Master I Biochimie 2023 PDF

Dr.Bouasla.I Absorption de la lumière UV Du fait de la présence des bases puriques et pyrimidiques et grâce à leurs nature aromatique conjuguée ; les acides nucléiques absorbent les rayons UV (ultra violet) ils présentent un maximum d’absorption à la longueur d’onde de 260 nm (absorption ma...

Dr.Bouasla.I Absorption de la lumière UV Du fait de la présence des bases puriques et pyrimidiques et grâce à leurs nature aromatique conjuguée ; les acides nucléiques absorbent les rayons UV (ultra violet) ils présentent un maximum d’absorption à la longueur d’onde de 260 nm (absorption maximale d’un rayon par les bases azotées). À 260 nm l’ADN monocaténaire absorbe plus que l’ADN bicaténaire c’est l’effet hyperchrome (Figure 4). Effet hyperchrome Figure.4 : Effet hyperchrome. 3 Dr.Bouasla.I Dénaturation thermique (température de fusion) La dénaturation d’une molécule est la perte de sa structure tridimensionnelle sans altération de la structure primaire. Il s’agit pour une molécule d’ADN double brin de la rupture des liaisons hydrogène entre les bases, on obtient l’ADN monocaténaire. La température de fusion ou la Tm (melting temperature / m pour melting temperature en anglais=fusion) représente le point d’inflexion ou le point de transition qui correspond à la température moyenne pour la quelle la moitié des brins d’ADN sont dissociés (moitié de cet ADN est dénature). On peut également la nommée température de demi dénaturation (Figure 5). DOmax/2 Point d’inflexion Figure.5: Courbe de dénaturation thermique (Température de fusion). 4 Dr.Bouasla.I Pour calculer la Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides on utilise la relation : Tm en °C= (A+T) x2+ (G+C) x4 Pour calculer la Tm d’un oligonucléotide supérieur à 30 nucléotides on utilise la relation : Tm en °C= (A+T) x2+ (G+C) x4x [1-(N-20) /20]) Pour calculer la Tm des ADN suffisamment longs >200 nucléotides on utilise la relation : Tm en °C =69,3+0,41 (%G+C) Il existe plusieurs facteurs qui influencent la valeur de la Tm  Longueur du fragment  Composition en bases azotées  Présence de mésappariement  Force ionique  pH  Agent dénaturants Renaturation (phénomène d’hystérésis) La dénaturation de l’ADN par la chaleur est un phénomène réversible et la renaturation de la même molécule est influencé par la vitesse de refroidissement (Figure 6). 5 Dr.Bouasla.I Figure.6 : Dénaturation et renaturation thermique de l’ADN. Ionisation des acides nucléiques Au pH physiologique (6,5 à 7) chacun des groupes phosphodiester (participant aux ponts phosphodiester) possède une seule fonction acide qui a un pK entre 1,5 à 2, c'est-à-dire il possède un seul groupement qui peut être ionisé selon la réaction : L’acide nucléique portera donc, un nombre de charges négatives (contribution des phosphates) égale au nombre de nucléotides. Les bases purique et pyrimidique liée aux oses (ribose et désoxyribose), ne portent aucune charge au pH physiologique (6,5 à 7). 6 Dr.Bouasla.I Hydrolyse des acides nucléiques La dégradation d’un polynucléotide peut être due par des agents chimiques ou enzymatiques, elle concerne l’enchainement phosphodiester ainsi que les unités nucléotidiques (composants et liaison). Produits d’hydrolyse Type d’hydrolyse chimique ARN ADN Alcaline Nucléosides monophosphate. ------------------ Acide : *pH 1+chaleur Pentoses+phosphates+bases. Base purique+acides nucléiques apuriniques *pH 4 (dégradation des liaisons N-osidique avec les bases puriques uniquement). L’hydrolyse de la liaison phosphodiester des acides nucléiques est catalysée par des phosphodiestérases spécifiques appelées nucléases. Si l’attaque est faite à l’extrémité on parle des exonucléases ; alors que si l’attaque est faite à l’intérieur de la chaine on parle des endonucléases. Les différentes espèces bactériennes produisent des endodésoxyribonucléases de très haute spécificité désignées sous le non d’enzyme de restriction. Les séquences reconnues par ces enzymes comportant 4 à 10 nucléotides et sont le plus souvent palindromiques. 5’ G/AATTC 3’ Séquences palindromiques 3’ CTTAA/G 5’. Centre de symétrie 7 Dr.Bouasla.I Techniques d’extraction, de purification et de révélation des acides nucléiques Extraction et purification En effet, le principe d’extraction consiste à suivre la démarche d’étapes suivantes : une lyse des cellules et solubilisation des lipides membranaires (délipidation) suivie par une élimination des protéines (déprotéinisation) et enfin une purification couplé à une précipitation afin de récupérer l’AN rechercher.  Elimination des lipides (délipidation) : Suivant le type des cellules concernées, on peut donc effectuer soit :  Une lyse cellulaire mécanique : on utilise le choc thermique « cycles de congélation/décongélation », ou le choc osmotique.  Une lyse cellulaire chimique : le plus souvent par : le sodium D-odécyl sulfate « SDS » appelé aussi laurylsulfate de sodium, tritonx100 et sarcosyl.  Elimination des protéines (déprotéinisation) : par des endoprotéase non spécifique comme la protéinase K.  Purification d’un acide nucléique :  Traitement par l’ARNase pour éliminer les ARN et récupérer les ADN.  Traitement par l’ADNase pour éliminer les ADN et récupérer les ARN totaux.  Réalisation d’une ultracentrifugation en gradient de densité pour séparer l’ADN de l’ARN puis récupérer chaque AN à part.  Aussi dans le but d’éliminer les ADN et purifier un type spécifique des ARN qui sont les ARNm possédant une queue poly A l’utilisation d’une chromatographie d’affinité est recommandé ; dont la phase fixe est pourvue de fragments d’oligo (dT) cellulose ou de poly (dU) sepharose de quelque dizaines de nucléotides cette dernière peut s’hybrider avec les ARN polyA. 8 Dr.Bouasla.I  Précipitation  Précipitation à l’alcool éthylique : il faut ajouter à un volume de solution au moins deux volumes d’éthanol + une quantité importante de sels et placer la solution à froid. Le culot d’AN est obtenu après centrifugation à très grand vitesse (5000g pendant 30 min).  Précipitation à l’isopropanol : Il faut ajouter à un volume de l’extrait d’AN un volume d’isopropanol. Le culot d’AN est obtenu après centrifugation à très grand vitesse (5000g pendant 30 min). Quelle que soit la technique de précipitation utilisé, le précipité est lavé avec de l’éthanol à 70% afin d’éliminer les sels ou l’isopropanol passent en solution (se trouvent dans la phase aqueuse) puis centrifugé pendant 15min, et séché dans le but d’éliminer l’éthanol de lavage. NB : il faut éviter toutes destructions enzymatiques des AN. Ces derniers qui sont stables dans une cellule vivante deviennent très vulnérables à la digestion par les nucléases endogènes et exogènes une fois la cellule est morte. Pour ce faire, les échantillons sont:  Recueillis sur anticoagulant : de préférence de type EDTA  Congelés immédiatement dans l’azote liquide 9 Dr.Bouasla.I Technique Dans la pratique, les acides nucléiques sont extraits et purifiés à partir de matériels biologiques par différentes méthodes qui doivent être adaptées selon la nature du matériel biologique.  Extraction d’ADN  A partir d’échantillon sanguin 1- Le sang est collecté dans des tubes EDTA. 2- Lyse des globules rouges par la méthode congélation/décongélation suivie d’un lavage, avec un grand volume d’une solution hypotonique de lyse (Tris/HCl/EDTA). 3- Des lavages par la même solution suivie d’une centrifugation seront répétés. 4- Le culot leucocytaire est repris dans un tampon de lyse des GB (Tris/HCl/EDTA, SDS, pH=8) puis traités par un mélange de détergent SDS ou sarcosyl. 5- L’extraction est poursuivie par un traitement avec la protéinase K puis avec le mélange phénol-chloroforme.  A partir d’échantillon cellulaire : les cellules doivent préalablement être lysé au moyen d’un homogénéisateur de potter en présence d’un détergent (SDS), le protocole est ensuite identique à celui mentionné ci- dessus pour le cas d’extraction à partir d’échantillon sanguin.  Extraction d’ARN La méthode la plus utilisé est celle décrite par Chirgwin (1979), dont laquelle les échantillons sont homogénéisés le plus rapidement possible dans un tampon qui contient en général :  Un détergent : SDS ou sarcosyl,  Un agent dissociant : thiocyanate de guanidine « GuSCN »  Un agent réducteur : le 2-mercaptoéthanol ou dithiothréitol « DTT » 10  Dr.Bouasla.I Quantification (Dosage) des acides nucléiques  Spectrophotométrie (absorptiométrie UV) : cette technique repose sur la mesure de l’absorbance d’une solution d’AN dans l’ultraviolet à 260 nm puis à 280nm, à 270 et à 230 pour en déduire le rapport de la pureté de l’AN. Enfin le calcule de la concentration se fait selon la relation : à 260 avec un trajet optique de 1cm, une unité d’absorbance (densité optique DO lue sur le spectrophotomètre) correspond à :  Une concentration de 50µg/ml pour une solution d’ADN double brin.  Une concentration de 37µg/ml pour une solution d’ADN simple brin.  Une concentration de 25µg/ml pour une solution d’ARN.  Fluorimétrie : cette technique est plus sensible et plus spécifique que la spectrophotométrie. En effet, elle est appliqué uniquement pour le dosage de l’ADN (cette technique ne quantifie pas l’ARN).  Fluorochrome spécifique aux paires des bases (Bases A-T : Hoechst 332 et DAPI ; Bases G-C : mithramycine). Dont le traitement de résultats ce fait par un spectrofluorimétre (dosage fluorimétrique classique), grâce à cette technique on peut détecter même des très petites quantités (quelques picogrammes).  Fluorochrome intercalant : iodure de propidium, bromure d’éthidium ou acridine orange. Dont le traitement des résultats ce fait numériquement.  Dosage colorimétrique : cette technique sert à la détection des sucres Conditions Composés Pentoses Réactifs expérimentales formés Milieu acide concentré Chaleur Vert mesurable à Riboses Réactif de Bial ou l’orcinol Ion Fe3+ 590nm Milieu acide Bleu mesurable à 2-désoxyriboses Diphénylamine Chaleur 595nm pentose 11 Dr.Bouasla.I Révélation des acides nucléiques : séparation analytique et préparative Électrophorèse L’électrophorèse est une des techniques très utilisées pour la séparation, la détermination de la taille, l’estimation de la quantité et même la purification des biomolécules (ADN/ARN/Protéines) tout en permettant leur déplacement sous l’action d’un champ électrique d’intensité élevée. En biologie moléculaire l’électrophorèse représente la méthode de choix pour :  La séparation des différents fragments résultant de restriction enzymatique.  L’analyse des produits obtenus après une amplification PCR lors du séquençage des AN et des techniques d’hybridation (Southern et Nourthern Blot). Le principe général de l’électrophorèse, consiste à faire migrer des molécules chargées en présence d’un champ électrique. La séparation électrophorétique des particules est faite en fonction de la charge électrique mais pour des charges identiques (cas d’AN) elle se fait en fonction de leur taille (migration dans un champ électrique de la cathode (électrode -) vers l’anode (électrode +)) ; les mailles du gel permettent de séparer les molécules en fonction de leur poids moléculaire, donc le gel agit à la manière d’un tamis moléculaire au travers duquel les molécules d’AN en mouvement doivent passer. Les molécules de grande taille ont plus de difficulté pour passer à travers les mailles créées par le réseau des microfibres du gel et vont donc migrer plus lentement que les petites molécules. On distingue certains facteurs qui affectent la migration :  La longueur de la molécule d’ADN (masse moléculaire/paires de bases) (Figure 7).  La concentration du gel  Le voltage  La conformation de l’ADN (Figure 7). 12 Dr.Bouasla.I A B Figure.7 : Facteurs affectant la migration (A : longueur de la molécule d’ADN/B : conformation de l’ADN). 13 Dr.Bouasla.I Technique Premièrement on prépare le gel d’électrophorèse, ce dernier est constitué d’une matrice de polymère. Les principaux polymères utilisés sont (l’agarose et le polyacrylamide). Le gel d’agarose ou de polyacrylamide est coulé entre deux plaques de verre à l’abri de l’oxygène baignant dans un tampon. On peut utiliser comme tampon soit TBE (tris Borate EDTA), soit TAE (Tris/Acétate/EDTA) ou encore SB (Sodium/Borate). Dans la plupart des cas, l’échantillon et un marqueur de taille connue (ADN standard) sont déposés à l’aide d’une micropipette dans deux puits différents. Mais avant, ils doivent être mélangé avec un colorant de charge ; le choix de ce dernier est en fonction de la taille d’échantillon : le bleu de bromophénol (pour les fragments de petites tailles) ou bien le xylène cyanole (pour les fragments de grandes tailles) afin qu’on puisse visualiser la migration. Afin de récupérer le gèle après migration, il faut débrancher le système. La visualisation est assurée suite à une coloration et une révélation. 14 Dr.Bouasla.I A B D C E Figure.8 : Différentes étapes d’une électrophorèse (A : Préparation du gel/B : Dépôt des échantillons/C : Déclenchement de migration/D: Révélation et visualisation/E:Installation du dispositif). 15 Dr.Bouasla.I La détermination de la taille des fragments est faite suite à une comparaison avec le marqueur de taille moléculaire en se basant sur la droite log de la masse molaire=nombre de Kb en fonction de la mobilité des fragments (Figure 9). La migration est inversement proportionnelle au logarithme de la masse molaire exprimée en général en nombre de bases ou paires de bases. C'est-à-dire que les plus grands fragments se trouvent au sommet du gel alors que les plus petits se trouve au bas du gel. Figure.9 : Distance de migration éléctrophorétique en fonction de la taille des fragments d’ADN. 16 Dr.Bouasla.I  Gel d’électrophorèse  L’agarose : polymère à base d’agar purifié, c’est le support le plus utilisé pour la séparation des grands fragments, dans des dispositifs électrophorétiques de position horizontale. Différentes puretés d’agarose sont disponibles.  L’acrylamide : est le nom usuel du 2-propénamide (ou encoure amide acrylique) de formule brute C3H5NO. En biologie moléculaire, on utilise l’acrylamide polymérisé (polyacrylamide) pour réaliser des électrophorèses en position verticale utilisée surtout dans la méthode de séquençage de l’ADN; ce gel sert à la séparation des petits fragments. Afin de préparer le gel de polyacrylamide, les chaines d’acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) sont pontées avec la bisacrylamide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2) suite à une polymérisation par le persulfate d’ammonium ; cette réaction est initiée à l’aide de TEMED (tétraméthyléthyléne diamine qui réagit avec la lumière ce qui donne des ions hyper actifs). La porosité du gel dépend de la concentration d’acrylamide et de bisacrylamide et du rapport Acrylamide/Bisacrylamide. Le choix de la concentration et de la nature du gel est commandé par deux facteurs : la taille des fragments à séparer ainsi que la taille de la plaque de gel 17 Dr.Bouasla.I Ultracentrifugation La centrifugation ou bien l’ultracentrifugation est une technique de purification très puissante qui utilise la force centrifuge (force gravitationnelles élevées) pour séparer les différents composants d’un fluide. Au cours de la centrifugation ou bien de l’ultracentrifugation, les composants les plus lords sont entrainés au fond de tube, accélérant une sédimentation naturelle, alors que les constituants les plus légers sont retrouvés dans le surnageant. Ultracentrifugation en gradient de densité Pour séparer des particules biologiques de taille similaire mais de densité différente (différents types d’ADN « chromosomiques et plasmidiques ») on utilise de préférence les techniques d’ultracentrifugation en gradient de densité (un gradient de chlorure de césium). La différence entre la densité de la particule et celle du solvant influence la vitesse de sédimentation. Premièrement, on prépare un gradient continu de densité de chlorure de césium (CsCI). Grâce à la force centrifuge la variation de densité est établit d’une façon graduelle le long du tube au fur et à mesure de la centrifugation. Les ions césium qui sont lourds se dirigent lentement vers le fond du tube et forment un gradient de densité continu croissant du sommet jusqu’au fond. Puis, l’analyse débute par le mélange de l’AN que l’on veut séparer dans un tube contenant la solution de chlorure de césium (préalablement préparer) et le BET (indicateur coloré). Ensuite, le tube est soumis à une centrifugation de longue durée (50000 tpm pendant 72heures). Quand elles sont soumises à des forces centrifuges élevées, les molécules se déplacent à travers le gradient à des différentes vitesses déterminées selon leur coefficient de sédimentation. Une molécule va d’autant plus loin que son coefficient de sédimentation est plus élevé. L’ADN se concentre en une bande à l’endroit ou la densité de la solution de chlorure de césium (CsCI) est égale à la sienne (formation d’une bande intense de BET sous UV). 18 Dr.Bouasla.I Chapitre IV : Méthodes de séquençages des acides nucléiques Méthode chimique (Maxam et Gilbert) Le principe de cette méthode consiste à modifier spécifiquement, par un réactif chimique, un type de base et de cliver la chaîne d’ADN au niveau de ce nucléotide modifié (Figure 10).  Préparation de l’ADN  Découpage et isolement du fragment d’ADN à séquencer  Séparation des brins  Marquage  Clonage des brins obtenu par PCR (Polymérase chaine réaction)  Clivage chimique de l’ADN Le brin à séquencer est soumis à quatre réactions d’hydrolyse partielle qui vont cliver la molécule au niveau des bases A et G ou G ou C ou encore C et T. Pour ce faire, l’ADN simple brin marqué est séparé en 4 tubes qui subiront en parallèle un traitement chimique particulier. Chacun des tubes est additionné d’un réactif chimique qui modifie spécifiquement l’une des 4 catégories de base suivantes: G, A+G, C+T et C. Pour cela, on introduit un réactif spécifique de cette base dans l’une des quatre préparations, le réactif rend la base instable de ce fait un 1er traitement à la pipéridine permet de couper la base, après le retrait de la base, un 2éme traitement par la pipéridine permet la destruction du désoxyribose.  DMS (diméthylsulfate) : utilisé afin d’assurer la méthylation des purines, le traitement par l’acide dilué (0,1M d’HCl) après la méthylation par le DMS libère préférentiellement les adénines.  Hydrazine : utilisée pour assurer la méthylation des pyrimidines, l’hydrazine+NaCl inhibe la coupure uniquement au niveau des thymines.  Séparation des fragments par électrophorèse 19 Dr.Bouasla.I  Lecture de l’électrophorèse La révélation des bandes est faite par autoradiographie. Le brin est directement lue en partant des plus petits fragments (près de l’extrémité 5’) vers les plus longs (près de l’extrémité 3’) c’est-à-dire que la comparaison des puits G, AG, CT et C est faite dans un ordre de distance de migration décroissant (du bas en haut). 20 Dr.Bouasla.I Destruction chimique des bases : G/A+G/T+C/C Séparation sur gel d’électrophorèse Cathode (–) 3’ Anode (+) 5’ Lecture du résultat : 5’ATCAACTGCATCGTA3’ Figure.10 : Séquençage par la méthode de Maxam et Gilbert (chimique). 21 Dr.Bouasla.I Méthode enzymatique par les di-désoxynucléotides (Sanger) Le principe de cette technique repose sur l’interruption contrôlée de la réplication d’ADN complémentaire du brin à séquencer, pour réaliser cette dernière il est nécessaire de disposer d’une amorce (court enchainement de désoxyribonucléitides) ayant une séquence de bases complémentaires à une partie (extrémité 3’) de la molécule d’ADN à séquencer, des dNTPs et une enzyme appelée ADN polymérase qui incorpore de nouvelles bases de nucléotides, faisant ainsi un nouveau brin d’ADN conforme à l’original. La réaction de Sanger repose sur l’incorporation aléatoire par cette ADN polymérase d’un didésoxyribonucléotides (ddNTP) (Figure 11) interrupteurs de chaines. Figure.11 : Structure d’un didésoxyribonucléotide. 22 Dr.Bouasla.I  Préparation de l’ADN  Découpage et isolement du fragment d’ADN à séquencer  Séparation des brins  Préparation de l’amorce  Hybridation/élongation On réalises des copies du monobrin à séquencer par une PCR, ces copies sont ensuite séparées en quatre tubes contenant chacun, le monobrin à séquencer et son amorce, une ADN polymérase et les quatre désoxyribonucléotides dNTP (dCTP, dATP,dTTP et dGTP). Ensuite, dans chaque préparation (tube), on met de petites quantités d’un didésoxyribonucléotide (ddNTP). Ces derniers sont marqués radioactivement.  Séparation des fragments par électrophorèse  Lecture de l’électrophorèse La révélation des séquences synthétisées dans les quatre tubes se fait par autoradiographie. L’enchainement nucléotidique lu à partir du gel représente la séquence d’ADN synthétisée à partir de la séquence initiale à séquencer pour déterminer la séquence initiale il suffit d’estimer la séquence complémentaire(Figure 12). 23 Dr.Bouasla.I Brin d’ADN à séquencer Amorce Séquence lu= brin synthétisé Cathode - Séquence du brin initiale=brin séquencer Anode + Sens de migration Figure. 12 : Séquençage par la méthode de Sanger (enzymatique). 24