dove si replica. Il tipo di malattia dipende dalla replicazione virale e dalla risposta immunitaria. - Individui normali: cessazione, acuta e limitata (4-8 gg), della produzione di eritrociti. Il prioblemi è che con certi soggetti ci sono problemi di infezione - Individui con aumentato turnover eritroide (emolisi, emorragie, altre cause):Il virus infetta le cellule staminali dei globuli rossi nel midollo osseo, interrompendo la produzione di globuli rossi cessazione dell’eritropoiesi determina crisi aplastica che può durare da pochi giorni a diverse settimane e può essere grave se non trattata adeguatamente. L’anemia migliora con l’instaurarsi della risposta immunitaria - Individui immunocompromessi: possibile persistenza dell’infezione, PRCA (Pure Red Cell Aplasia) o eritroblastopenia cronica Il trattamento non si applica contro il virus ma mira a ristabilire i normali livelli di immunità. 3.6 DIAGNOSI Difficilmente coltivabile PCR o ibridazione (DNA virale) Ricerca antigeni virali (RIA, ELISA) Sierologia o IgM (saggi RIA o ELISA) Permanenza virus nel siero fino a 4 mesi dopo l’infezione! Permanenza virus nel midollo osseo, tessuto sinoviale, fegato anche per anni! 4. VIRUS ADENO ASSOCITI (AVV) Virus difettivi che per replicare dipendono da un virus helper(adenovirus o herpesvirus). In assenza di helper stabiliscono una infezione latente con integrazione preferenziale nel cromosoma 19. Se un AAV infetta una persona che è già infetta da un altro virus (come l'adenovirus), l'AAV può replicarsi, ma generalmente non induce sintomi patologici. In seguito ad infezione con virus helper, il DNA di AAV si escinde dal cromosoma e avvia il processo replicativo. Esistono 13 sierotipi umani ed oltre 100 in primati non umani, sono facilmente propagabili in coltura cellulare Sono considerati APATOGENI per l’uomo. La non patogenicità, la persistenza del virus e l’esistenza di molti sierotipi li hanno resi un interessante modello per lo sviluppo di vettori nella terapia genica. LEZIONE 21: POLIOMAVIRUS Famiglia: polyomaviridae L’attuale classificazione prevede 4 generi e 80 specie Generi: - Alphapolyomavirus - Betapolyomavirus - Gammapolyomavirus - Deltapolyomavirus Essitono diversi genere e nell oumo sono stati incontrati diversi tipi di poliomavirus poliomavirus umani (BK, JC, SV40, e recenti KI, WU, MCV, TSpyV et al.) Il suo ruolo nella patogenesi non è ben noto. 1. STRUCTURA 45-50 m di diametro Capside icosaedrico - 72 capsomeri (VP1, VP2 e VP3) e privi di envelope (Sin envoltura) Resistono ad etere, formalina, acido e calore (50°C) dsDNA circolare, associato a istoni cellulari, che codifica proteine precoci e tardive. Queste virus è stato utilizzato per studiare la posizione degli istoni. Replicano nel nucleo della cellula, esspresione genica regulata. Spesso tropismo d’ospite ristretto Infezioni asintomatiche o lievi, persistono in forma latente Rappresentazione grafica al computer del capside icosaedrico di SV40→ 2. GENOMA E REPLICAZIONE Una regione genica non codificante che contiene sequenze promotrici che servono per l'espressione dei geni virali e anche per i geni regolatori. Bloccho di sinistra: Regiones tardiva, codifica proteine strutturali Bloccho di destra: Regione precoce, che e codifica proteine necessarie alla replicazione 6 geni in 5 kbp (utilizzo di entrambi i filamenti e geni overlappanti) La regione precoce è su un filamento, la tardiva sull’altro VP1: Importante nella replicazione del virus Queste sono il antigene t grande e il t piccolo (t pq tumolari, se vio que estaba en cls tumorales), possono avaere un t intermedio Ciclo replicativo 1. Interazione con acido sialico mediata da VP1 2. Endocitosi e trasporto al RE tramite i microtubuli 3. Ingresso nel RE e prima fase spogliazione virale (disassemblaggio VP1) 4. Trasferimento al nucleo del DNA virale 5. Avvio trascrizione geni precoci 6. Replicazione del DNA 7. Avvio trascrizione geni tardivi 8. Rilascio del virus tramite lisi oppure tramite esocitosi Il poliomavirus ha un pathway di ingresso interessante perché attraverso il sistema vescicolare entra nel reticolo endoplasmatico e, con un movimento retrogrado, si avvicina al nucleo, dove viene rilasciato il DNA virale che può essere espresso. La replicazione del DNA è un evento successivo all'espressione dei geni precoci, con la formazione della progenie virale. Il poliomavirus utilizza la macchina cellulare per la sintesi di nuove particelle virali, che successivamente escono dalla cellula infetta per infettare altre cellule. Perche il geni precoce sono importante per la replicazione del DNA: L'antigene T grande (LT) è il più importante, perché nel virus c'è un'origine di replicazione che presenta un sito dove il legame con l'antigene T grande può avvenire. In questo sito si lega un altro antigene T grande, e questi due subiscono delle modificazioni. In seguito, iniziano a separarsi, a gendo come elicasi consentendo l'accesso delle polimerasi al DNA e avviando la replicazione. Inoltre, questi antigeni T grandi influenzano anche l'attività trascrizionale. 3. BKV, JCV Epidemiologia BKV sianno trovate nelle urine (tb nel sangue ma nella urine e più facile trovarle) o nell tessuto cerebrale, questo solo per JCV nei soggetti con deficit immunitaria. Virus ubiquitari nella popolazione umana: Sieroprevalenza JCV o 50% della popolazione adulta normale o 70-85% [pazienti con leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML)] La maggior parte delle persone che sviluppano la PML sono state precedentemente esposte al virus e hanno anticorpi contro di esso, il che indica un'infezione latente, ma la presenza di anticorpi non  garantisce lo sviluppo della PML; questo dipende da fattori come lo stato immunologico dell'individuo e la riattivazione del virus nel cervello. Sieroprevalenza BKV o 90% della popolazione adulta L’infezione primaria (di solito asintomatica) si contrae nella prima infanzia (si instaurano infezioni latenti e/o persistenti nel rene) I virus sono stati individuati in linfociti, rene, cervello e CSF (JCV), cuore, milza, polmoni, fegato Sono virus che possono causare infezione latente o persistente en particulari a livello del DNA. Ha una diffusione generale ma il DNA un sito pui sensible. Trasmissione Sempre la stessa Via respiratoria Oro-fecale Transplacentare Sangue Trapianti: Lo troviamo spesso in altri tipi di organi, per questo è uno dei virus che possono essere trasmessi tramite trapianto. Questo è un problema, poiché il trapianto viene effettuato insieme a un trattamento di immunosoppressione, per cui l'infezione causata dal virus sarà molto più grave rispetto ad altre situazioni. Sono virus che causano infezioni diffuse che, nel momento in cui c'è immunosoppressione, agiscono. Tropismo cellulare (BKV e JCV) Tropismo: capacità di infettare cellule specifiche a seconda di fattori come i recettori e la regolazione genetica BKV e JCV si legano ai recettori cellulare per entrare nelle cellule e avviare l’infezione: o BKV utilizza glicoproteine O-linked come recettori. o JCV utilizza glicoproteine N-linked. → Questo determina quali cellule possono essere infettate da ciascun virus, contribuendo al loro tropismo cellular - La regione promotore-enhancer del genoma virale varia tra ceppi, influenzando l'efficienza della replicazione e della trascrizione virale in diversi tipi cellulari. Regione regolatrice promotore-enhancers (variazioni tra ceppi) L'effetto sugli organi può variare a seconda dei polimorfismi nella sequenza regolatrice del genoma virale. Questi polimorfismi possono influenzare la capacità del virus di replicarsi, l'efficienza della trascrizione dei suoi geni e, di conseguenza, la gravità dell'infezione, soprattutto nei tessuti specifici. Il ciclo replicativo è strettamente legato alle caratteristiche della cellula infettata. Nelle cellule non permissive, il ciclo virale non si completa; vengono espressi solo geni precoci, il che può portare a trasformazione cellulare (possibile inizio di processi tumorali). Questo è così perchè Il virus, nel proposito di replicarsi parzialmente, altera il comportamento cellulare. Questo può favorire l'oncogenesi, come nel caso di alcune infezioni virali che promuovono lo sviluppo del cancro. Tuttavia, nelle cellule permissive, il ciclo virale si completa e non si verificano questi effetti trasformanti. Essempios delle cellule no permissive: celulle non epiteliali, alcuni linfociti, celulluna senza recettori che il virus riconosce. Antigene T (trasformazione) Gli antigeni T hanno un'alta omologia di sequenza e hanno una lungeza di 19kD. Questi antigeni T si trovano prevalentemente nel nucleo (95%). Questa localizzazione nucleare si ha visto che potenzia la sua attività. È associato al DNA cellulare, in membrana. Le modificazioni post-traduzionali modulano l'attività dell'antigene T. (fosforilazione, acilazione, glicosilazione, adenilazione, etc.) L'antigene T, legandosi alla PP2A e bloccando la sua attività, impedisce alla PP2A di regolare adeguatamente l'attività delle Cdk. Questo fa sì che le Cdk rimangano attive più a lungo, accelerando così il ciclo cellulare. Agnoprotein: necessaria per ‘ássamblaggio (trasporta VP1 al nucleo) Mecanismo di diffusione Due antigeni T (il grande antigene T e il piccolo antigene T) possono avere un ruolo importante nel fenomeno di trasformazione cellulare, per essempio con l'inattivazione di proteine soppressori tumorali (come p53 e pRb), il che può portare alla trasformazione cellulare in certe condizioni. 1. Prima fase di replicazione: Il virus si replica e produce progenie. Durante questa fase, il virus entra in circolazione (viremia primaria), si diffonde attraverso il sangue e raggiunge il rene. Nel frattempo, si sviluppa una risposta immunitaria, che può limitare la replicazione virale. In un ospite immunocompetente, il virus entra in uno stato di latenza, localizzandosi principalmente nei linfociti o nelle cellule renali. Rimane con il suo DNA in forma episomale, non integrato nel genoma dell'ospite. 2. Riattivazione: In caso di immunosoppressione (deficit immunitario), il virus può riattivarsi. Per il virus BK, il principale sito di replicazione attiva è il rene. La presenza del virus nelle urine (viruria) è un importante marcatore di riattivazione. Questo può causare danni nel sistema urinario, come nefropatia e stenosi uretrale nei trapianti renali, o cistite emorragica nei trapianti di midollo osseo. Per il virus JC, la riattivazione può portare a una viremia che si diffonde al sistema nervoso centrale (SNC). Questa è la condizione più pericolosa, poiché può causare PML (leucoencefalopatia multifocale progressiva), una malattia neurodegenerativa grave, Leucoencefalopatia miltifocale progrsseiva (PML) - Malattia subacuta demielinizzante. Aspettative di vita: qualche mese – 1anno (non ci sono terapie) - Può svilupparsi a qualunque età - Sintomi neurologici che vanno dalla compromissione della parola, vista, coordinazione… - Per questi motivi il virus deve essere attentamente monitorato in situazioni di trapianto. Diagnosi JCV (PML): Clinica, Ibridazione in situ real-time PCR (biopsie, CSF, midollo spinale, sangue, urine) BKV: real-time PCR (sangue, urine, CSF) Ricerca anticorpi (boost da riattivazione) Terapia Attualmente non ci sono farmaci specifici autorizzati per trattare l’infezione La riduzione della immunosoppressione può funzionare solo per alcuni pazienti o non essere sufficiente (importante monitorare le risposte immuni anti-BKV umorali e cellulari) → La presenza del virus nelle urine può fornire informazioni importanti, perchè può essere un segno di infezione attiva o reattivazione del virus, in particolare in persone con sistema immunitario compromesso. 4. SV40 (simian virus) e tumori umani Il virus SV40 è stato un importante modello di studio per la ricerca virale, ma anche dal punto di vista sanitario, poiché può indurre tumori nei topi in modo molto efficace. Con il primo vaccino contro la polio, queste vaccinazioni venivano prodotte utilizzando cellule Vero (di scimmia). Tuttavia, il problema era che queste cellule erano contaminate dal SV40, il che ha portato alla somministrazione di vaccini contaminati a molte persone. Questo ha sollevato preoccupazioni, poiché si è ipotizzato che il SV40 possa essere associato all'insorgenza di tumori umani. Perché succede questo? Quando il virus infetta i roditori, si osservano infezioni apoptotiche. Le cellule non permissive per l'infezione non permettono la replicazione virale, ma il virus può comunque integrarsi nel DNA nucleare delle cellule. Questo è considerato uno dei meccanismi attraverso cui il virus può trasformare le cellule in cellule tumorali. Nei roditori, si è visto che l'integrazione del virus nel DNA può portare alla trasformazione tumorale. Nell'uomo: In generale, solo una piccola percentuale di cellule subisce una trasformazione tumorale a causa dell'infezione da SV40. Tuttavia, il problema è che non si è ancora riusciti a stabilire una connessione diretta tra l'inoculazione di vaccini contaminati da SV40 e l'insorgenza di tumori negli esseri umani. Non si sa se, alla fine, questi vaccini abbiano effettivamente influenzato l'insorgenza di tumori. Ruolo oncogenico dei poliomavirus Le evidenze sperimentali e molecolari suggeriscono che i poliomavirus, tra cui BK, JC e SV40, possano agire come sono considerati possibili cofattori all'insorgenza di tumori umani, non sono considerati come cause primarie. WHO in base alle evidenze precliniche e cliniche indica BK e JC come «possible carcinogenic to humans» (Group 2)Bouvard et al, Lancet Oncol 2012 5. MERKEL CELL POLYOMAVIRUS (MCV OR MCPYV) Il virus delle cellule di Merkel è un poliomavirus che infetta le cellule di Merkel, che sono cellule sensoriali specializzate nella pelle, responsabili della percezione del tatto. Questo virus, conosciuto come Merkel Cell Polyomavirus (MCV), è stato associato alla formazione di tumori cutanei noti come carcinoma delle cellule di Merkel (MCC), un tipo di cancro raro e aggressivo della pelle. Il MCV agisce come un cofattore oncogenico, il che significa che non causa da solo il cancro, ma contribuisce alla trasformazione maligna delle cellule quando si verifica una combinazione di fattori predisponenti, come una debole risposta immunitaria (persone immunocompromesse) o l'esposizione ai raggi ultravioletti. LEZIONE 22: HUMAN PAPILLOMAVIRUS (HPV) 1. CARATTERISTICHE - Famiglia: Papillomaviridae - Genere: Papillomavirus NO envelope Hanno piccoli dimensioni Capsula icosaedrica: Capside costituito da 72 capsomeri composti dalle proteine L1 (55 kDa) e L2 (70 kDa) DNA circulare y di doppia elice Simile ai poliomavirus dal punto di vista strutturale- 189 tipi classificati in 30 gruppi. I generi alfa e beta includono quelli importanti per l’uomo. Hanno un tropismo specifico per specie, non sono virus che colpiscono un ampio spettro, ma sono virus molto specializzati. Virus epiteliotropo, specie-specifico. Può essere distinto in: cutaneo mucosale sulla base della suscettibilità tissutale 2. GENOMA Ci sono due ORF, uno che presenta geni che iniziano con la lettera E (earlier) e l'altro con la L (later). I primi sono i precoci (earlier), che esprimono informazioni relative ai geni virali e all'interazione con l'ospite. Loro stimolano la crescita delle cellule e facilitano la replicazione del genoma virale, utilizzando la DNA polimerasi della cellula ospite quando le cellule si dividono. I tardivi (later) codificano proteine strutturali e sono espressi solo nello strato superiore dell’epitelio che si differenzia (il virus è diffuso con lo sfaldamento delle cellule dello strato superiore). L'espressione dei geni virali è correlata all'espressione di specifiche cheratine, che varia con il distacco delle cellule dello strato superiore. Geni virale tardibi: proteinas estructurales para formar la progenisis del virus. los genes tardios se comportan asi pq veremos que su expresion es regulada pro el estado diferenciativo de la celula en particular se regulan por los mismos factores ranscripcionales que para la sintesis de queratinas?¿?¿. I tardivi (later) partecipano alla patogenicità (credo). De todos lo virus vistos hay algunos que afectan a os animales (tropismo para tejido analio en animales) PROTEINE PRECOCI (non strutturali) Proteina maggiore E1: Coinvolta nella replicazione del DNA e nel mantenimento dell’episoma. Proteina regolatrice E2: E2 è un soppressore di E6 e E7. Questa proprietà viene persa quando il genoma virale si integra nel genoma dell’ospite. Questo dà via libera all’espressione di E6 e E7 che agiscono sui geni oncosoppressori bersaglio, p53 e pRb *Quando il DNA del virus si integra nel DNA dell'ospite, la sequenza che codifica per il gene E2 può essere rotta o separata. Questo fa sì che la proteina E2 non venga più prodotta correttamente, questo favorisce l'espressione incontrollata dei geni E6 ed E7, che sono cruciali per la trasformazione cellulare e lo sviluppo del cancro, poiché E6 ed E7 inattivano proteine soppressori di tumori come p53 e RB. E6 y e7 van a alterare ilcontrollo del coclio cellulare, Proteina E4: Se considera earl pero tarda un poco mas q las otras (espressa nelle fasi tardive dell’infezione durante l’assemblaggio del virione.) Favorisce la interazione sttruturale con la celula, Nei cheratinociti umani sembra intaccare (afectar) l’integrità del citoscheletro cellulare (coilocitosi) favorendo la fuoriuscita delle particelle virali neoformate. Proteina E5: si inserisce nella membrana della cellula infetta (proteina 16K), alterando l’attività delle proteine di membrana coinvolte nei segnali di proliferazione cellulare (EGF, PDGF2). Rende le cellule resistenti all’apoptosi. Favorisce la formazione dei condilomi. Es la primera proteína q inicia la proliferación y depende de a celula huesped. Proteine E6 y E7 Giocano un ruolo importante poiché interagiscono con molte proteine cellulari, partecipano all'oncogenesi e interagiscono con p53 e IRF-1. - L’interazione con p53 interferisce sia con i segnali di trascrizione e traduzione di p53 che con quelli che portano all’apoptosi. - L’interazione con IRF-1 (interferon-responsive factor) blocca la trascrizione di geni codificanti proteine immunitarie indotta da IFN e contribuisce all’evasione immunitaria del virus. La proteina p53 sopprime la crescita cellulare attivando trascrizionalmente la proteina p21, che inibisce le chinasi del ciclo cellulare cruciali per la progressione del ciclo in G1 Esistono molti tipi di papillomavirus e non tutti si comportano allo stesso modo. Infatti, i papillomavirus vengono suddivisi in quelli ad alto rischio e quelli a basso rischio. Si sa che i virus a basso rischio hanno una minore capacità di interagire con le proteine cellulari, quindi non possono interferire tanto con il ciclo cellulare. Proteina E6: Interagisce con p53 (induce il blocco del ciclo cellulare per permettere la riparazione, ma se viene bloccata, il ciclo cellulare non viene fermato). Il virus la blocca affinché la cellula continui a replicarsi. In condizioni normali: p53 è inattiva. Tuttavia, in condizioni di stress p53 si attiva e arresta il ciclo in G1 (qui per consentire la riparazione del genoma prima che la cellula inizi a replicarsi). Se c'è il virus, E6 può inattivare p53, inducendo la degradazione massiva di p53, così la cellula continua a proliferare e promuove eventi di trasformazione cellulare. → Porta alla degradazione e alla down-regolazione delle vie implicate nell’arresto del ciclo e apoptosi. Proteina E7: -Si lega alla proteina retinoblastoma (RB), proteina soppressoria della crescita cellulare. -Interferisce con la regolazione del ciclo cellulare (induce trasformazione). -Reprime la trascrizione dei geni implicati nell’apoptosi. -Inoltre, l’interazione con ISGF-3 (Interferon-Stimulated Gene Factor 3) e IRF-1 (interferon regulatory factor 1) causa l’evasione delle cellule trasformate dalla risposta immunitaria innataInltre ha ruoli nella risposta legata ai interferoni. E2F è un attivatore del ciclo cellulare che è regolato dal legame con pRB, un soppressore della crescita delle cellule tumorali. La proteina E7 di HPV può legare pRB ed in seguito a ciò pRB non è più in grado di legare E2F e di regolarlo. Il risultato è che E2F può liberamente attivare il ciclo cellulare. PROTEINE TARDIVI (STRUTTURALI) Una volta che vengono sintetizado en la celula tendono a constiturire le capside. Proteina L1 e L2 L1 e L2 sono proteine espresse tardivamente, si assemblano spontaneamente formando il capside icosaedrico. L1 (proteina capsidica maggiore) rappresenta l’80% delle proteine capsidiche. ➔ È responsabile dell’attacco del virus alle cellule suscettibili ed inoltre media la risposta umorale e cellulo-mediata all’infezione. L2 (proteina capsidica minore) rappresenta il restante 20% delle proteine capsidiche 3. REPLICAZIONE di HPV I papillomavirus hanno spiccato tropismo per le cellule epiteliali di cute e mucose. La replicazione virale dipende dallo stato di differenziazione delle cellule. Tropismo specifico per gli epiteli squamosi cheratinizzati e non. Il virus attraversa lo strato della membrana basale attraverso lesioni della pelle. Si osserva un'alterazione della superficie della mucosa, dove il virus si trova spesso nello strato staminale dell'epitelio. Questa infezione dello strato staminale garantisce che il virus rimanga per lunghi periodi. Nelle cellule meno differenziate, avremo una espressione limitata di E1 ed E2. E1 mantiene l'episoma e E2 sopprime E6 e E7. Il virus è in una fase di latenza non replicante. E4 distrugge la citocheratina. le cellule epiteliali si dividono molto per differenziarsi. Questo è un aspetto molto importante, poiché la replicazione del virus è associata allo stato proliferativo della cellula. Al interno di queste cellule nel nucleo cellulare avviamo vari episoni virali, inizia la expresione di E6 Y E7 y la presenza di queste proteine e importante perchje iniziano a l virus del papilloma umano (HPV) si replica in modo sincronizzato con la differenziazione delle cellule epiteliali, partendo dagli strati più profondi fino a quelli più superficiali. 1. Infezione nello strato basale L'HPV infetta le cellule basali dell'epitelio, le uniche in grado di dividersi attivamente. L'infezione avviene generalmente attraverso microlesioni nella pelle o nelle mucose, che permettono al virus di raggiungere queste cellule. 2. Mantenimento del genoma virale nello strato basale Una volta all'interno, il DNA di HPV si mantiene in forma episomale (circolare, non integrato nel genoma cellulare) e si replica in basse quantità per sfuggire al sistema immunitario. In questa fase, i geni precoci (E1, E2, E6, E7) regolano la replicazione e il ciclo cellulare. E6 e E7 bloccano i soppressori tumorali p53 e pRb, permettendo alle cellule infette di continuare a proliferare. 3. Espansione del genoma virale negli strati intermedi Quando le cellule infette migrano verso gli strati sovrabasali, il virus inizia a replicarsi attivamente. Qui entrano in azione proteine come E4, che modificano la cheratina e preparano l'ambiente cellulare per la fase finale della replicazione virale. 4. Espressione dei geni tardivi e assemblaggio negli strati superficiali Negli strati più differenziati (granuloso e corneo) si attivano L1 e L2, le proteine del capside. Il DNA virale viene incapsidato all'interno di queste proteine per formare nuove particelle virali complete. 5. Rilascio del virus nello strato più esterno Nello strato corneo, le cellule si sfaldano (desprenden) naturalmente, rilasciando i nuovi virioni senza indurre infiammazione. Questo permette all'HPV di persistere senza essere facilmente riconosciuto dal sistema immunitario. Conclusione: L'HPV non causa una lisi cellulare attiva, ma si replica in modo coordinato con la differenziazione delle cellule epiteliali, iniziando nello strato basale e completando il suo ciclo in superficie, dove vengono rilasciate nuove particelle virali pronte a infettare altre cellule. El punto mas relevante es cuando tenemos una expresion de citoqueratine en la cual inizia la produzione di E4 che e importante perche favorice la interazione__ al interno del citoplasma celluare. Cuando le cellule inizie il diferenziamento finale si attivano l1 e L2. A medida que las Verruca cutanea: Son dobita a una aletrazione della attivita proliferativa, si formano lesioni di tipo mucosale. La replicazione HPV avvine attraverso il modelo del cerchio rodante, a livelo nucleare. Anche l’assemblaggio dei virioni avviene nel nucleo. 4. CARATTERITTICHE DEI INFEZIONI DA HVP Alcuni fenotipi hanno una relazione con forme tumorale. Infezione in genere tra i 20 - 30 anni di età L’infezione si risolve di solito spontaneamente (nel 90% dei casi si risolve in 2 anni) Alcune infezioni si manifestano con anormalità microscopiche. Vengono risolte dal sistema immune dell’ospite La persistenza virale può portare al tumore (principalmente nelle donne) La infezione avviene molto lenta Agente cancerogeno principal en el tumor de in a donna L’ infezione a menudo se resolve spontaneamenta, nei soggeti senza problemi immunitari. In una popolazione immunodeficiente, la presenza del virus per un lungo periodo può portare a processi oncogenici. In questo caso, è stato osservato che la persistenza del virus, in particolare la presenza di E6 ed E7, blocca il controllo del ciclo cellulare, consentendo alla cellula di proliferare indefinitamente, e possono verificarsi eventi che favoriscono la replicazione del tumore. Infezine molto lenta. Esto es devido a la coevolucion entre el virus con el honbre. Hja y alteracion a nivel del tejido en el sitio de infeccion. HPV causa lesioni epiteliali benigne caratterizzate da intensa proliferazione delle cellule basali e, conseguentemente, da un ispessimento locale dell’epitelio (DNA episomiale) HPV è associato con lo sviluppo di lesioni displastiche pre-neoplastiche e carcinomi a livello ano-genitale, ma anche nella cavità orale e vie respiratorie (DNA integrato). ➔ Nelle forme tumorali, generalmente il virus è integrato, poiché quando si integra, E2 non viene espresso e E6 ed E7 sono sovraespressi, il che rende l'effetto del virus sull'ospite più grave 5. SINTOMI Epidermodisplasia verruciforme L'epidermodisplasia verruciforme (EV) è una genodermatosi ereditaria rara, caratterizzata da un'infezione cronica da HPV, che causa lesioni cutanee polimorfe, e da un elevato rischio di sviluppare un tumore cutaneo diverso dal melanoma. La prevalenza esatta dell'EV non è nota. La malattia di solito si presenta nel periodo neonatale (7,5% dei casi), durante l'infanzia (61,5% dei casi) o alla pubertà (22% dei casi), con la comparsa progressiva di papule verrucose piane iperpigmentate o ipopigmentate, placche irregolari di colore marrone-rossastro, lesioni seborroiche cheratosiche e macule simili a quelle della pitiriasi versicolor sul tronco, sul collo, sul viso, sul dorso delle mani e dei piedi (la cute esposta al sole). Le lesioni cutanee possono essere causate dai diversi sottotipi dell'HPV (HPV5 e HPV8 sono stati descritti nell'80% dei casi). Il 30-60% dei pazienti sviluppa carcinomi cutanei diversi dal melanoma, in particolare carcinomi a cellule squamose (CCS), durante la quarta o quinta decade di vita, soprattutto nelle aree esposte al sole. La infezione di HPV e associata a una risposta immunuaria esta e quella hc es responsable de Infatti quando avviamo problemi inmuniloc La patologia asociada a HPV RISPOSTA IMMUNITARIA e HPV Una risposta immune efficiente è importante per la risoluzione dell’infezione da HPV (tessuto linfoide associato alla cute e mucose). Le malattie associate ad HPV sono frequenti e severe in pazienti con immunodeficienze primarie e secondarie, con disordini linfoproliferativi e AIDS Infiltrati di linfo-monociti sono presenti nelle lesioni in guarigione e i linfociti T infiltranti proliferano in risposta a E7 e L1. La regressione di una lesione è generalmente seguita dalla regressione delle altre.** **sugiere que, en algunas personas, cuando una lesión relacionada con el HPV comienza a mejorar o desaparecer, otras lesiones similares pueden mejorar al mismo tiempo, como si se tratara de un proceso autolimitante o de respuesta inmune generalizada. Il potenziale oncogeno di HPV Nel 85-90% di tutti i tumori della cervice uterina è presente DNA di uno dei genotipi di HPV a medio- alto rischio e in circa il 70% è presente il genotipo 16 o 18. HPV a medio-alto rischio è presente nelle lesioni pre-cancerose e nelle lesioni neoplastiche intraepiteliali (CIN). mRNA di HPV è evidenziabile nelle lesioni tumorali Evidenze sierologiche indicano una prevalenza di anticorpi anti-HPV-16 e –18 nei pazienti con tumore cervicale rispetto ai controlli Evidenze simili esistono per l’associazione di HPV e alcuni tumori a cellule squamose vaginali, vulvari, del pene e anali. Nella lesioni tumorales si observa la presenza del virus en factores transcripcionales. Se ha visto que la presencia de nticuerops contra algunos fenotipos de este virus sera mucho mas frecuente en pacientes con tumores asociados al virus lo cual refuerza la idea de q l vrus esta ligado al tumor en la fase de liberacion del particulas se pued dar un procesode integracion, que promueve la proliferacion tumor que al principio se desarrolla como infeccion localizada, todo esto esta ligado a la accion de e6 y e que se ahn sobreexpresado. Grafia: representa la incidencia de las lesiones Despues con el desarrollo de la inmunidad→ lesioni expontanea. Tuttavia tendono a rimanere con una certafrecuenza. Il problema piu grosso e ligata a la presenza del virus. Queste non hanno grose variazioni. Infatti vediamo que Ci sono 2 tipi di cepi di HPV a seconda del rischio: basso e alto. Esto es epidemiologicamente importante pq podemos tenerlo encuenta para la prevencion, porque cada una de estas clasificacion se corresponde con diferentes serotipo sespecíficos. 6. ONCOPROTEINE DI HPV Nelle lesioni maligne il DNA di HPV è integrato a livello del gene E2 L’interruzione di E2 svolge un ruolo nella patogenesi neoplastica in quanto normalmente “down-regola” espressione di E6 e E. Le proteine E5, E6, E7 di HPV inducono la proliferazioni cellulare (inmortalizacione) e favoriscono la probabilità di trasformazione neoplastica delle cellule infettate Funzioni di E6→ HPV di alto rischio: - Degradazione di p53: inhibizionie apoptosi, proceso di immortalizzacione cellulare los siguientes efectos se deben a la interacción de E6 con otras proteinas diferetes a p53: - Inibizione apoptosi - Destabilizzazione cromosomica - Attivazione telomerasi - Blocco funzioni interferone (?)  Funzioni di E7→ HPV di alto rischio: Interacioe con algunas proteinas, estas interacion va a participar en la desregulacion del ciclo celular. E7 es importante para la disregulacion. Estara ligada a la activacion de las ciclinas: - Inattivazione Rb - Attivazione cicline E e A - Induzione apoptosi - Inibizione degli inibitori delle chinasi ciclinodipendenti - Degradazione di tirosin-chinasi Blk (?). P53 y retinoblastoma son los target princiaples de E6 y E7, estas tambien pueden interactuar con otras proteinas HPV E5 si inserisce nella membrana cellulare e attiva il recettore PDGF in assenza del ligando specifico innescando segnali di proliferazione cellulare. Nel caso di E6, la presenza del dominio ammino-terminale sembra essere importante per l'interazione con diverse proteine cellulari. Il dominio presentato da E6 interagisce con un dominio che è abbondante nelle proteine che regolano il ciclo cellulare, il che può promuovere i processi oncogenici. CONCLUSIONI della patogenesi La patogenesi molecolare dei tumori HPV-associati è parzialmente conosciuta. Tuttavia, gli HPV ad alto rischio sono sufficienti ad indurre una conversione maligna. L’induzione di instabilità cromosomica, mutazioni ed aneuploidie giocano un ruolo importante nella tumorigenesi. L’interruzione di 2 cascate di segnalazione indipendenti, cioè P53 and RB, è responsabile dell’immortalizzazione cellulare e del fenotipo invasivo L’induzioni della instabilità cromosomica, mutazioni, e6 y E7 creano le condizioni che ahacen que se den estos eventos. Otro aspecto importanmte es la interrupcion de la cascada de regulacion de p53 y de riboastoma. 7. DIAGNOSTICA Normalmente se hace: Esame clinico mettere inevidenzia la lesioni Esame citologico ed istologico Immunocitochimica: per marcare la presenza dei vrus sulla biopsia Ricaerca di acidi nucleici: o Frammento bioptico incluso in paraffina o Tampone regione ano/genitale o Tampone cervicale o Tampone si altro tipo o Ibridazione direta del DNA virale con sonde specifiche , in situ o in soluzione. o PCR o Sequenziamento 8. TERAPIA NON esiste nessu farmaco specifico anti-HPV Crioterapia Rimozione chirurgica Interferone e atere moecule que interfieren con la respues inmunitria, este tipo de tratamientos buscan estimular la respuest inmunitaria. Cidofovir (topica, intralesione) No habbiam al momento antivirali specifici. Sono vari tipi di approchi terapei 9. PREVENZIONI Evitare contatto diretto con tessuto lesionato Uso di profilattico. Vaccino: basato sul particelle , VP1 la proteina capsidica maggiore, antigeno vacial. Las primeras vacunas que se han desarrolado son polivalentes, ej: Merk para HPV 6, 11, 16 y 18. Propietta edlle prteine del capside del virus. Le proteina sono in grado di autoausemblarse que se llama particelle no virale→ parece un vius pero falta del dna que es la parte peligrosa. Podemos hacer sistemas recombinantes para producir l1—para que? Como se hace las vacunas? Celulas di deievito que viene ransformadas con plasmidos que , y otro modelo usa celulas de insecto que usa l1 u otro modelo se intr¡egra para producir l1. Que no son infectivas ni _. E inducen la respuest aanticorpal de l1 de el fenotipo y esta puede dar proteccion a ala infeccion con efecto neutralizzante. Sirve como prevenion. I vaccini preventivi per HPV sono basati su Virus Like Particles (VLPs) formate da L1 VLP formate da una singola proteina che è in grado di autoassemblarsi spontaneamente Non-infettivo, Non-oncogenico. Prodotto in cellule di insetto o in lievito Induce alti titoli di anticorpi neutralizzanti Nouvo gardasil si estudair - 9-valente (HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52, 58) - Vacunacion alto expectro mejor Cervarix (GSK): Cervarix è un vaccino bivalente contenente proteine L1 purificate per due tipi del papillomavirus umano (HPV, tipo 16 e 18). Vaccini preventivi: Se tienen que suminstar antes de la infeccion Vaccini terapeutici: NON c’è Puede ser importante tener un vacino curativo, no exits todavia pero se esta trabajano sebre la proteina para inducir una respuest aceluka mediaa q Las celulas q exprimen enmhc las ccelulas q LEZIONE 23: HERPES VIRUS 1. INTRODUZIONE Il ac. Nucleico nell viruna è in forma di DNA. Ci sono 3 virus di DNA che infettano il oumo Gruppo di virus a DNA di notevoli dimensioni, caratterizzati da una comune morfologia del virione, strategia replicativa e capacità diinstaurare infezioni latenti/ricorrenti e litiche e, nel caso di EBV,anche immortalizzanti. Quando infettano puo rimare per sempre Sono virus ubiquitari (la mayoria de la poblacion entra en contacto con este virus) e le loro infezioni sono molto diffuse. Nell’uomo sono associati generalmente a patologie benigne, ma possono essere anche responsabili di elevata mortalità e morbilità (signofica que hay un nº importante de infecciones en la población) inindividui immunodepressi, in questi individui possono causare ,alattie importante. La struttura del virione è comune a tutti gli herpesvirus: presentaun genoma a DNA di notevoli dimensioni associato a proteineche vanno a formare il nucleocapside, che è a sua voltacircondato da un rivestimento glicoproteico detto pericapside.Lo spazio compreso tra capside e pericapside è detto tegumentoe ne.tra il envelo e la capside non c’e un spazio vouto, ma ce in tegumento che contiene proteine ed enzimi virali che favoriscono l’inizio dellareplicazione Come tutti i virus provvisti di pericapside, gli herpesvirus sonosensibili agli acidi, ai solventi, ai detergenti e all’essiccamento. 2. SOTTOFAMIGLIE Alphaherpesvirinae o Herpes Simplex virus-1 e 2 virus (VZV)(HSV-1/HSV-2), Varicella-Zoster Betaherpesvirinae o Cytomegalovirus (CMV), Human Herpesvirus-6 e 7 6/HHV-7)(HHV Gammaherpesvirinae o Epstein-Barr Virus (EBV), Herpesvirus-8 (HHV-8, KSHV) Sono divisi perche tengono di avare caracteristiche che acumulano: alfa Beta Gamma Spettro d’ospite variabile ristretto molto ristretto Latenza nell SNC nelle cellule de sangue Cellule linfoidi Non cultivabile cultivabile Difficilmente cultivable (riplicano scarsamente) Celula bersaglio Epitelio squamoso Epiteli, monociti, Linfociti, altre cellule stratificato linfociti 3. STRUTTURA Il DNA ha doppio filamento lineale y ha cerca di 150 kb Diametro di 150-250 nm Envelope con glicoproteine Tegumento Capside icosaedrico (100 nm) di 162 capsomeri Replicazione nucleare Instaurano infezioni latenti I sequenze repetuti sono importante per la replicazione, associati a eventi di remcombinazione. En el caso de los virus gamma como el EBV: Hay una cierca complejidad 4. ESPRESSIONE La spresino regulaa di herpes virus. Geni alfa (precocissimi): fattori trascrizionali – proteine non presenti nel virione. Attivano espressione geni beta Geni beta (precoci): proteine coinvolte nella replicazione del DNA (DNA polimerasi e fattori trascrizionali) Geni gamma (tardivi): proteine strutturali –proteine presenti nel virione. LA TRANSCRIPCIONE dei geni dipende de fattore Tendremos factores transcripcionales del virus y tambien componentes d el acélula DNA dei virus erpetici è trascritto in RNA da enzimi cellulari (RNA-polimerasi DNA-dipendente). La trascrizione di alcuni geni tuttavia dipende da fattori nucleari della cellula E da proteine virus specifiche. Questo controllo trascrizionale determina se l’infezione della cellula porti alla: (la latenza sa da solo en determinados tipos celulares pues depende de muchos factoers, la latencia de este virus ha diso muy estudiada), dependiendo de la celula tendra alguno de estos efectos: ▪ produzione di nuova progenie virale e morte della cellula (infezione litica) - Il virus neo prodotto si accumula nel citoplasma ed è rilasciato per lisi della cellula ▪ gemmazione persistente del virus senza morte cellulare (infezione persistente) - Il virus assemblato esce per esocitosi. - Può passare anche attraverso le giunzioni inter-cellulari. Rilascio continuo di virioneesto ultimo ns si va aquí. - Questo meccanismo reduce la capacidad del sistema inmunitario para combatir el virus ▪ infezione latente. Se la cellula ospite non è permissiva alla replicazione del DNA virale si instaura una infezione latente 5. ALPHA HERPES VIRUS 5.1 HSV - 1 : HERPES SIMPLEX VIRUS Forma sferica; diametro 120-200 nm; genoma a dsDNA, lineare, di grandi dimensioni (152kb), costituito da: core, capside, tegumento, envelope. Agente patogeno molto diffuso nella popolazione umana; Infezione primaria in cellule epiteliali; Latenza nel sistema nervoso centrale (gangli sensitivi) in forma episomale, senza integrazione nel genoma cellulare; Muy ubiquitariao, Mantienen su individuolidad genomica, cuendo entran en la celula circularizan. Il virus infetta cellula di natura epiteliale. Ce la esspresione regulata di proteine, produzione di progenie virale. La liberazione di alcuni viruione che aggiscano. Si entra en terminacion nerviosa, tiene un mov retrogrado y entra en la neurona manteriendo una pequeña actividad replicatova q permite general nuevos virones q pueden se liberado. En la neurona hay una infeccion latente en la que el virus permanece en toad la vida de la célula, lo cual es bastante en una neurona. REPLICAZIONE La proteine gC y GD sono importante per il ingreso del virus. L’interazione delle glicoproteine virali gC e gD ai recettori cellulari media l’ingresso del virus nella cellula ospite. La fusione tra l’envelope virale con la membrana plasmatica, per rilasciare il nucleocapside e le proteine del tegumento nel citoplasma, è mediato da gB e gH/gL. Primer virus que tine un funsionio directa con la memnrbana no a traves de un endosoma. Il capside viene trasportato al poro nucleare tramite il citoscheletro dove il DNA virale viene rilasciato nel nucleo. Una volta che il genoma si trova al interno del nucleo: espressione genica: Trascrizione di geni immediati precoci che promuovono la trascrizione dei geni precoci e proteggono il virus dall'immunità innata dell'ospite. Trascrizione dell'mRNA virale precoce da parte della polimerasi II dell’ospite, codificante le proteine coinvolte nella replicazione del DNA virale. Trascrizione di mRNA tardivi da parte della polimerasi II dell’ospite, codificante le proteine strutturali. Il DNA lineare viene circolarizzato. Proteine virus-codificate consentono la replicazione del DNA virale Sintesi di copie lineari di DNA virale in concatameri mediante replicazione a cerchio rotante. Processamento dei concatameri con tagli endonucleasici specifici. A livello nucleare si assemblano le proteine del capside Il DNA viene incorporato in capsidi «maturi» Essitono una serie. Ci sono un equilibri per garantire una optimale replicazione dei virus al interno di nostro organismo. Sul la replicazione dil DNA. Mediante e, sistema del circolo rodanti, el dna replicado se incorpora en los viruones nacientes Assemblaggio avviene a livello nucleare si assemblano le proteine del capside  Il DNA viene incorporato in capsidi «maturi». Tutto il processo viene datto nel nucleo, questo virus debe essere rilasciato del nucleo. come il virus esce della celula?. (1) Nucleocapsidi con DNA virale. (2) Interazione dei nucleocapsidi con la membrana nucleare interna in cui la lamina nucleare è stata disassemblata da chinasi cellulari e virali. (3) Gemmazione dei nucleocapsidi nello spazio nucleare acquisendo l’envelope primario. (4) I virioni fondono con la membrana esterna liberando il nucleocapside nel citoplasma. (5) Nel citoplasma, i nucleocapsidi acquisiscono proteine del tegumento. (6) Acquisizione dell’envelope secondario dai MVB, formazione dei virioni maturi. (7) Si formano vescicole con virioni maturi. (8) Esocitosi e rilascio dei virioni maturi nello spazio extracellulare. il virus se forma nel nucle, interagisce con la membrana nucleare, si fonde con la primera membrana y puoi ocn la segunda,, dopo il virus voene rilasciato al citiplasma dove adquiere le proteine delle componente del teguemto che servirano per la interazione con altre membrane per, TIPOLOGIE DI INFEZIONE HSV‐1 e HSV‐2 infettano la mucosa orale (HSV-1) e genitale (HSV-2) e replicano nell’epitelio squamoso stratificato; segue l’ingresso nelle ramificazioni delle fibre nervose sensoriali non mielinizzate presenti nell'epitelio squamoso stratificato e quindi il trasporto retrogrado, associato ai microtubuli, al corpo cellulare del neurone nel ganglio della radice dorsale adiacente al midollo spinale (o al ganglio trigemino per HSV-1). Qui, l'infezione acuta è seguita da un'infezione latente permanente di queste cellule. HSV2 ha un tropismo preferenzialle per la mucosa genitale, ma non e esclussivo di qui. Il virus rimane li ma possono riattivarsi. In seguito a stimoli di stress, HSV‐1 e HSV‐2 possono riattivarsi, avviare un ciclo di replicazione litica e produrre virioni che migrano in direzione anterograda per reinfettare le cellule dell’epitelio nei siti dell’infezione primaria. Qui, si replica e viene quindi rilasciato nelle secrezioni orali o genitali. Questo processo può o meno provocare patologie cliniche. Il virus potenzialmente puo dare infezione serie. LATENZA Proceso inicial: Si forma un viruone che migrano alle terminacione nerviose e il virus a una fase di replicazione. Ce una piccola fase replicativa. I virioni formatii ritronano nell sitio dii ingresso. E qui da una infeccione rilevante e L'infezione latente non è un processo passivo in cui un virus infetta una cellula non permissiva. Un'infezione latente di successo di HSV-1 comporta diversi processi: L'espressione dei geni litici deve essere silenziata per prevenire gli effetti citopatici dell'infezione litica (gene LAT complementari ad alcuni mRNA precoci immediati e pertanto in grado di complessarsi con essi (formando ibridi RNA:RNA che non possono essere tradotti) e di bloccare di fatto l’espressione virale.). Le risposte delle cellule ospiti, come l'apoptosi e l'immunità innata, devono essere bloccate. La risposta immunitaria acquisita deve essere elusa o bloccata in modo che la cellula infettata non venga eliminata. PATOGENESI HSV è responsabile di un’ampia varietà di patologie nell’uomo, daquelle lievi a quelle debilitanti. Oltre alla tipica infezione da HSV-1, l’herpes labiale, occasionalmente si assiste ad interessamenti della cornea e dellacongiuntiva (cheratocongiuntivite) con compromissione anchegrave della capacità visiva dell’individuo affetto, ed inoltre a gengivostomatiti e stomatiti. Raramente, l’infezione erpetica può essere responsabile di patologie particolarmente gravi qualipolmoniti, meningiti, encefaliti ed epatiti, caratterizzate da elevata morbilità e mortalità. La infezione a livello del SNC è grave. I virus dell’herpes simplex di tipo 1 e 2 hanno un potenziale patogeno tendenzialmente diverso: o HSV-1 è prevalentemente associato a lesioni orali ed oculari eviene trasmesso respiratorie per via orale ed attraverso le secrezioni. o HSV-2 viene isolato prevalentemente da lesioni genitali ed anali ed è trasmesso per via venerea. Alcune evidenze sembrano collegare HSV-2 al cancro della cervice uterina e alla trasmissionedi HIV-1. HSV è puo importante durante lel naimineto, il herpe x neonatele e poiu peligroso (se da aen el momento del naciemento si la made esta infectada) RISPOSTA IMMUNITARIA contr HSV Negli ospiti inmunocompetenete no suele haber problemi importanti. La imm. Innata : Interferone e cellule NK: ruolo importante nel limitare l’infezione iniziale (prime ore) La imm adattativa aiuta a ridurre il impacto: - Risposta cellulare (CTL): uccide cellule infettate - Risposta umorale (anticorpi diretti verso glicoproteine dell’envelope): neutralizzazione. DIAGNOSI DI INFEZIONE DA HSV Su cellule prelevate dalle lesioni: Colorazione istochimica su cellule prelevate alla base della lesione (sincizi e corpi di inclusione Coundry tipo A) - Immunofluorescenza con anticorpi tipo – specificiSu campione bioptico prelevato dalle lesioni:- Isolamento virus dalle lesioni virali mediante crescita in coltura cellulare - PCR/Real Time PCR * Sierologica: Ricerca anticorpi nel siero (per infezione primaria) – Anticorpi non aumentano in corso di infezioni recidivanti No se suele usar porque normalmente se contagia en niños pequeños (explicar mejor) TERAPIA Farmaci analogo di nucleosidi (es. Acyclovir, che va a bloccare il virus in replicazione ) molto selettivi in quanto devono essere fosforilati da TK virale Attivi solo sul virus in replicazione e non in latenza→ quenado il virus ce in latenza e per sempre. Meccanismo di funzionamento dell’acyclovir: L’acyclovir (analogo aciclico della guanosina = acicloguanosina – ACV) è un analogo aciclico della guanosina. Le molecole di ACV che entrano nella cellula vengono convertite in ACV-monofosfato dalla timidina chinasi (TK) espressa dal virus, pertanto il farmaco è selettivo sulle cellule infette. Gli enzimi delle cellule ospiti aggiungono altri 2 fosfati per formare l’ACV-trifosfato, che viene trasportato nel nucleo. Questo composto viene riconosciuto dalla DNA polimerasi virale, che lo incorpora nella catena di DNA virale durante la replicazione. Tuttavia, quando l'aciclovir trifosfato viene incorporato nel DNA virale, non consente l'aggiunta di altre basi, bloccando così l'allungamento della catena di DNA virale e fermando la replicazione virale. Ciò significa che il virus non può moltiplicarsi né produrre nuove copie (progenie virale) Quindi eliminamo la produzione de progenie virale, ma non eliminamo il virus in latenza. Questo spiega perché possono verificarsi riattivazioni del virus in seguito, anche se il farmaco controlla le manifestazioni della malattia. PREVENZIONE Evitare in generale di venire in contatto con il virus. Personale medico-sanitario a rischio soprattutto con pazienti asintomatici e con attiva replicazione virale in corsoEvitare rapporti sessuali con sintomi/lesioni genitali Consulenza ed educazione (soprattutto per herpes genitale/infezione neonatale) Vaccini in sperimentazione, non ce vaccine tuttavia. 5.2 VIRUS della VARICELLA -ZOSTER (VZV o HHV -3) Struttura e replicazione simile a HSV Genoma più piccolo Codifica 75 proteine Ubiquitario (> 90% della popolazione ha anticorpi) Capazità di difussione aerea. Possono essere adqusite direttamente o indirrettamente. Il virus tende a infettare le vie respiratorie dove infetta macrofagi o numociti. Qui avviamo la prima fase di recomb. Replicazione: Trasmissione: via aerea (aerosol) o contatto diretto lesioni Periodo incubazione (10-12 giorni): asintomatico - virus infetta mucose prime vie respiratorie – macrofagi e pneumociti (viremia I) Diffusione: Virus diffonde dai polmoni ai linfociti, monociti e al sistema reticolo-endoteliale (viremia II, viremia secundaria) e diffusione a epiteli di tutto il corpo (cute, mucose, congiuntiva, tratto respiratorio) →papule (e trasmissione). Lesioni di tipi cutaneo, questa fase è altamente infettiva. (a causa de las lesiones cutaneoas) Latenza: Infetta neuroni dei gangli dorsali (latenza per tutta la vita). Riattivazione: meno frequente che HSV (20% della popolazione - 1 volta nella vita. La ria