LEZIONE 5 (10-03-2022).docx

***TRASPORTO DI MEMBRANA DI PICCOLE MOLECOLE*** ***LEZIONE 5*** ***10/03/2022*** Il flusso di un soluto attraverso un doppio strato lipidico dipende da: - - Nella retta che mostra la permeabilità di diverse sostanze, vediamo le molecole classificate in funzione del loro coefficiente di per...

***TRASPORTO DI MEMBRANA DI PICCOLE MOLECOLE*** ***LEZIONE 5*** ***10/03/2022*** Il flusso di un soluto attraverso un doppio strato lipidico dipende da: - - Nella retta che mostra la permeabilità di diverse sostanze, vediamo le molecole classificate in funzione del loro coefficiente di permeabilità; quindi, un parametro che esprime la capacità di attraversare una membrana. La maggiore è quella dell'ossigeno, una molecola piccola e apolare a cui corrisponde un massimo coefficiente di permeabilità. L'acqua ha un coefficiente di permeabilità inferiore rispetto a quello dell'ossigeno. Seguono poi, con coefficienti di permeabilità minori, altre molecole che sono parzialmente polari e neutre, di dimensioni maggiori rispetto alle molecole precedenti, come urea, glicerolo, glucosio e triptofano. Il minor coefficiente di permeabilità è riferito a ioni, quindi molecole piccole dotate di una carica elettrica. Le membrane cellulari sono selettivamente permeabili: questa permeabilità passiva selettiva è una proprietà fondamentale per il mantenimento di un equilibrio costante tra citosol e ambiente extracellulare e tra citosol e lume degli organelli. Quindi, la capacità di una sostanza di attraversare una membrana dipende: dal suo coefficiente di permeabilità, che a sua volta dipende dalla lipofilia e dalla dimensione di questa molecola; e dalla differenza di concentrazione tra i 2 compartimenti definiti dalla membrana. In funzione del coefficiente di permeabilità di una sostanza, perciò, possiamo classificare una serie di molecole di interesse biologico in: - - - - La membrana cellulare è permeabile ai gas e a piccole molecole polari, che passano per **diffusione semplice,** secondo gradiente di concentrazione, senza bisogno di energia o di proteine di trasporto. Poiché il doppio strato lipidico è impermeabile alla maggior parte delle molecole idrosolubili e ancor più agli ioni (a causa della carica e del livello di idratazione) devono esistere dei meccanismi di trasporto per queste molecole e il più importante è il processo di **diffusione facilitata.** Nella categoria di molecole idrofobiche che attraversano facilmente la membrana ci sono anche gli ormoni steroidei che sono molecole molto più grandi, ad esempio dell'ossigeno e dell'azoto, ma che riescono comunque ad attraversare la membrana per diffusione semplice, tra queste rientra anche la vitamina D. ***Cosa media la diffusione facilitata?*** È mediata da complessi proteici che attraversano un doppio strato lipidico. Questi complessi proteici possono rientrare in due grandi categorie: - - ***Diffusione semplice vs diffusione facilitata*** Sia i trasportatori che i canali mediano sistemi di trasporto facilitato, ovvero la diffusione facilitata. Questo in contrasto con la diffusione semplice che riguarda molecole che attraversano spontaneamente il doppio strato fosfolipidico che costituisce una membrana. *Diffusione facilitata:* Data la differenza di concentrazione tra un lato e l'altro della membrana delle molecole (gradiente di concentrazione); quest'ultime spontaneamente, attraverso il doppio strato lipidico oppure attraverso pori idrofilici definiti dai canali e dai trasportatori, tendono a seguire un flusso che va dal comparto in cui presentano una maggiore concentrazione al comparto in cui presentano una minore concentrazione. Quindi, una qualsiasi molecola che presenti una differenza di concentrazione tra un compartimento e l'altro separato da una membrana tende a passare dal compartimento in cui presenta una concentrazione maggiore a quello in cui presenta una concentrazione minore. - - *[Il tipo di molecola che prendiamo in considerazione va ad influenzare il tipo di trasporto]:* - - 1. 2. Nel caso a sinistra non c'è una differenza di potenziale elettrico tra i due lati della membrana; quindi, questi ioni possono attraversare la membrana, mediante uso di trasportatori, seguendo solo il loro gradiente di concentrazione (il gradiente di concentrazione degli ioni è l'unico fattore che determina il flusso di questi ioni attraverso la membrana semipermeabile). Quando invece, come nella membrana plasmatica delle cellule, è presente una differenza di potenziale elettrico tra i 2 lati della membrana, quest'ultima influenzerà il flusso dello ione. Come possiamo osservare nel caso sulla destra, il flusso degli ioni sarà influenzato sicuramente dalla differenza di concentrazione, ma sarà influenzato anche dalla carica elettrica presente ai due lati della membrana, definita ad esempio dalla presenza di altri cationi o anioni (questa differenza di potenziale elettrico ai due lati della membrana favorirà il flusso degli ioni da un compartimento all'altro della membrana). La dimensione della freccia nell'immagine mi indica l'entità del flusso che in questi casi è influenzata dalla differenza di potenziale del doppio strato lipidico che il soluto deve attraversare, oltre che dal gradiente di concentrazione. Consideriamo quindi i due fattori gradiente di concentrazione e gradiente elettrico, definito dalla differenza di potenziale elettrico; in questi casi, quando avremo a che fare con delle molecole cariche, parleremo di gradiente elettrochimico. ***A cosa corrisponde nella cellula eucariotica?*** Nel complesso le cellule contengono un uguale quantità di cariche positive e negative fra i 2 compartimenti della membrana, ma queste cariche sono spesso compartimentalizzate. Ad esempio, nel reticolo endoplasmatico viene accumulato calcio e quindi quest'ultimo accumula cationi che presentano, invece, una bassa concentrazione nel citosol. Quindi, all'interno di una cellula eucariotica avremo differenze di concentrazione tra il citosol e lo spazio extracellulare, ad esempio per quanto riguarda il calcio: il calcio è più concentrato nello spazio extracellulare, oppure nel lume del reticolo endoplasmatico, di quanto non sia nel citosol. Tra gli altri ioni importanti troviamo: il sodio, che presenta una concentrazione più elevata nello spazio extracellulare, cioè nettamente superiore rispetto all'interno della cellula; e il cloro, che è anch'esso più concentrato nello spazio extracellulare rispetto al citosol. Quindi sodio Na, Cl e Ca sono più concentrati nello spazio extracellulare rispetto a quanto non siamo all'interno della cellula. Al contrario, il potassio è maggiormente concentrato nel citosol rispetto allo spazio extracellulare. ***Trasporto attivo*** I trasportatori mediano sempre una diffusione facilitata, talvolta un trasporto passivo e tal volta un trasporto attivo. Il trasporto attivo implica consumo di energia, la quale può derivare dall'idrolisi dell'ATP, oppure dalla presenza di un gradiente di concentrazione di un particolare soluto (ionico o protonico) tra due compartimenti della cellula. Il soluto da trasportare è indicato in giallo e presenta un gradiente di concentrazione più elevata nello spazio extracellulare rispetto allo spazio citosolico (trasporto contro gradiente). *Tipologie di trasporto attivo*: 1. 2. 3. *Tipologie di trasportatori accoppiati[:]* 1. 2. *[Il trasporto attivo può essere spinto da gradiente di concentrazione di ioni:]* Nella slide abbiamo un gradiente di concentrazione elettrochimico di ioni sodio Na^+^, i quali presentano una concentrazione elevata nello spazio extracellulare e minore nel citosol. Ci troviamo quindi di fronte ad un sistema di trasporto attivo che permette alla cellula di internalizzare glucosio contro gradiente, essendo il glucosio più concentrato all'interno della cellula rispetto a quanto non sia nello spazio extracellulare, sfruttando il gradiente degli ioni sodio. Quindi in questo caso abbiamo un trasportatore accoppiato simporto, perché gli ioni sodio che forniscono l'energia per far funzionare questo sistema di trasporto e le molecole di glucosio si muovono nella stessa direzione, cioè dallo spazio extracellulare al citosol. Questo movimento prevede una modificazione conformazionale del simporto (del trasportatore) che, dopo il legame degli ioni sodio e del glucosio, assume una conformazione chiusa prima di assume una conformazione che permette il rilascio delle 2 molecole all'interno della cellula. Questo passaggio per una conformazione chiusa è fondamentale perché non venga dissipato il gradiente di sodio che la cellula dovrà sfruttare per queste e altre funzioni: se la modifica conformazionale a cui va incontro il trasportatore non passasse per uno stadio chiuso, allora potrebbe esserci una conformazione che prevede la dispersione di questo gradiente, che deve invece la cellula deve mantenere. Questo sistema di simporto glucosio-sodio è un esempio di una categoria più ampia di trasportatori che mediano il trasporto di zuccheri o amminoacidi sfruttando il gradiente di sodio; questo avviene prevalentemente in cellule epiteliali renali e intestinali, che hanno un'importante funzione di assorbimento di glucosio e altri nutrimenti dal lume dell'intestino o dal lume dei tubuli renali. Ad esempio, in questa immagine viene mostrato un eritrocita a livello dell'[epitelio intestinale] un simporto sodio-glucosio che media il trasporto del glucosio sfruttando l'energia del gradiente di sodio dal lume dell'intestino (nel quale c'è un'alta concentrazione di glucosio derivata dalla digestione dei nutrienti). Questo glucosio ha un importante fonte energetica per tutto l'organismo: è fondamentale che le cellule epiteliali assorbano questo glucosio e lo internalizzano. Il glucosio risulta più concentrato nel citosol piuttosto di quanto lo sia nel lume: quindi, a livello del compartimento vaso laterale della membrana non abbiamo difficoltà per il passaggio di glucosio, in quanto si diffonde secondo gradiente mediante una diffusione facilitata tramite un trasportatore simporto accoppiato glucosio-sodio. Situazioni analoghe possiamo trovarle a livello dell'[epitelio di rivestimento dei tubuli renali] che hanno la stessa funzione importante per quanto riguarda l'assorbimento di aminoacidi. Questi ultimi, filtrati a livello renale, vengono riassorbiti dalle cellule del tubulo prossimale attraverso diversi trasportatori. Analogamente, trasportatori sulla membrana apicale di cellule epiteliali intestinali mediano l'assorbimento di aminoacidi dal lume. Quindi, sia a livello intestinale che a livello renale, l'internalizzazione di aminoacidi dal lume dell'intestino o di un tubulo renale contro gradiente (visto che sono più concentrati all'interno della cellula rispetto all'esterno), è mediata da sistemi di trasporto attivo di simporto che sfruttano prevalentemente gradienti di ioni sodio, oppure gradienti protonici. Ad esempio, gli aminoacidi neutri potranno essere importati a livello delle cellule epiteliali del tubulo prossimale contro gradiente sfruttando di nuovo il gradiente di ioni sodio Na^+^; mentre altri amminoacidi, come ad esempio glicina, prolina e alanina, potranno essere importati nelle cellule renali grazie a un sistema di simporto che sfrutta un gradiente protonico. **Trasportatori che regolano il pH citosolico** Sistemi di trasporto che sfruttano dei gradienti ionici sono importanti anche nelle cellule eucariotiche per regolare il pH del citosol. La regolazione del pH del citosol è molto importante per la cellula perché la maggior parte delle attività del catabolismo cellulare porta la produzione di sostanze acide che determinano un'acidificazione del citosol, la quale impatterebbe sulla funzione della cellula. [Che sistemi utilizza la cellula per regolare il pH citosolico, quindi regolare il flusso in uscita o in entrata di ioni H^+^ in funzione della necessità di regolazione del pH?] 1. 2. 3. Questi sono solo alcuni dei principali sistemi che utilizza la cellula per controllare il pH, ma ne esistono altri. Il pH intracellulare, tra l'altro, non è regolato solo da questi sistemi, ma ci sono alcuni compartimenti intracellulari, come ad esempio i lisosomi, che richiedono per la loro funzione una forte acidificazione del pH del lume dell'organell, questa acidificazione viene effettuata utilizzando dei sistemi che sfruttano delle pompe protoniche per mantenere il pH particolarmente acido in determinati compartimenti intracellulari rispetto a quello che è il pH del citosol (pH = 7,2 con piccole variazioni in base ai punti di letteratura). **Proteina della banda 3** Quello che nella foto è etichettata come antiporto Cl^-^/HCO~3~^-^ è una proteina che abbiamo già incontrato nella scorsa lezione ed è la **proteina della banda 3** presente negli eritrociti. Abbiamo parlato del sistema di proteine citosolico in prossimità della membrana plasmatica dell'eritrocita, che è importante per mantenerne la forma e la funzione, e una di queste proteine è proprio rappresentata dalla banda 3 che è una proteina integrale di membrana. La banda 3, oltre a essere una componente principale di questo complesso di proteine, importante per la morfologia dell'eritrocita, è anche un antiporto. È inoltre importante negli eritrociti per mediare la funzione di trasporto della CO~2~ dai tessuti periferici al polmone.  **Nei capillari periferici:** [Come avviene questo trasporto di CO~2~ a livello dell'eritrocita?] Siamo a livello dei capillari periferici, quindi alta pressione parziale di CO~2~ e bassa pressione parziale di Ossigeno. In queste condizioni l'emoglobina, presente all'interno dell'eritrocita, rilascia l'ossigeno che tende a diffondere spontaneamente, in funzione del suo gradiente di concentrazione, dall'interno all'esterno dell'eritrocita (diffusione semplice dell'ossigeno in un ambiente extracellulare con una bassa pressione di ossigeno). Al contempo, abbiamo detto che nello spazio extracellulare questo eritrocita trova un'alta concentrazione di CO~2~ che, come tale, tende a entrare spontaneamente, sempre per diffusione semplice, attraverso la membrana plasmatica dell'eritrocita. La CO~2~ a livello del citosol dell'eritrocita reagisce con una molecola di H~2~O per dare una reazione catalizzata dall'anidrasi carbonica, per dare quindi luogo alla produzione di HCO~3~^-^ (ione bicarbonato o carbonato acido) e di uno ione H^+^. Lo ione H+ prodotto si lega alla molecola dell'emoglobina che nel frattempo ha rilasciato l'ossigeno; mentre, lo ione HCO~3~^-^ esce attraverso l'antiporto di cui abbiamo parlato che possiamo trovare etichettato come proteina ***AE1*** (banda 3 o antiporto Cl^-^/HCO~3~^-^). È quindi grazie a questo antiporto a livello periferico che l'HCO~3~^-^ formato all'interno dell'eritrocita per azione dell'anidrasi carbonica viene espulso dall'eritrocita. **Nei capillari polmonari:** A livello polmonare invece la situazione è diversa; nel senso che abbiamo un\'alta pressione parziale di ossigeno e una bassa pressione parziale di CO~2~. A livello polmonare l'eritrocita deve liberarsi della CO~2~ (che viene espulsa mediante l'espirazione) e caricare ossigeno. L'espulsione della CO~2~ per diffusione semplice attraverso la membrana eritrocitaria fa sì che l'equilibrio di questa reazione, catalizzata dall'anidrasi carbonica, si sposti verso la produzione di CO~2~. È la stessa reazione di prima ma viene catalizzata dall'anidrasi carbonica: prima l'abbiamo vista nella direzione di produzione di HCO~3~^-^ a livello periferico; in questo caso invece la possiamo osservare a livello polmonare dove la pressione parziale di CO~2~ è bassa. La CO~2~, infatti, tende ad uscire dall'eritrocita e la riduzione della concentrazione di CO~2~ all'interno dell'eritrocita, sposta l'equilibrio di questa reazione verso la produzione di CO~2~ partendo da HCO~3~^-^ come substrato (HCO~3~^-^ viene fornito alla cellula attraverso l'antiporto di cui abbiamo parlato prima). Quindi la banda 3 è una proteina strutturale dell'eritrocita, ma ha anche un importante ruolo funzionale per il trasporto dell'ossigeno e l'eliminazione della CO~2~ da parte dell'eritrocita. Ci siamo focalizzati su questa proteina perché ha un'importante funzione fisiologica nella fisiologia del trasporto della CO~2~ da parte degli eritrociti. Quindi la proteina della banda 3 è un esempio applicativo di concetti di diffusione semplice e di diffusione facilitata attraverso, in questo caso, un sistema che è un antiporto. Negli eritrociti, lo stesso sistema di antiporto funziona in una direzione oppure nell'altra in funzione del gradiente di concentrazione dello ione HCO~3~^-^. Quindi, è lo stesso sistema di antiporto che in un caso permette la fuoriuscita di HCO~3~^-^ e nell'altro la sua internalizzazione. **[POMPE SPINTE DA ATP (POMPE ATPasi)]** Quando abbiamo parlato di trasporto attivo, oltre ai sistemi di trasporto accoppiato, abbiamo fatto riferimento a quelle che sono le pompe spinte dall'idrolisi dell'ATP. Quest'ultime possono essere classificate in: 1. 2. 3. 4. **POMPE DI TIPO P** Abbiamo visto che la prima categoria dell'ATPasi è rappresentata da pompe di tipo P. Rientrano in questa categoria pompe che generano gradienti di protoni o altri cationi come K^+^, Na^+^, Ca^2+^. - - **TRASPORTATORI ABC**  I trasportatori ABC mediano il trasporto di piccoli soluti. Questi sono presenti: - - Gli ABC transporters [negli eucarioti] hanno un importante ruolo nel processo di progressione tumorale, perché sono in grado di mediare l'estrusione di alcuni farmaci neoplastici determinando un meccanismo di resistenza per le cellule tumorali. Possiamo quindi incontrare nelle cellule tumorali modificazioni dell'espressione di questi ABC transporters. Il prototipo degli ABC transporters, il primo caratterizzato e associato alla progressione tumorale, è *MDR1,* che si chiama anche *ABCD1*. MDR1 sta per *Multi Drug Resistance*, quindi resistenza multi farmaco, perché questa molecola insieme ad altri ABC transporters rappresenta dei sistemi che le cellule tumorali possono sfruttare per espellere ciò che per loro è tossico, cioè i farmaci chemioterapici. Ad esempio, vinblastina, vincristina, pacitaxel, sono farmaci antineoplastici la cui esclusione dal citosol allo spazio extracellulare può essere mediato da questi sistemi di trasporto. Dicevamo invece che gli ABC transporters [nei procarioti] possono mediare l'esportazione o l'importazione, in entrambe le direzioni, di soluti. In questo caso è esemplificata l'importazione di un soluto che attraversa una porina: le porine sono complessi proteici molto grandi e non selettivi presenti nella membrana esterna; quindi, questo soluto rappresentato in rosso può attraversare una porina spontaneamente. Nello spazio periplasmatico la molecola rossa è legata ad una proteina che ne veicola il trasporto e l'ABC transporter nella membrana interna della cellula procariotica ne media l'internalizzazione. Quello che nei procarioti può essere internalizzato può essere costituito da un nutriente, come ad esempio: aminoacidi, polisaccaridi, zuccheri semplici e proteine.  **[ACQUAPORINE]** Abbiamo parlato anche di acquaporine, cioè canali per l\'acqua. Le acquaporine, come tutti i canali, mediano un metodo di trasporto passivo lungo gradiente di una molecola, quindi il trasporto che mediano non implica un consumo di energia sotto forma di idrolisi di ATP. Hanno una loro selettività, in particolar modo la parte interna del poro, cioè quella che viene in contatto con il soluto trasportato, presenta una selettività in grado di riconoscere e distinguere uno ione rispetto a un altro o una molecola rispetto a un\'altra. Le acquaporine in quanto canali sono permeabili e selettive per l'acqua, ma non fanno passare ioni. Tutte le cellule presentano questi canali con differenza di espressione in base alla funzione cellulare: questo livello di espressione delle acquaporine sarà esaltato al massimo nelle cellule che hanno bisogno di trasportare grandi quantità di acqua, come possono essere le cellule epiteliali dei reni o intestinali, oppure le cellule con funzioni secretorie a livello del pancreas esocrino. **[PRESSIONE OSMOTICA]** In questa slide troviamo una descrizione del concetto della pressione osmotica.  La pressione osmotica è importante nella fisiologia della cellula in quanto influenza il volume cellulare. Variazioni importanti di pressione osmotica possono determinare la lisi della cellula o il suo raddrizzamento; quindi, forti modificazioni del volume della cellula possono portare alla morte della cellula stessa o comunque a una sofferenza. Invece, piccole variazioni delle condizioni osmotiche extracellulari possono tradursi, in cellule animali che ad esempio non hanno una parete come le cellule vegetali, in un forte rigonfiamento o raddrizzamento della cellula. [Ad esempio cosa può accadere?] - - [Qual è la condizione ottimale?] Una **soluzione isotonica** costituita ad esempio da NaCl 0,15 M. È la condizione isotonica che ci permette di avere un equilibrio osmotico tra l\'interno e l\'esterno della cellula che non si traduce in un raggrinzimento o in un rigonfiamento della cellula. Anche in soluzione isotonica le cellule hanno la necessità di controllare il loro volume, in quanto, come abbiamo visto, ci sono continue modificazioni del flusso di ioni in entrata e in uscita (perché la cellula sfrutta questi gradienti per creare anticorpi) e questo cambia la concentrazione di ioni all\'interno della cellula. Questo determina una tendenza della cellula, se aumenta la concentrazione di ioni al suo interno, ad assorbire un determinato flusso d\'acqua per osmosi, questo processo può provocare un rigonfiamento della cellula stessa. Anche per questo motivo è fondamentale la pompa Na^+^-K^+^-ATPasi che mantiene i gradienti ionici importanti affinché la cellula si mantenga anche in una soluzione isotonica. Da qui possiamo dedurre che, anche in condizioni fisiologiche all\'interno dell\'organismo, la pompa sodio-potassio ATPasi è importante non solo per mantenere i gradienti che sono fondamentali per diverse funzioni cellulari, ma anche perché la cellula possa mantenere il suo volume per una questione di equilibri osmotici. **CANALI IONICI** I canali ionici mediano un trasporto passivo che non implica un dispendio di energia. Sappiamo però che questi canali non sono sempre aperti, allora come fanno a chiudersi senza utilizzare energia? Vanno incontro a una serie di modificazioni conformazionali che ne determinano l'apertura o la chiusura. [Da cosa può essere influenzata questa apertura e chiusura dei canali?] Ci sono diverse tipologie di canali regolati da diversi fattori: 1. 2. 3. **POTENZIALE DI MEMBRANA** Il potenziale di membrana è riassunto nella slide; nelle quale viene spiegato che cos'è il potenziale di membrana e come viene generato all'interno di una cellula. La generazione di un potenziale di membrana dipende dal movimento selettivo di ioni attraverso la membrana stessa. Seguendo l'immagine: - - - [Il concetto qual è?] Questa situazione è molto semplificata, perché riferita a una membrana permeabile a uno ione sodio oppure a uno ione potassio; nella realtà all'interno della cellula si osserva un processo molto più complicato. Quello che nella foto vedete esemplificato per un singolo ione, sulla membrana plasmatica di una cellula viene reso molto più complesso dalla co-presenza di canali per diversi ioni, che presentano quindi una diversa permeabilità. La permeabilità, insieme alle differenze di concentrazione tra l'interno e l\'esterno della cellula di questi ioni, andrà a definire quello che è il potenziale di membrana della cellula stessa. Quindi il potenziale di membrana di una cellula deriva dalla somma di flussi definiti da diverse permeabilità dovute a diversi canali di diversi ioni. Nelle cellule animali il potenziale di membrana dipende principalmente da particolari canali di potassio e dalla differenza di concentrazione di ioni potassio tra l\'interno e l\'esterno della cellula. [Perché dipende principalmente dal potassio K^+^?] Perché ci sono dei canali del potassio detti liti (*Potassium Liti Channels*), che sono particolarmente permeabili al potassio e contribuiscono in modo importante a definire il potenziale di membrana della cellula. Tuttavia, questo potenziale di membrana è influenzato dalla permeabilità di altri canali ad altri ioni e quindi dalle differenze di concentrazione. ***IL* POTENZIALE DI MEMBRANA IN CELLULE ANIMALI** Il potenziale di membrana in cellule animali dipende principalmente dai canali che perdono K+ e dal gradiente di ioni K+ attraverso la membrana plasmatica Un potenziale di membrana si crea quando c'è una differenza di cariche elettriche ai 2 lati della membrana, differenza derivante da un pompaggio elettrogenico attivo (pompe elettrogeniche) a da diffusione ionica passiva (canali). - - Nella cellula c'è poco Na^+^ quindi altri cationi devono entrare per compensare le cariche negative degli anioni organici fissi (es. acidi nucleici, fosfoproteine, nucleotidi fosforilati). Questo bilanciamento è svolto principalmente dal K+, che entra: 1. 2. **GRADIENTI IONICI E POTENZIALE DI MEMBRANA** - - - -