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[ **LEZIONE 6**] **[11.03]** **[1\^ PARTE]** **L'AMBIENTE COLTURALE** **[L'AMBIENTE COLTURALE:]** Parliamo di tutto l'insieme di parametri che ci permettono di ottimizzare la nostra coltura I principali parametri che influenzano l'ambiente di questa coltura sono: - - - - 1. Come...

[ **LEZIONE 6**] **[11.03]** **[1\^ PARTE]** **L'AMBIENTE COLTURALE** **[L'AMBIENTE COLTURALE:]** Parliamo di tutto l'insieme di parametri che ci permettono di ottimizzare la nostra coltura I principali parametri che influenzano l'ambiente di questa coltura sono: - - - - 1. Come abbiamo già detto, possiamo dividere le colture con cellule che crescono in adesione, e cellule che crescono in sospensione. Le cellule che crescono in adesione, tendono a crescere in monostrato fino ad arrivare ad uno stato di confluenza. Abbiamo delle eccezioni, in quanto, a differenza delle cellule che crescono in adesione, le cellule emopoietiche, insieme a quelle tumorali crescono in sospensione. Queste crescono senza bisogno dell'ancoraggio ad un substrato per crescere. Le cellule che quindi crescono in monostrato hanno bisogno di ancorarsi ad un substrato e infatti, se non lo avessero, potrebbero morire (es. cellule epiteliali). Queste vanno ad assumere una morfologia allungata (spread out) per sopravvivere e proliferare: sono considerate, infatti, **ancoraggio-dipendenti.** Con un substrato di coltura, noi, vogliamo andare a mimare la condizione in cui queste cellule si trovano all'interno dell'organismo, dove appunto trovano una **matrice extracellulare**, oppure una **membrana basale**, alla quale le cellule si ancorano. Non sempre però la proliferazione è il principale obiettivo: spesso si usano speciali substrati dove le cellule proliferano più lentamente, ma si riesce a ricreare un ambiente tridimensionale più simile a quello in vivo. **[TIPOLOGIE DI SUBSTRATO: ]** Ci concentriamo su **substrati solidi**. Come ad esempi la plastica. Il **vetro** è stato usato in passato, per le sue proprietà ottiche, di trasparenza, perché dava la possibilità di visualizzare le cellule al microscopio (esigenza primaria per le colture cellulari, perché queste devono essere monitorate quotidianamente). Questo è stato sostituito dall'uso di materiale usa e getta, come ad esempio le piastre petri, che sono materiali prodotti appositamente per le colture cellulari. Questi sono venduti in confezioni incartate, sterili, che non possono essere riciclate e devono essere buttate dopo l'uso. Sono fatte di materiale plastico, prevalentemente **polistirene**, o altre plastiche con proprietà ottiche compatibili con l'utilizzo per colture cellulari per la visualizzazione al microscopio. Il vetro ha ancora alcune applicazioni (es. **chamber slides**). **[NATURA DEL SUBSTRATO COLTURALE:]** Abbiamo anche dei vari tipi di plastica che vengono sfruttati per il substrato: - - - - Il polistirene, come tale, è una molecola idrofobica e apolare, e le cellule che crescono in adesione, hanno bisogno di un substrato polare (che richiama la membrana basale e la matrice extracellulare). Quindi, la plastica di per sé non è un supporto idoneo alle cellule che crescono con un supporto di adesione. Questa viene infatti trattata chimicamente (es. plasma/gas), e conferisce alla superficie di plastica, che se no sarebbe apolare, una polarità. In particolare permette di modificare chimicamente la piastra, aggiungendo dei gruppi carbonilici o ossidrilici, conferendo alla piastra una carica netta negativa. Questa condizione, permette l'adesione vera e propria delle cellule che appunto crescono in adesione. In realtà, non tutti i tipi di plastica che vengono venduti come colture cellulari, sono trattati per conferire al substrato una polarità, ma nei laboratori e anche in vendita, si possono trovare anche dei supporti non trattati che servono per: - - Un esempio è il fatto che in alcuni laboratori, si sfrutta la **polilisina**, ovvero una soluzione che è formata da piccole catene di **lisina**. Come tali, queste presentano una carica **positiva**. È possibile trattare una superficie di supporto di coltura, con questa polilisina, che si lega al supporto di coltura, conferendo una carica positiva che conferisce poi di conseguenza l'adesione delle cellule in coltura. Il supporto quindi, non per forza deve avere una carica negativa (come detto prima), ma può avere anche delle cariche diverse che dipendono dal trattamento che sfruttiamo per la preparazione del substrato di coltura. Il trattamento che si usa varia in base al tipo cellulare e alle condizioni ottimali di crescita, di adesione e di coltura di quel tipo cellulare. **[TIPI DI RECIPIENTI DI COLTURA:]** 1. Dobbiamo innanzitutto inserire il sacchetto nella cappa biohazard, ma prima bisogna pulirlo con etanolo al 70%, onde evitare che ci sia una contaminazione che veicoli l'esperimento. A questo punto, introdotta la confezione sotto cappa, dobbiamo estrarre la piastra cercando di mantenere la sterilità di tutto il resto del contenuto. (Bisogna controllare nella scatola, per vedere se una piastra è trattata o meno) La plastica del recipiente ha una scadenza, che tendenzialmente si riferisce alla data fino alla quale è garantita la sterilità, piuttosto che al trattamento della superficie. Ci sono varie tipologie di piastre che si possono incontrare: - **Vanno tendenzialmente dai 35 mm fino alle più usate, ovvero da 150 mm.** Le piastre non sono solo tonde, ma possono essere anche quadrate, che hanno una superficie di crescita ancora superiore. È importante anche sapere che dal diametro del supporto (in mm), possiamo ricavare l'area in cm^2^ sulla quale far crescere la cellula. Si può anche ricavare la resa indicativa delle cellule in un determinato supporto e il volume in ml di terreno che dobbiamo utilizzare in questo supporto. Nella tabella sovrastante, viene anche inserito il volume ottimale (averange). Questo è il volume della fase liquida, che si trova nelle colture di cellule disperse o nelle colture di organo e di tessuti. Questa fase liquida, è costituita dal terreno, nel quale si trovano nutrienti e anche gas (O~2~, CO~2~..). Questo valore è importante, perché viene calcolato e riportato in funzione della colonna di liquido che si trova sulle nostre cellule che crescono in adesione (o anche in sospensione). Questa colonna di liquido si forma anche grazie al terreno di coltura sopra alle nostre cellule e deve avere una certa altezza per portare a un certo scambio di gas. Quindi, ad esempio, è importante mantenere le cellule di 5mm, in un volume ottimale oltre un certo range, per evitare, appunto che la colonna di liquido nella coltura sia eccessivamente alta da non permettere lo scambio di gas, oppure il rischio, ad esempio, se abbiamo in una piastra da 100 mm, un volume di terreno di 4 ml, di trovare il giorno dopo le cellule quasi a secco. Questo è dovuto anche al fatto che nell' incubatore ci potrebbe essere un'evaporazione parziale del terreno, quindi che il liquido sia poco per la crescita delle cellule nel modo corretto. Nella tabella viene inoltre inserita l'area di crescita delle cellule, che è importante, in quanto, quando andiamo ad allestire una coltura (primaria oppure una subcultura), bisogna contare le cellule, allestire la coltura, calcolando quando mettere le cellule nel recipiente di coltura. *Ma come valutiamo questo parametro?* Viene fatta una conta, e poi viene deciso di allestire una subcultura (es. 105.000 cellule *x* ml), quindi si esprime la concentrazione con (cellule *x* ml oppure cellule *x* cm^2^ ---\> quest'ultima unità di misura viene usata di più per le cellule che crescono in adesione). Quindi se dobbiamo allestire una subcultura di cellule in una piastra, dovremo sapere quale recipiente usare e quale superficie di crescita fornisce, per calcolare quante cellule mettere nella nostra subcultura. Ad esempio, se abbiamo una piastra da 100 mm, e abbiamo 55 cm^2^ e vogliamo piastrare le cellule ad una densità di 100.000 cellule *x* cm^2^, *quante cellule piastriamo?* Contiamo le cellule che abbiamo staccato dalla coltura che avevamo, e le contiamo. Le cellule devono essere piastrate in una piastra da 100mm, con una densità di 100.000 cellule *x* cm2, e abbiamo una superficie da 55 cm^2^. Le cellule quindi saranno **5 milioni e mezzo**. 2. - - - - - - Per capire quante cellule inserire in un pozzetto, bisogna fare il ragionamento di prima e usufruire della densità cellulare richiesta nel momento in cui viene allestita la coltura. In funzione del numero di cellule con cui dobbiamo allestire una coltura, bisogna scegliere il substrato adeguato. Queste piastre sono un supporto molto utilizzato perché tendenzialmente in laboratorio, dobbiamo confrontare una linea cellulare e non trattata rispetto magari ad una o due trattate (es. una con un farmaco, una con l'altro, oppure con l'insieme dei due farmaci). I pozzetti, infatti, ci aiutano di visualizzare in **parallelo** nello stesso recipiente tutte le condizioni sperimentali che il nostro esperimento prevede. 3.  Si usano anche le fiasche, che sono dei recipienti di coltura, che spesso sostituiscono le piastre e hanno una diversa accessibilità. Infatti, quando bisogna inserire la pipetta dall' imboccatura delle fiasche, questo influenza il modo in cui le maneggiamo sotto cappa. L'uso delle piastre sotto cappa, è più maneggevole in quanto subito accessibile. Questo però porta una maggiore contaminazione da parte della coltura. Con le fiasche questo succede molto meno. Le fiasche hanno **3 formati:** - - **Anche qui il recipiente viene scelto in base al numero di cellule che servono per ogni coltura.** Il **tappo** delle fiasche, si definisce **ventilato**, in quanto non è interamente di plastica, ma presenta un filtro di materiale sintetico con delle porosità di 0.20 micron, che non permette quindi i possibili passaggi dei microrganismi contaminanti nella coltura. (Sulla fiasca si ha una linea che indica il livello massimo di volume possibile, onde evitare delle contaminazioni per il contatto del liquido con il tappo) Questi tappi, ci permettono di mantenere la fiasca nell' incubatore con il tappo **chiuso**, perché la porosità porta alla liberazione comunque di gas. Se il tappo fosse interamente di plastica, dobbiamo manipolare la coltura sotto cappa biohazard: 1. 2. I tappi ventilati sono stati costruiti per evitare maggiormente l'effetto di contaminazione. Aprire un tappo, appunto potrebbe portare continuità tra esterno ed interno con un alto rischio di contaminazione 4. Sono un supporto che come le piastre multipozzetto sono compartimentalizzate in un numero diverso di compartimenti che ci permettono di allestire in parallelo diversi pozzetti sullo stesso supporto. Sono composte da un **vetrino**, che di solito è di plastica (anche trattata; oppure sono di vetro). Viene allestita su di essa la coltura ed ogni pozzetto è separato dal blocco di plastica sovrastante, ed è isolato da tutti gli altri. Vengono usate perché finite le nostre colture, possiamo utilizzare il vetrino sul quale è attaccata la chamber slides, e dove sono cresciuti dei campioni diversi, e usarli direttamente come tali per studi di immunofluorescenza. *Come facciamo?* Le cellule crescono in adesione e sono adese al vetrino. Viene tolto il blocco di plastica che costituisce i set di pozzetti. Questo perché tutto il blocco sopra al vetrino è legato con un filo di silicone, e come tale si può staccare. Una volta staccato il blocco, abbiamo sul vetrino i nostri *n* pozzetti, che possono essere processati in parallelo, con varie metodologie (es. fissazione, permeabilizzazione, marcazione con un anticorpo,...) Abbiamo il grande vantaggio, in questo modo, di avere su un unico vetrino un insieme di pozzetti che posso appunto studiare in parallelo per lo stesso esperimento. Avere tanti vetrini diversi, non permette di avere la stessa riproduzione tecnica delle stesse condizioni di incubazione, fissazione, colorazione,... 5. Queste sono usate per allestire delle colture su ampia scala. Sono dei recipienti di coltura a base circolare che vengono adagiate in un incubatore fatto apposta, e queste ci permettono di allestire grandi quantità delle nostre colture. (Molto usati in ricerca). *Come allestiamo la coltura?* Lo facciamo come facciamo per una fiasca, solo che abbiamo le bottiglie. Queste, vengono poi adagiate sull'incubatore. La superficie di crescita delle nostre cellule, è rappresentata dalla parete delle bottiglie. Nell' incubatore, queste ruotano e la loro continua rotazione fa si che ci sia un velo di liquido di coltura, che copre continuamente tutta la nostra coltura, stabilendo una condizione ottimale di crescita, massimizzando lo scambio gassoso. - Esistono dei diversi recipienti che differiscono per l'area (cm^2^) e anche per la crescita. *[In base a cosa scegliamo il recipiente?:]* La scelta viene fatta in base alle esigenze tra varie misure di fiasche, piastre petri e piastre multipozzetto: - - - - - **[TIPI DI SUBSTRATO:]** a. - - - - - - b. *Come viene allestito un feeder layers?* Viene fatta crescere una piastra/fiasca di fibroblasti e si aspetta che questi arrivino quasi a confluenza (monitorando durante i giorni tutto il processo, per poi andare a trattare il monostrato di fibroblasti in modo da bloccare la proliferazione). Il trattamento può essere fatto con **mitomicina** (trattamento chimico) o **irraggiamento** (trattamento fisico). L'irraggiamento prevede che le cellule vengano trattate con raggi X, che sono dosati in modo da non uccidere le cellule, ma servono solo per fermarne la proliferazione. I fibroblasti così non proliferano più, ma sono delle cellule vive, quindi producono delle molecole di adesione sulla loro superficie e producono dei fattori trofici, che supportano la crescita della linea cellulare che verrà aggiunta sopra a quella del feeder layers. Quindi il feeder layers è formato da cellule vive, ma dal punto mitotico sono quiescenti. Questo è importante perché i fibroblasti del feeder layers non vadano in competizione di nutrienti con le cellule che devono essere inserite sopra al fe nn eder layer. *Quindi le cellule non vanno mai incontro ad apoptosi?* In tutto il processo, viene preparato il feeder layers, che viene irradiato. Vengono poi aggiunte le cellule epiteliali sopra di esso e una volta esaurita la coltura di cellule epiteliali, deve essere pronto un altro recipiente con il feeder layer. A un certo punto, quindi, questo feeder layer degenera, però dà un lasso di tempo prima di questa degenerazione, sufficiente per donare un supporto trofico alla linea cellulare che vuoi allestirci sopra. Una alternativa, al normale feeder layer, è quello nel quale vengono usate delle cellule gliali sulle quali vengono inserite delle cellule di neuroni. **[2\^ PARTE]** c. - - - - Vengono de di organizzazione tridimensionale, rispetto al monostrato che possiamo definire bidimensionale di adesione. d. Alcuni di questi substrati semisolidi vengono conservati allo stato liquido a 4° e poi polimerizzano solo a 37°. Alcuni esempi possono essere il matrigel, che ha una consistenza liquida ma polimerizza solo nel momento in cui viene messo tra i 20-40°. Quindi, allestiamo la nostra coltura con le cellule in matrigel, mettiamo il nostro sopporto di coltura con il matrigel liquido e le cellule nell'incubatore a 37°, questa temperatura fa si che il matrigel polimerizzi per dare questo substrato semisolido. Lo stesso avviene per il collagene: lo possiamo trovare in laboratorio a 4°, come soluzione; tuttavia, polimerizza quando viene posto a temperatura ambiente o a 37°. **[SUPPORTI TRIDIMENSIONALI PER COLTURE]** Vediamo alcuni esempi di supporti tridimensionali per colture. - *Come possiamo utilizzare un gel di fibrina per una coltura di cellule?* Nell'immagine è rappresentato un pozzetto nel quale è stata allestita una base di gel di fibrina sul fondo del pozzetto, dopodiché andiamo a mettere insieme il gel di fibrina, che sarà allo stato liquido, e le nostre cellule, indicate come embryoid body, in modo da permettere la polimerizzazione della fibrina e in modo che le nostre cellule siano incluse nel gel di fibrina. Mettiamo a 37° il nostro gel di fibrina, per far si che polimerizzi e le nostre cellule rimangono incluse nel gel. A questo punto aggiungiamo anche un terreno liquido che fornirà i nutrimenti per la crescita delle cellule. Oppure possiamo trovare altri terreni semisolidi di coltura, nei quali sono già presenti tutti i nutrienti per la coltura, e di conseguenza non sarà necessario aggiungere una fase liquida. Gli **embryoid bodies** sono delle strutture che si possono ottenere in coltura a partire da cellule staminali embrionali. Le cellule staminali embrionali sono cellule pluripotenti, cioè in grado di dare origine a tutte le strutture di un embrione, e quindi di originare in vitro le cellule di tutti i foglietti embrionali, ovvero ectoderma, mesoderma e esoderma. Gli embryoid bodies possono essere allestiti in vitro a partire da cellule staminali embrionali oppure dalle **iPS** (Induced Pluripotent Stem Cell): cellule staminali in cui la pluripotenza è indotta mediante una manipolazione che prevede la veicolazione di una serie di geni che sono stati identificati come responsabili della pluripotenza. - Il matrigel è costituito da un estratto di proteine di un sarcoma murino, particolarmente ricco di proteine della matrice extracellulare, come ad esempio la laminina e il collagene IV. Può essere utilizzato per fare crescere le cellule in una coltura tridimensionale, in questo caso di cellule da un tumore mammario. Quello che viene rappresentato nella figura b è il comportamento di cellule epiteliali mammarie normali, oppure tumorali, in un supporto tridimensionale che potrebbe essere il matrigel. Le cellule epiteliali mammarie normali crescono nel supporto tridimensionale e ad un certo punto della proliferazione della coltura, per una questione di scarsa ossigenazione delle cellule più interne alla struttura tridimensionale, le cellule interne andranno in contro ad apoptosi per generare una struttura con una cavità interna, che mima la struttura dei dotti acinali mammari. Gli acini mammari presentano una struttura con membrana basale sulla quale aderiscono cellule epiteliali mammarie, che delimitano un dotto, ovvero una struttura che presenta una cavità. Questo è quello che riusciamo a mimare, di una struttura presente nell'organismo, con una coltura tridimensionale allestita a partire da cellule epiteliali normali. Se invece utilizziamo cellule epiteliali da un tumore mammario quello che otteniamo sarà una crescita incontrollata, che non andrà a definire, mediante il meccanismo di apoptosi che è deregolato nel tumore, la struttura cava che vedevamo delle cellule normali. Quindi continueranno a crescere in modo disorganizzato come un'unica massa che non presenta una cavità. Queste informazioni non potremmo ottenerle dalla semplice coltura monostrato in adesione su una piastra. **Estratto di un foglio illustrativo di un supporto tridimensionale rappresentato da un gel di collagene.** Ci permette di allestire colture tridimensionali che possono essere visualizzate al microscopio a contrasto, oppure con una lampada a fluorescenza che ci permette di valutare la fluorescenza di una proteina fluorescente espressa delle cellule che abbiamo in coltura. Quindi, senza fissare e di conseguenza bloccare la nostra coltura, possiamo in vivo andare a rilevare alcune caratteristiche delle nostre cellule che crescono in questa matrice tridimensionale. Le cellule possono essere fissate e colorate direttamente dalla matrice, senza dover estrarre le cellule dalla matrice, per visualizzare la coltura com'è nella sua condizione tridimensionale che abbiamo in vitro. Oppure, se abbiamo la possibilità di recuperare in sterilità le cellule, possiamo recuperare le cellule dalla coltura tridimensionale del collagene e andare a fare ulteriori colture o processarle, preservando la sterilità di ciò che andiamo a recuperare. **[ISTRUZIONI PER ALLESTIRE UNA COLTURA:]** È riportato un protocollo in cui le cellule possono essere cresciute sul supporto di collagene. In questo caso il protocollo prevede di pipettare un volume di collagene raffreddato (perché il collagene è liquido a 4° e polimerizza a temperatura ambiente), inserirlo nel pozzetto e poi lo si mette subito a 37° perché ciò permette di ottenere la polimerizzazione del gel di collagene. Dopodiché aggiungiamo le cellule e il terreno di coltura. In alternativa le cellule possono essere cresciute incluse nel gel, come abbiamo visto nel gel di fibrina. In questo caso mettiamo insieme un piccolo volume di cellule con il volume di collagene pre-raffreddato, poi poniamo questa mix a 37°, in modo da permettere la polimerizzazione del gel, che avrà incluso al suo interno le cellule della nostra coltura. Quindi questi supporti tridimensionali possono essere usati come substrati sui quali le cellule possono crescere, mediante il collagene, oppure in supporti nei quali far crescere le cellule come cloni, in cui sono inseriti completamene all'interno di un supporto di coltura semisolido, in questo caso il collagene. - Un altro tipo di supporto tridimensionale è la spugna di cellulosa. Si chiama spugna perché ha una porosità di 80-150 [μm]{.math.inline} uniforme. In queste porosità crescono le strutture tridimensionali, come gli sferoidi. Gli **sferoidi** sono delle strutture tridimensionali sferiche che alcuni tipi cellulari possono generare in un appropriato supporto di coltura, in questo caso la spugna di cellulosa. È di cellulosa perché è un supporto inerte, quindi non impatta in nessun modo sulla crescita delle nostre cellule (non impatta sulla vitalità e sulle caratteristiche di crescita delle cellule), però permette a queste cellule di organizzarsi in strutture tridimensionali, come sono gli sferoidi ovvero strutture sferiche generate nella maggior parte dei casi da cellule epiteliali. Spesso queste strutture sferoidali si organizzano in modo da dare luogo ad un epitelio polarizzato, quindi con una porzione apicale, quella verso il lume, e una basolaterale, verso lo spazio extracellulare e/o il circolo ematico. Quindi anche queste strutture tridimensionali, gli sferoidi, possono dare luogo in vitro ad un epitelio che avrà una polarizzazione. **[COMPOSIZIONE DELLA FASE GASSOSA:]** Un secondo componente importante è rappresentato dalla fase gassosa. - Per le colture di tessuto o di cellule disgregate, la pressione parziale di ossigeno necessaria per la coltura non è diversa da quella presente nell'atmosfera. Quindi le colture di tessuto e di cellule disgregate non necessitano di impostare nell'incubatore una pressione parziale di ossigeno diversa da quella atmosferica. Le uniche condizioni in cui è necessario avere un'alta pressione parziale di ossigeno è rappresentato dalle colture d'organo, nelle quali andiamo a cercare di preservare la struttura di un organo con diversi tipi cellulari coesistenti. In questa coltura d'organo viene allestita all'interfaccia tra liquido e gas e questo tipo di coltura necessita di un'interfaccia liquido-gas per massimizzare lo scambio di gas, in particolare per cercare di ossigenare al meglio le cellule del frammento di tessuto, che ovviamente non hanno un'ossigenazione che viene dal circolo ematico. Questo richiede pressioni parziali di ossigeno particolarmente alte, circa il 95% della fase gassosa. Ma queste colture di organo hanno un'applicazione molto limitata. È importante rispettare i volumi di terreno che sono indicati nelle tabelle viste precedentemente perché è importante avere una certa colonna di liquido sopra la nostra coltura (siamo tornati nelle colture che crescono in monostrato), in quanto la colonna di liquido, allestita sopra le nostre cellule, influenza lo scambio di ossigeno, quindi c'è un range ottimale di volume di terreno per [cm^2^]{.math.inline}nelle colture statiche. Le **colture** **statiche** sono colture in cui le cellule vengono mantenute ferme, a differenza di quelle dinamiche come le Roller bottles. Quando abbiamo parlato del controllo del pH (e del rosso fenolo presente), avevamo visto alcune cause di alterazioni del pH, come ad esempio contaminazioni batteriche che possono ridurre il pH, e al contrario contaminazioni fungine che possono aumentarlo. Questo si traduce con un viraggio del colore del terreno dal rosso-arancio, che rappresenta il pH ottimale a 7.2/7.4 del terreno di coltura, ad un colore più giallo se il pH cala o ad un colore più fucsia se questo aumenta. Però, non necessariamente un viraggio del colore del terreno di coltura ci dice che è presente una contaminazione. Alcune variazioni del pH possono dipendere dalla condizione della nostra coltura: quando le cellule sono molto fitte e hanno eliminato tanti prodotti dal loro catabolismo, questi prodotti tendono ad acidificare il terreno e far virare il colore del terreno verso il giallo. Quindi il colore giallo non per forza ci dice che c'è una contaminazione batterica, ci può dire anche che è ora di cambiare il terreno di coltura o di allestire una subcultura. Perché in cellule ad alta confluenza il pH tende ad acidifcarsi? Perché: - - - **CO~2~** Un altro gas importante per la nostra coltura è la [CO~2~]{.math.inline}. Si va con una bombola di [CO~2~]{.math.inline}, ad integrare l'apporto di [CO~2~]{.math.inline}, in modo da raggiungere circa un 5%, ad una percentuale variabile, rispetto a quella che è la percentuale di [CO~2~]{.math.inline} nell'atmosfera, che è circa dello 0,04%. Perché è importante la CO~2~ nelle condizioni di coltura? È importante perché è un componente fondamentale di un sistema tampone molto economico e molto utilizzato nei terreni di coltura. Il sistema tampone è sempre costituito da un acido debole e dal sale della base coniugata, oppure da una base debole e il sale dell'acido coniugato. In questo caso è costituito dall'acido carbonico, che è presente nel terreno di coltura perché la [CO~2~]{.math.inline}, presente nell'atmosfera dell'incubatore, si discioglie nel terreno di coltura, poiché ogni gas ha una certa solubilità nel terreno di coltura, che è influenzata dalla pressione atmosferica e dalla temperatura. Quindi la solubilità della [CO~2~]{.math.inline} è influenzata ovviamente dalla temperatura. La [CO~2~]{.math.inline} nel terreno di coltura reagisce con l'acqua per dare acido carbonico, che sarà in parte dissociato come ioni carbonato e ioni H+. La [CO~2~]{.math.inline} presente nell'atmosfera dell'incubatore ci serve per avere l'acido carbonico disciolto nel terreno di coltura e la sua disponibilità sarà influenzata dalla solubilità di [CO~2~]{.math.inline} del gas nel terreno liquido, che dipende a sua volta dalla temperatura. L'aumento della pressione di [CO~2~]{.math.inline} all'interno dell'incubatore, rispetto a quella che è la pressione parziale di [CO~2~]{.math.inline} nell'atmosfera, definisce un'acidificazione del terreno di coltura perché determina l'aumento dell'acido carbonico presente nel terreno di coltura, che è un acido debole. Noi sfruttiamo questo acido carbonico per utilizzare un sistema tampone costituito da una parte dall'acido carbonico e dall'altra dal sale della base coniugata, quindi bicarbonato di sodio, che è presente nel terreno di coltura. Il bicarbonato di sodio è sempre essenziale nel terreno di coltura, se quest'ultimo sfrutta questo sistema tampone, e può essere anche una fonte energetica per le cellule. Quindi da una parte la produzione di acido carbonico, grazie alla [CO~2~]{.math.inline} presente nell'incubatore, ci permette di acidificare il terreno di coltura, dall'altra parte la presenza nel terreno di coltura di una concentrazione adeguata per avere un equilibrio tra acido carbonico e bicarbonato di sodio, ci permette di avere un sistema tampone che controlla e mantiene il pH attorno a quello che è il pH ottimale di coltura, che è 7.4 circa. **[COMPOSIZIONE DELLA FASE GASSOSA - pH]** Se 7.4 circa è il pH ottimale, un'acidificazione implica un viraggio verso il giallo. Una colorazione di questo tipo ci dice che dobbiamo cambiare a breve il terreno di coltura o che c'è il rischio di contaminazione o che dobbiamo cambiare immediatamente il terreno di coltura per evitare che le nostre cellule vadano in sofferenza. Mentre un viraggio verso il fucsia può suggerire non solo una contaminazione fungina, ma anche che nell'incubatore non c'è un sufficiente apporto di [CO~2~]{.math.inline}, per un problema legato all'incubatore o alla bombola. Perché se nell'incubatore non c'è un adeguato apporto di [CO~2~]{.math.inline}, cala l'acido carbonico nel nostro sistema tampone e quindi il pH si sposta verso un aumento. La temperatura influenza la solubilità di un gas nel liquido, quindi in questo caso la solubilità della [CO~2~]{.math.inline}. Quindi all'aumentare della temperatura cala la solubilità della [CO~2~]{.math.inline} nel terreno di coltura, viceversa al calare della temperatura aumenta la solubilità della [CO~2~]{.math.inline}, e di conseguenza si può avere una modifica del pH del terreno. **[PRORPIETÀ FISICHE DEL TERRENO DI COLTURA:]** Abbiamo già parlato del controllo del pH. - - - - - - **[COMPOSIZIONE CHIMICA DEL TERRENO DI COLTURA:]** 1. Una soluzione salina bilanciata è l'**HEPES buffered saline (HBS)**. l'HEPES è un sistema tampone, quindi una componente di questa soluzione salina bilanciata è un tampone. Oltre al tampone abbiamo dei sali che hanno lo scopo di fornire l'osmolarità ottimale della soluzione. L'HEPES ha alcuni svantaggi: sebbene controlli il pH molto bene entro il range fisiologico, anche meglio del sistema bicarbonato di sodio-[CO~2~]{.math.inline} (può temporaneamente sostituire l'apporto di CO~2~); tuttavia è molto costoso ed è fotosensibile, cioè se esposto alla luce si degrada e produce delle sostanze tossiche, in particolare perossido di idrogeno, il quale è tossico per le nostre cellule. Altre composizioni saline bilanciate utilizzate sono raffigurate in questa tabella: - Una soluzione salina bilanciata che vedremo frequentemente utilizzata nei laboratori è il **PBS**. Il **‎**PBS è una soluzione salina bilanciata che fornisce una serie di sali, che garantiscono l'osmolarità, insieme ad una coppia di molecole che costituiscono il sistema tampone, che serve a controllare il pH di questa soluzione salina bilanciata.\ In questo caso il sistema tampone è un tampone fosfato costituito da [Na~2~HPO~4~]{.math.inline}, che è presente in entrambe le varianti riportante per il PBS, e il sale dell'acido coniugato che è [KH~2~PO~4~]{.math.inline}, insieme ad una serie di altri sali che servono per garantire l'osmolarità, quindi una condizione di isotonicità rispetto a quella che c'è nelle nostre cellule. Quindi è una soluzione salina basata sul tampone fosfato da cui prende il nome PBS (Phosphate Buffered Solution, soluzione tamponata col fosfato). Esistono due varianti: una senza calcio e magnesio e un'altra con calcio o magnesio. Utilizzeremo una o l'altra in funzione di quello che dovremo fare, ad esempio se dobbiamo fare un'incubazione delle nostre cellule con DNasi, che è un enzima che dipende dal magnesio, in questo caso ci servirà avere un PBS che apporti calcio e magnesio affinché avvenga la digestione da parte della DNasi. In alternativa ci troveremo in condizioni di dover eliminare il calcio e magnesio, in modo da sequestrare dalla nostra coltura tutto il calcio, che è fondamentale per la funzione di alcune molecole di adesione, quindi utilizzeremo PBS senza calcio e magnesio. **[PBS E DPBS:]** PBS è la prima versione di questa soluzione salina bilanciata (è anche la più usata) e sulla base di questa formulazione è stata poi sviluppata da Renato Dulbecco una modifica della composizione di PBS per dare una soluzione che prende il nome di **DPBS**, dove la D sta per Dulbecco's modified PBS. Sostanzialmente ci sono piccole modifiche di concentrazione di due composti, che sono l'acido e il sale della base coniugata, che costituiscono il sistema tampone fosfato. [Il concetto che dobbiamo sapere è che PBS e DPBS non sono la stessa cosa,] ma sono una composizione salina bilanciata con alcune modifiche rispetto alla composizione originale. Oltre alla PBS abbiamo altre soluzioni saline bilanciate utilizzate per colture cellulari che sono: - **EBSS**🡪 è una soluzione salina bilanciata che non apporta grandi nutrienti, quindi non può essere utilizzata per mantenere le cellule in coltura. Tuttavia porta una serie di sali e un sistema tampone e necessita di [CO~2~]{.math.inline} per mantenere il pH, in quanto abbiamo un sistema tampone composto da [CO~2~]{.math.inline} e bicarbonato di sodio. Quindi questa soluzione salina bilanciata, affinché mantenga il pH ottimale nelle nostre cellule, necessita di un apporto di [CO~2~]{.math.inline}. - ‎**PBS o DPBS** 🡪 mantiene il pH con un altro sistema, ovvero il sistema tampone fosfato, per cui non sarà necessario un apporto di [CO~2~]{.math.inline}, quindi potrà essere utilizzato in presenza della percentuale di [CO~2~]{.math.inline} presente nell'atmosfera. - ‎**HBSS** 🡪 è una soluzione salina bilanciata che utilizza come sistema tampone il tampone fosfato, di cui abbiamo parlato prima, quindi contiene [Na~2~HPO~4~]{.math.inline} e [KH~2~PO~4~]{.math.inline}. Può essere utilizzata per trasportare cellule o inviare cellule da un laboratorio all'altro, quindi per trasporti che prevedano il mantenimento delle cellule nel terreno di coltura per ore. In queste condizioni è importante garantire un apporto di glucosio alle cellule, che è una fonte energetica fondamentale per le nostre cellule. In questo caso quindi possiamo utilizzare HBSS perché, oltre ai sali e al tampone fosfato, contiene anche glucosio. 2. - - - - - - Il terreno dipende dai protocolli presi in laboratorio: se vogliamo mantenere la staminalità, oppure dal tipo cellulare o a quanto vogliamo portare la nostra coltura. Questo è un discorso generale e ci sono quindi un sacco di terreni diversi, che ci possono appunto servire in laboratorio. Esistono numerosi terreni di coltura ed in questa tabella vengono riportati una serie di terreni che possono essere prevalentemente classificati in 4 categorie principali:  - - - - Per molti terreni di queste categorie c'è un terreno prototipo della categoria dal quale poi sono stati generati gli altri terreni, 'derivati', della stessa categoria. Un esempio dell'evoluzione a partire da un terreno di altri terreni è esemplificato dal Minimal essential medium (MEM) dal quale poi è stato formulato il Dulbecco's modified minimal essential medium (DMEM) e da questo è derivato poi l'IMDM che sta per Iscove\'s Modified Dulbecco\'s modified minimal essential medium. **[DMEM:]** Il DMEM è più ricco rispetto al MEM, infatti presenta una concentrazione doppia per la maggior parte degli amminoacidi. Di questo terreno inizialmente era stata fatta una formulazione con una quantità di glucosio di 1 g/L, rispetto al quale c'è stata una successiva evoluzione con una concentrazione di glucosio molto più alta, ovvero di 4,5 g/L. Per cui, per quanto riguarda il DMEM è importante che andiamo sempre a controllare se è etichettato come "high glucose" o come "low glucose" perché in funzione del tipo cellulare che abbiamo in cultura abbiamo l'esigenza di utilizzare un DMEM con bassi (1 g/L) o alti (4,5 g/L) livelli di glucosio. Questo perché la quantità di glucosio ottimizza la crescita di determinate cellule, ma può essere anche tossica: non sempre e non necessariamente un apporto di glucosio superiore è positivo per la cellula. Ad esempio per le cellule mesenchimali è necessario utilizzare un DMEM con basso glucosio perché l'apporto eccessivo di glucosio è tossico per le cellule. Non è un terreno completo e non fornisce tutti i nutrienti necessari per le cellule, quindi necessita di essere addizionato con serio. Ad esempio un 5-10% del terreno sarà costituito da siero bovino fetale, che è uno dei tipi di siero di origine animale più utilizzato. **[RPMI-1640:]** RPMI-1640 è un altro terreno che deriva dal McCoy's 5A ed è stato formulato al Roswell Park Memorial Institute, da cui prende il nome (RPMI).\ L'RPMI-1640 è stato formulato specificamente per la coltura a lungo termine di cellule emopoietiche e soprattutto linfociti. **[MEM:]** Il Minimal Essential Medium (MEM) è uno dei terreni con la composizione più basic che sia disponibile e deve essere addizionato con l'aggiunta di siero. **[HAM'S NUTRIENT MIXTURE:]** Poi abbiamo la famiglia di terreni formulati da Ham's, quindi Ham's F10 o F12, i quali sono terreni particolarmente ricchi e permettono una coltura in condizioni serum-free. **[IMDM:]** Altri terreni molto utilizzati sono l'IMDM e sono utilizzati per cellule emopoietiche, linfociti B e linfociti T, quindi per cellule che crescono in sospensione. L'IMDM è stato formulato a partire dal DMEM ed è un terreno particolarmente ricco di nutrienti, quindi può essere utilizzato per la crescita in condizioni di serum-free. **[DMEM/F12:]** È una mix di due terreni diversi che sono il DMEM e l'Ham's F12, quindi è un terreno con una composizione molto ricca ed è formulato per condizioni di terreno di colture serum-free. In questa tabella è riportata la concentrazione di bicarbonato di sodio (NaHCO~3~) presente in una serie di terreni di coltura. Possiamo notare che la concentrazione di bicarbonato di sodio è variabile ed è particolarmente alta nel DMEM, cioè, per avere una condizione di equilibrio tra i due componenti che costituiscono il sistema tampone di cui abbiamo parlato ([CO~2~]{.math.inline}-bicarbonato di sodio), necessiterebbe di incubatori che forniscono il 10% di [CO~2~]{.math.inline}, quindi una pressione parziale di [CO~2~]{.math.inline} più alta rispetto a quella comunemente usata nei laboratori. In realtà, nonostante queste siano le indicazioni per il DMEM, la maggior parte dei laboratori utilizza condizioni di coltura in DMEM con incubatori settati al 5%, questo, però, può influire parzialmente sul pH effettivo della coltura. La quantità di bicarbonato di sodio è un importante substrato per il metabolismo cellulare, ma è anche un importante componente per i terreni di coltura che utilizzano questo sistema tampone per controllare il pH del terreno di coltura. In alternativa, potremo avere altri terreni di coltura che utilizzano altri sistemi tampone, e di conseguenza non necessitano di un apporto di [CO~2~]{.math.inline}.