Klinische Chemie 1 Instrumentele Technologie PDF 2024-2025 Past Paper

Klinische chemie I: Instrumentele technologie Academiejaar 2024-2025 Gobin, V. Klinische chemie I: Instrumentele technologie © 2023, Gobin, V. Odisee Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze digitale uitgave mag worden verveelvoudig...

Klinische chemie I: Instrumentele technologie Academiejaar 2024-2025 Gobin, V. Klinische chemie I: Instrumentele technologie © 2023, Gobin, V. Odisee Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze digitale uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, en/of openbaar gemaakt in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door printouts, kopieën, of op welke andere manier dan ook, zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van de auteur en/of uitgever. Op deze regel bestaat slechts één uitzondering: elke student die ingeschreven is voor het vak waarin deze tekst wordt gebruikt, mag voor persoonlijk gebruik twee exemplaren laten uitprinten of zelf uitprinten. www.odisee.be Inhoudsopgave Hoofdstuk 1 Potentiometrie _______________________________________________3 1 Inleiding _____________________________________________________________3 2 Elektroden ___________________________________________________________3 3 Toepassingen _______________________________________________________ 8 4 Literatuurlijst _______________________________________________________13 Hoofdstuk 2 UV/VIS spectrometrie _______________________________________ 14 1 Algemene beschouwingen ___________________________________________ 14 2 Absorptie van EMS __________________________________________________ 16 3 Emissie van EMS ____________________________________________________ 20 4 Andere interactiemechanismen _______________________________________ 23 5 Absorptiemetingen in het zichtbare en ultraviolette gebied _______________ 27 Hoofdstuk 3 Luminescente spectrometrie __________________________________51 1 Inleidende begrippen _________________________________________________51 2 Chemische principes ________________________________________________ 52 3 Instrumentatie _____________________________________________________ 58 4 Toepassingen van fluorescentie _______________________________________ 59 Voorwoord In deze cursus worden drie veelvoorkomende analysetechnieken binnen de klinische chemie besproken, met name potentiometrie, UV/VIS spectrofotometrie en luminescente spectrometrie. Daar waar potentiometrie behoort tot de elektrochemische methoden, zijn UV/VIS en luminescente spectrometrie beiden technieken gebaseerd op de absorptie/emissie van elektromagnetische straling. Potentiometrie kent voornamelijk toepassingen binnen de klinische chemie voor het bepalen van ionen in lichaamsvloeistoffen zoals bloed, urine of cerebrospinaal vocht. Enkele voorbeelden zijn de bepaling van elektrolyten zoals natrium, kalium, chloride en calcium voor het beoordelen van de elektrolytbalans, de nierfunctie, hartfalen of diabetische ketoacidose. Daarnaast berust ook pH bepaling op het principe van potentiometrie, hetgeen zijn toepassing kent in het opsporen van acidose of alkalose. Verder kunnen met behulp van potentiometrie bloedgassen zoals zuurstof en CO2 bepaald worden. UV/VIS spectrofotometrie kan gebruikt worden voor een zeer divers toepassingsgebied, waarbij veelal kleurreagentia worden toegevoegd om een gekleurd product te verkrijgen na reactie met de te bepalen factor. Een voorbeeld hiervan is de bepaling van het totale eiwitgehalte in serum met behulp van de biureetmethode. Andere toepassingen binnen de klinische chemie zijn de kwantitatieve bepaling van creatinine in serum en urine voor de diagnose of opvolging van nierfalen; de bepaling van bilirubine in serum in het kader van geelzucht en leveraandoeningen; de bepaling van glucose, hemoglobine en HbA1c in bloed (na hemolyse van erythrocyten) in het kader van diabetes etc. Luminescente spectrometrie kent toepassingen voor het bepalen van geneesmiddelconcentraties in bloed of serum (vaak gekoppeld aan HPLC), voor het bepalen van biomerkers, voor DNA-bepalingen, voor immunologische kleuringen etc. 2  Hoofdstuk 1 Potentiometrie 1 Inleiding Onder potentiometrie verstaan we het stroomloos meten van het potentiaalverschil tussen twee elektroden of halfcellen die een galvanische cel vormen nl. een welgekozen indicator- of meetelektrode en een referentie-elektrode. Het gemeten potentiaalverschil berust op de wet van Nernst. Voor de theorie rond de wet van Nernst wordt verwezen naar OPO ‘Chemie II’. 0,059 [ox]𝑥 Potentiaalbetrekking van Nernst: U = U0 + log n [red]𝑦 De toepassingen van potentiometrie zijn tweeledig: enerzijds kan d.m.v. directe potentiometrie de concentratie van een ion in een oplossing bepaald worden. Anderzijds kan potentiometrie worden aangewend voor de detectie van het equivalentiepunt bij titratie. 2 Elektroden 2.1 Indicator- of meetelektroden 2.1.1 Ion-selectieve elektroden (ISE) Ion-selectieve elektroden worden gebruikt om een specifiek ion in een oplossing te bepalen. Het principe van een ion-selectieve elektrode berust op de aanwezigheid van een ion-selectief membraan, dat een verschillende potentiaal oplevert afhankelijk van de concentratie van het te bepalen ion. Ion-selectieve elektroden kunnen bestaan uit 1 halfcel, waarbij de potentiaal gemeten wordt t.o.v. een referentie-elektrode (zie 2.2), of kunnen voorkomen als gecombineerde elektrode, waarbij de referentie-elektrode reeds geïntegreerd zit in 1 geheel met de meet-elektrode. Verschillende types ion-selectieve elektroden zijn beschikbaar, waaronder vaste kristalmembranen, vloeibare membranen en glasmembranen. Het typische meetbereik van ISE elektroden situeert zich tussen 10-6 en 10-1 mol/l. 2.1.1.1 Vaste kristalmembraan elektroden De ion-selectieve membraan bestaat in dit geval uit een vaste, kristallijne stof. De belangrijkste vertegenwoordiger van dit type is de fluoride-elektrode, waarbij de membraan een lanthaanfluoridekristal (LaF3) is, gedopeerd met europium(II)fluoride om de elektrische weerstand van de membraan te verlagen. De LaF3-membraan vertoont een uitstekende selectiviteit voor F--ionen. Een ander voorbeeld van een vaste kristalmembraan elektrode is de Cl- elektrode. Het membraan is in dit geval een geperst plaatje AgCl. De elektrode is echter niet geheel selectief voor Cl-, maar ondervindt ook interferentie van OH-. Aangezien AgCl gevoelig is 3  voor licht, moeten Cl- elektroden in een donker recipiënt bewaard worden. Cl- elektroden kennen ook een zekere gevoeligheid voor I- en Br-. In klinische analyses vormt dit doorgaans geen probleem, aangezien deze ionen niet voorkomen in urine of serum stalen. Vaste kristalmembraan elektroden zijn ook beschikbaar voor Ag, Cu, Cd, Pb, S, en Br. Als algemene regel geldt dat deze vaste kristalmembraan-elektroden niet geconditioneerd moeten worden. Ze kunnen droog bewaard worden en zijn onmiddellijk klaar voor gebruik. 2.1.1.2 Vloeibare membraan elektroden Bij dit type elektroden is een ion-selectieve component ingebed in een matrix, doorgaans een polymeer membraan zoals PVC. Een voorbeeld van een vloeibare membraan elektrode is de calcium elektrode, het actieve materiaal is hier het calciumzout van dodecylfosforzuur dat opgelost is in diacetylfenylfosfaat. Deze vloeistof bevindt zich ook in de poreuze membraan en is niet mengbaar met water. Een tweede voorbeeld is de kalium elektrode, de ionenuitwisselaar in deze elektrode is valinomycine. Er ontstaat een uitwisseling van K+ ionen tussen de membraan en de vloeistof waarin de elektrode gedompeld wordt. Een gelijkaardige uitwisseling treedt ook op aan de binnenzijde van de membraan met de inwendige referentievloeistof. Door deze uitwisseling treedt een ladingsverschil op, dat enkel en alleen bepaald wordt door de concentratie aan K+ in de uitwendige oplossing wanneer de concentratie van de referentie-oplossing constant blijft. In het algemeen geldt dat vloeibare membraan elektroden erg kwetsbaar zijn, en gemakkelijk beschadigd kunnen worden door vallen of stoten. Bovendien zijn ze gevoelig voor organische solventen, die de membraan kunnen doen zwellen of de actieve component uit de membraan kunnen extraheren. 2.1.1.3 Glasmembraan elektroden 2.1.1.3.1 pH elektrode Een veel gebruikte groep elektroden zijn de glasmembraan elektroden, met als belangrijkste vertegenwoordiger de pH elektrode. De elektrode bestaat uit een glazen schacht met aan het uiteinde een zeer dunne (±0,05 mm) glazen membraan die gevoelig is voor H+ ionen. De buitenkant van dit glasmembraan vormt een gellaag zodra het membraan in contact komt met de waterige oplossing. Een gelijkaardige gellaag wordt ook gevormd aan de binnenkant van het glasmembraan, aangezien de elektrode gevuld is met een waterige elektrolytoplossing. Een schematische voorstelling van de glasmembraan elektrode wordt gegeven in Figuur 1. 4  Dunne wand Figuur 1. glaselektrode De H+ ionen in en rond de gellaag kunnen in of uit deze laag diffunderen, al naargelang de pH-waarde en dus ook de H+ ionenconcentratie van de gemeten oplossing. Als de oplossing alkalisch is, diffunderen de H+ ionen uit de laag en ontstaat een negatieve lading aan de buitenkant van het membraan. Aangezien de glazen elektrode een interne buffer met een constante pH-waarde heeft, blijft de potentiaal aan de binnenkant van het membraan tijdens de meting constant. De potentiaal van de pH-elektrode is dus het verschil tussen de binnenste en buitenste lading van het membraan. U = 0,059 log [H+]1 - 0,059 log [H+]2 waarin 1 = onbekende oplossing x mol/l 2 = inwendige oplossing 1 mol/l Uit bovenstaande vergelijking kan worden afgeleid dat de potentiaal gelijk zou moeten zijn aan nul wanneer de concentratie aan H+ aan de binnenzijde en buitenzijde van de membraan gelijk is. Dit is echter meestal niet het geval. Het spanningsverschil dat gemeten wordt in deze omstandigheden, noemt men de assymetriepotentiaal en wordt wellicht bepaald door de kromming van het glas. [H+]1 U = ? + 0,059 log [H+]2 [H+]1 U = K + 0,059 log = K + 0,059 log [H+] = K – 0,059 pH 1 Het best gekende H+-gevoelige glas is het Mac Innes glas of Corning 015 glas. De samenstelling is benaderend als volgt : 72 % SiO2, 22 % Na2O en 6 % CaO. Dit type glas vertoont een uitstekende selectiviteit t.o.v. H+ tot ongeveer pH = 9. Bij hogere pH- waarden zal de membraanpotentiaal ook mede bepaald worden door Na+ en andere alkali-ionen (vnl. K+) (zie ook 3.1.1.2 Selectiviteit). Deze afwijking, die alkalifout genoemd wordt, kan sterk verminderd worden door Na2O in het glas te vervangen door Li2O; hiermee kan men betrouwbare metingen verrichten tot pH = 13. Een glaselektrode geeft slechts een stabiel en reproduceerbaar signaal na voldoende "weektijd" in water. Het ontstaan van de gehydrateerde gellaag is van fundamenteel belang voor de goede werking van de elektrode. Daarom is het ook noodzakelijk dat de 5  glaselektrode, bij metingen in niet-waterige media, regelmatig in water geplaatst wordt om opnieuw te hydrateren. Het bewaren van de glaselektrode kan gebeuren in zuiver water of een verdunde HCl oplossing. 2.1.1.3.2 Na+ elektrode Naast de pH elektrode is ook de Na+ gevoelige elektrode een veel gebruikte glasmembraan elektrode. De samenstelling van het glas is in dit geval anders, waardoor de selectiviteit voor Na+ toeneemt. Net zoals bij de pH elektrode, is de glasmembraan niet 100% selectief voor Na+, maar ook gevoelig voor H+. Daarom dient de concentratie Na+ voldoende hoog te zijn in vergelijking met de concentratie H+. Als richtlijn geldt dat de pH minstens 4 eenheden hoger moet zijn dan de pNa+. Anders geformuleerd, moet de H+ concentratie minstens 1000x kleiner zijn dan de Na+ concentratie. Bij een Na+ concentratie van 1 mmol/L, moet de H+ concentratie dus kleiner zijn dan 1 µmol/L, wat overeenkomt met een pH van minstens 6. Een veelgebruikte toepassing in de klinische chemie is de bepaling van Na+ in urine. Aangezien urine een pH 4-5 heeft, is aanpassing van de pH voor analyse noodzakelijk. Daarnaast is de Na+ elektrode ook gevoelig voor K+. De gevoeligheid voor Na+ is 100 à 1000 keer hoger dan voor K+. Bij klinische analyses vormt deze gevoeligheid doorgaans geen probleem, aangezien biologische stalen doorgaans een veel hoger gehalte aan Na+ dan aan K+ bevatten. 2.1.1.4 Gasgevoelige elektroden Naast de bovengenoemde ion-selectieve elektroden, zijn ook elektroden beschikbaar voor het meten van gassen. Deze elektroden zijn gebaseerd op een waterafstotend membraan dat wel gassen maar geen water doorlaat. De CO2 elektrode bv. laat CO2 door, dat vervolgens in contact komt met een inwendige HCO3- oplossing waarin een gecombineerde pH elektrode geplaatst wordt. In de inwendige vloeistof treedt de volgende reactie op: CO2 + H2O ↔ HCO3- + H+ De hoeveelheid H+ die gevormd wordt, is hierbij evenredig met de hoeveelheid CO2 die doorheen de membraan diffundeert. De CO2 elektrode meet dus eigenlijk de hoeveelheid H+ die gevormd wordt door reactie van CO2 met water. Gelijkaardige elektroden zijn beschikbaar voor NH3 en HF. 2.1.2 Redox elektroden (ORP) Redox elektroden of oxidatie-reductiepotentiaal (ORP)-elektroden meten het vermogen van een oplossing om als oxidatie- of reductiemiddel te fungeren. Ze bevatten een inert metaal (doorgaans platina), dat zelf niet reageert maar dat een verschillende potentiaal oplevert afhankelijk van de redox reactie die doorgaat in de oplossing waarin ze gedompeld worden. Dit type elektroden vindt een toepassing in potentiometrische titratie (zie 3.2). 6  2.2 Referentie-elektroden De potentiaal van een elektrode kan niet als dusdanig gemeten worden, men kan enkel het potentiaalverschil meten t.o.v. een andere elektrode. Wanneer de potentiaal van de andere elektrode constant is, kan het gemeten potentiaalverschil tussen beide elektroden gebruikt worden als maat voor de concentratie van het gemeten ion. 2.2.1 De verzadigde kalomelelektrode De verzadigde kalomelelektrode is vervaardigd uit kalomel of kwik(I)chloride Hg2Cl2. De elektrode is gebaseerd op volgende halfcelreactie: Hg2Cl2 → Hg22+ + 2 Cl- Hg22+ + 2 e- → 2 Hg Hg2Cl2 + 2 e- → 2 Hg + 2Cl- De potentiaal wordt gegeven door de vergelijking van Nernst: 0,059 [Hg2Cl2] U = U0 + log 2 [Hg]²[Cl-]² 0,059 U = U0 + log verz. KCl: U = 0,250 V 2 [Cl-]² De concentratie aan Cl- wordt constant gehouden door te werken met een verzadigde KCl oplossing. Zodoende wordt een stabiele potentiaal bekomen. De verzadigde kalomelelektrode bevat kwik en het gebruik ervan houdt daarom een gezondheidsrisico in. Er wordt dan ook de voorkeur gegeven aan een tweede type referentie-elektrode, nl. de zilver-zilverchloride elektrode. 2.2.2 De zilver-zilverchloride elektrode De referentie-elektrode die vandaag veruit het meest gebruikt wordt, is de zilver- zilverchloride elektrode. Deze elektrode is gebaseerd op volgende halfcelreactie: AgCl →Ag+ + Cl- Ag+ + 1 e- → Ag AgCl (s) + e- → Ag (s) + Cl- De elektrode bestaat uit een Ag-draad, bedekt met een laagje AgCl. De Ag-draad is gedompeld in een KCl oplossing, waaraan enkele druppels AgNO3 oplossing werden toegevoegd. Hierdoor is de oplossing verzadigd aan AgCl. De KCl oplossing fungeert als inwendige oplossing en zoutbrug. 7  Figuur 2. Ag/AgCl elektrode 0,059 [AgCl] U = U0 + log 1 [Ag][Cl-] 0,059 U = U0 + log verz. KCl: U = 0,203 V 1 [Cl-] 3 Toepassingen 3.1 Directe potentiometrie Bij directe potentiometrie wordt de concentratie van het te bepalen ion bepaald door het potentiaalverschil te meten tussen de meet- of indicatorelektrode en een referentie elektrode. Het gemeten potentiaalverschil wordt vervolgens omgezet in een concentratie door gebruik te maken van een kalibratielijn, bekomen aan de hand van een reeks standaarden met gekende concentratie. Een vereenvoudigd alternatief is tweepuntskalibratie. Hierbij meet men slechts twee standaarden met gekende concentratie. Alternatief kan gebruik gemaakt worden van standaardadditie. In dit geval wordt een standaard met gekende concentratie toegevoegd aan het onbekende staal. Binnen de klinische chemie wordt potentiometrie gebruikt voor het bepalen van ionen in lichaamsvloeistoffen zoals bloed, urine of cerebrospinaal vocht. Enkele voorbeelden zijn de bepaling van elektrolyten zoals natrium, kalium, chloride en calcium voor het beoordelen van de elektrolytbalans, de nierfunctie, hartfalen of diabetische ketoacidose. Daarnaast berust ook pH bepaling op het principe van potentiometrie, hetgeen zijn toepassing kent in het opsporen van acidose of alkalose. Verder kunnen met behulp van potentiometrie bloedgassen zoals zuurstof en CO2 bepaald worden. 8  3.1.1 Factoren die de meting beïnvloeden 3.1.1.1 Activiteit versus concentratie Ion-selectieve elektroden meten de activiteit van een bepaald ion. De activiteit (a) van een ion is echter niet hetzelfde als de concentratie (c) van dat ion. Het verband tussen activiteit en concentratie wordt gegeven door volgende vergelijking: a=f×c Bij lage concentraties (< 1 mol/l), dus in verdunde oplossingen, wordt de f-factor = 1, zodat a = c. Bij hogere concentraties neemt het effect van andere ionen toe en wordt f < 1. Bij directe potentiometrie wordt de concentratie van het te bepalen ion afgeleid uit een kalibratielijn, die wordt opgesteld m.b.v. standaarden. Bij het gebruik van een kalibratielijn wordt er altijd aangenomen dat de activiteitscoëfficiënt van het te meten ion gelijk is in de standaarden en de onbekende stalen. Dit is echter alleen het geval indien de ionsterkte in al deze oplossingen gelijk is. Om ervoor te zorgen dat de ionsterkte in de stalen en standaarden gelijk is, kan een sterk en inert elektrolyt aan alle oplossingen worden toegevoegd zodat de ionsterkte zo groot is dat variaties tussen de verschillende oplossingen verwaarloosd kunnen worden. Tegelijkertijd kunnen het geschikte buffersysteem en complexvormende stoffen toegevoegd worden om interferenties (zie verder) te onderdrukken. Meerdere producenten bieden dergelijke oplossingen aan, vb. TISAB (total ionic strength adjustment buffer) voor de fluoridebepaling bevat een mengsel van citraten (storing van Fe3+, Al3+), acetaatbuffer (pH = 5) en NaCl met totale ionsterkte van 1,75 mol/l. Als sterk elektrolyt wordt frequent 5 mol/l NaNO3 gebruikt (tenzij natuurlijk Na+ of NO3- interfereren). Bij de natrium-selectieve glasmembraanelektroden is 1 mol/l NH3 en 1 mol/l NH4Cl de beste keuze aangezien zo ook al de optimale pH ingesteld wordt. 3.1.1.2 Selectiviteit Ion-selectieve elektroden zijn gevoelig voor de activiteit van het te bepalen ion. Echter, ze zijn doorgaans niet 100% selectief, dus met andere woorden ook in meer of mindere mate gevoelig voor andere ionen. Deze invloed kan worden uitgedrukt als de selectiviteitscoëfficiënt, die de voorkeur van de ISE uitdrukt voor een bepaald ion t.o.v. een ander ion. Bijvoorbeeld: Selectiviteitscoëfficiënt K (K+/Na+)= 2.6 x 10-3 De voorkeur van deze ISE voor K+ t.o.v. Na+ is 1 op 2.6 x 10-3 of 385 op 1. Deze ISE is dus 385 keer meer gevoelig voor K+ dan voor Na+. Nikolsky ontwikkelde een uitgebreidere Nernst-vergelijking, die rekening houdt met zowel de bijdrage van het te meten ion als deze van de interfererende ionen: 9  0,059 U = U0 + log [ai + Σ ( Kij x aj)] 𝑛 Met: ai = activiteit van het te bepalen ion Kij = selectiviteitscoëfficiënt van het te bepalen ion t.o.v. interfererend ion ai = activiteit van het interfererend ion In de praktijk kan men deze Nikolsky vergelijking echter niet toepassen. In plaats daarvan moet men de interferentie van andere ionen wegwerken door bijvoorbeeld pH aanpassing, neerslagvorming, complexvorming, redoxreactie,... Een voorbeeld hiervan is de interferentie van Zn2+ bij Ca2+-bepaling met een Ca2+- gevoelige vloeibare membraanelektrode. Om interferentie te voorkomen, kan het Zn2+- ion gemaskeerd worden door complexvorming. 3.1.1.3 Chemische interferentie Naast de beïnvloeding van de potentiaal door vreemde ionen treedt ook chemische interferentie vaak op; hiermee wordt bedoeld dat de activiteit van het vrij gemeten ion (niet gebonden) beïnvloed wordt door de chemische matrix waarin het zich bevindt. Zo kan bv. complexvorming, pH-verandering,... het te meten ion onder een andere vorm brengen zodat het geen elektrode-respons meer geeft en dus niet gemeten wordt. vb. Fluoride-bepaling met LaF3 elektrode Er wordt boven pH = 4 gewerkt om HF vorming in storende mate te voorkomen. De pH is ook beneden 8 om La(OH)3 precipitatie op de membraan te voorkomen. Er wordt ook steeds een citraatoplossing toegevoegd om complexvorming van Fe(III) en Al(III) met F- te verhinderen en aldus alle fluor onder F--vorm te verkrijgen. 3.1.1.4 Onstabiel signaal Een onstabiel signaal kan verkregen worden wanneer de membraan verontreinigd wordt. Zo kunnen bepaalde producten zich afzetten op de membraan of ermee reageren. Dit leidt tot gedaalde gevoeligheid. De membraan kan ook verouderingsverschijnselen vertonen (kristalstructuurwijzigingen en verlies van ionen uit de membraan) waardoor de elektrode trager reageert op een wijziging in de activiteit van het te bepalen ion. Na een zekere tijd moet de membraan dan ook mogelijk vervangen worden. 3.1.2 pH bepaling Veruit de meest gebruikte toepassing van potentiometrie is bepaling van de pH van een oplossing. Hiervoor is een glasmembraan elektrode en referentie elektrode nodig. De glasmembraan elektrode is gevoelig voor de H+ concentratie in de oplossing en geeft een welbepaalde potentiaal die evenredig is met de H+ concentratie. Deze potentiaal kan echter niet als dusdanig gemeten worden, men kan enkel het potentiaalverschil meten 10  t.o.v. een referentie elektrode. De referentie elektrode geeft een constante potentiaal, onafhankelijk van de concentratie H+ in de oplossing. Het gemeten potentiaalverschil is dus evenredig met de H+ concentratie. Vaak worden pH elektroden aangeboden als gecombineerde elektroden, waarbij de glasmembraan elektrode en referentie elektrode samen in 1 geheel verwerkt zitten. Het potentiaalverschil wordt gegeven door de vergelijking van Nernst: Ugemeten = Uref – Uglas = Uref – (K – 0,059 pH) = 0,203 – K + 0,059 pH Ofwel pH = Ugemeten + K – 0,203 0,059 3.1.2.1 Kalibratie De K-waarde in bovenstaande vergelijking kan als constante beschouwd worden over korte perioden en verschilt van elektrode tot elektrode. Om deze redenen moet een pH meter gekalibreerd worden met bufferoplossingen van bekende pH. Hierbij worden de helling (slope) en snijpunt (offset) van de curve bepaald. Theoretisch kunnen de helling en snijpunt worden afgeleid uit de vergelijking van Nernst: Helling = -0,059 snijpunt: moet gelijk zijn aan 0 mV bij pH = 7 Figuur 3: Kalibratielijn van een pH meting. De theoretische curve wordt afgebeeld, alsook de gecorrigeerde curves voor (1) intercept (offset) en (2) intercept (offset) + helling (slope) In de praktijk zullen de werkelijke helling en snijpunt echter afhangen van het specifieke meetsysteem en bovendien zullen deze slechts beperkte tijd constant zijn. Daarom is het nodig een pH meter dagelijks te kalibreren. 11  Om een betrouwbare kalibratie te bekomen, is minstens een tweepuntskalibratie nodig. De kalibratiebuffers moeten worden gekozen in functie van het benodigde pH gebied. Er kunnen immers enkel betrouwbare metingen worden uitgevoerd in het gebied waarbinnen de pH meter gekalibreerd werd. Veel gebruikte kalibratiebuffers zijn: Buffer Concentratie pH bij (mol/kg) 20 °C 25 °C 37 °C Kaliumwaterstoftartraat verzadigd - 3,557 3,548 Kaliumwaterstofftalaat 0,05 4,002 4,008 4,030 KH2PO4 + Na2HPO4 0,025 + 0,025 6,881 6,865 6,840 KH2PO4 + Na2HPO4 0,0087 + 0,0304 7,429 7,413 7,384 Tris + Tris.HCl 0,0167 + 0,05 7,83 7,70 7,39 Borax 0,010 9,225 9,180 9,081 NaHCO3 + Na2CO3 0,025 + 0,025 10,062 10,014 9,899 Uit deze tabel kan afgeleid worden dat de pH temperatuursafhankelijk is. Daarom bevat een pH meter ook steeds een temperatuurssensor. 3.2 Potentiometrische titratie Potentiometrie kan tevens worden gebruikt voor de bepaling van het equivalentiepunt bij titratie. In geval van een redoxreactie wordt gebruik gemaakt van een ORP elektrode (en referentie elektrode). In geval van een zuur-base reactie wordt gebruik gemaakt van een pH elektrode (en referentie elektrode). Het equivalentiepunt gaat gepaard met een relatief grote wijziging in potentiaalverschil of pH. Het equivalentiepunt kan vervolgens bepaald worden via: - Rekenkundig: volgens de methode van de tweede afgeleide - Grafisch: de meetwaarden worden uitgezet in functie van de toegevoegde hoeveelheid reagens. Zo bekomt men een titratiecurve. 12 4 Literatuurlijst Een informatiegids over pH metingen. Theorie en praktijk in laboratoria. Mettler Toledo, 03-2016. A guide for ion-selective electrodes. Theory and practice of ISE applications. Mettler Toledo, 04-2018. Cursus ‘Instrumentele technologie, deel I’ (Spectrofotometrie, conductometrie, potentiometrie en fluorimetrie), Mia Lippens, 2018-2019. Cursus ‘Chemie II’, Mia Lippens & Maarten Therry, 2018-2019. ZELFTOETS Kan je de werking van een pH meter uitleggen? Welke elektroden heb je nodig om K+, Na+, F- te bepalen? Wat is het verschil tussen deze elektroden? Kan je in eigen woorden uitleggen waarvoor TISAB dient? Ken je het verschil tussen activiteit en concentratie? Kan je uitleggen wat chemische interferentie inhoudt? 13  Hoofdstuk 2 UV/VIS spectrometrie 1 Algemene beschouwingen 1.1 Inleiding De optische analysemethoden behoren tot een zeer belangrijk deel van de analytische chemie. Ze worden gedefinieerd als deze methoden die betrekking hebben op elektromagnetische straling (EMS) afkomstig van, of in wisselwerking met de materie. Het volledige elektromagnetische spectrum, van γ-straling tot radiogolven, wordt hierbij beschouwd evenals alle mogelijke interactiewijzen van EMS met materie. Spectrometrische methoden steunen op het meten van stralingsintensiteit en golflengte (of frequentie) waarbij spectra ontstaan te wijten aan overgangen tussen karakteristieke energieniveaus. Deze spectrometrische analyses zijn gebaseerd op het mechanisme van emissie of absorptie van EMS door materie. Niet-spectrometrische methoden steunen op de interactie van EMS met materie die resulteert in een richtingswijziging of een verandering van een fysische eigenschap van EMS. Specifieke interactiemechanismen zijn : breking, dispersie, weerkaatsing, verstrooiing, interferentie, diffractie, polarisatie... Typische niet-spectrometrische technieken zijn : polarimetrie, refractometrie, turbidimetrie, nefelometrie, X-straal- diffractie, … 1.2 Elektromagnetische straling Elektromagnetische straling kan, eenvoudig uitgedrukt, beschouwd worden als energie die zich in de ruimte voortbeweegt zonder tussenkomst van enige materie. Volgens de klassieke theorie kunnen de eigenschappen van straling verklaard worden door haar golfkarakter. EMS bestaat uit golven die een wisselend elektrisch veld en een daarmee gepaard gaand wisselend magnetisch veld bezitten (Figuur 4). Deze velden staan loodrecht op elkaar en op de voortplantingsrichting. Figuur 4: Vlak-gepolariseerde EMS: E = elektrische veldsterkte H = magnetische veldsterkte X = voortplantingsrichting λ = golflengte De snelheid waarmee de golf zich verplaatst, wordt de voortplantingssnelheid genoemd. Deze snelheid is in vacuum dezelfde voor alle elektromagnetische golven, namelijk c = 14 2,9979 x 108 m/s 300 000 km/s). De golflengte is de afstand tussen twee opeenvolgende maxima of minima in het wisselend elektrisch of magnetisch veld (= lengte van één cyclus). De frequentie ν is gelijk aan het aantal cycli of golflengtes per seconde. De golflengte wordt uitgedrukt in meter (m), micrometer (1 µm = 10-6m), nanometer (1 nm = 10-9m); de frequentie wordt in Hertz (Hz) (= aantal cycli/s) opgegeven (1 MHz = 1 megahertz = 106Hz; 1 GHz = 1 gigahertz = 109Hz). De voortplantingssnelheid, de golflengte en de frequentie zijn met elkaar verbonden in volgende vergelijking : c= λvac. ν : geldig in vacuum vA = λA. ν : geldig in middenstof A We merken hierbij op dat enkel de frequentie een echt fundamentele karakteristieke waarde is van een bepaalde straling en niet de golflengte of de voortplantingssnelheid. Wanneer straling overgaat van de ene middenstof naar de andere blijft de frequentie onveranderd, maar de golflengte zal verschillend zijn, gezien de golf zich minder snel voortplant in het dichtere medium. Niettemin wordt in de praktijk vaak de golflengte gebruikt om straling te karakteriseren, en dit voornamelijk in het ultraviolet (UV), zichtbaar en infrarood (IR) gebied. Tot hiertoe werd het golfkarakter van EMS benadrukt. Sommige verschijnselen echter, zoals het foto-elektrisch effect, kunnen enkel verklaard worden door de straling te beschouwen als een regen of een flux van energiedeeltjes of fotonen. Dit is het dualistisch karakter van EMS. Max Planck verenigde de golf- en de deeltjestheorie in de volgende vergelijking E=hν E = energie van één foton, in Joule h = constante van Planck = 6,624 x 10-34J.s ν = frequentie van de straling waartoe het foton behoort Uit de vergelijking van Planck blijkt dat bij stijgende frequentie de fotonenergie evenredig toeneemt. Dus EMS met grote golflengte bestaat uit fotonen van lage energie en straling met kleine golflengte uit fotonen van hoge energie. Figuur 5 geeft een overzicht van de verschillende gebieden van het elektromagnetisch spectrum en de daarbij horende kenmerkende transities. 15  Figuur 5: Overzicht van het elektromagnetisch spectrum In de verdere beschouwingen zullen we voornamelijk aandacht besteden aan de absorptie- en emissiespectrometrie in het ultraviolette UV, zichtbare VIS en infrarode IR gebied. 2 Absorptie van EMS Wanneer EMS door een laag vast materiaal, vloeistof of gas treedt, dan kan het voorkomen dat welbepaalde golflengten onttrokken worden door een absorptieproces. Hier wordt elektromagnetische energie (h.ν1, h.ν2) overgedragen op de atomen of moleculen waaruit het monster bestaat (Figuur 6). 16  E Figuur 6: Energieniveaus van het absorberend deeltje Deze deeltjes gaan daardoor over van een lagere energietoestand (de grondtoestand E0) naar hogere energietoestanden (aangeslagen of geëxciteerde toestanden E1, E2 ). Atomen, moleculen of ionen hebben een beperkt aantal discrete, gekwantiseerde energieniveaus. Opdat absorptie van straling kan optreden moet de energie van het exciterend foton exact overeenkomen met het energieverschil tussen de grondtoestand en één van de geëxciteerde toestanden van het absorberend deeltje. Aangezien deze energieverschillen uniek zijn voor elk deeltje, zal een studie van de golflengten of frequenties van de geabsorbeerde straling ons toelaten de absorberende componenten in een materiaal kwalitatief en kwantitatief te bepalen. Hiervoor wordt frequent een grafiek van absorbantie A (= maat voor de afname in stralingsintensiteit ten gevolge van absorptie) in functie van golflengte experimenteel opgesteld. Deze curve noemt men het absorptiespectrum. Het uitzicht van dit spectrum is in belangrijke mate afhankelijk van de complexiteit, de fysische toestand en de matrix van de absorberende stof. Veelal maakt men een onderscheid tussen twee soorten spectra namelijk deze gekoppeld aan atoomabsorptie en deze die het gevolg zijn van molecuulabsorptie. 2.1 Atoomabsorptie Bij doorgang van polychromatisch UV of zichtbaar licht door een medium dat mono- atomige deeltjes bevat, zoals een kwik- of natriumdamp, wordt een gering aantal welbepaalde frequenties of golflengten geabsorbeerd. Figuur 7. Absorptiespectrum van Na-damp in het UV gebied De eenvoud van deze spectra zoals voorgesteld voor natrium in Figuur 7, is te wijten aan het klein aantal mogelijke energietoestanden voor deze onafhankelijke atomen. Ultraviolette en zichtbare straling is in staat de buitenste elektronen (valentie- elektronen) in het atoom te exciteren. 17  bvb. voor Na : - het 3 s elektron absorbeert 589 nm straling om naar de 3p orbitaal over te gaan - het 3 s elektron absorbeert 330 nm straling om naar de 4p orbitaal over te gaan - het 3 s elektron absorbeert 285 nm straling om naar de 5p orbitaal over te gaan Excitatie van de elektronen die zich dicht bij de kern bevinden, kan slechts gebeuren met de veel energierijkere X-straling. Kenmerkend voor de atoomabsorptiespectra is het gering aantal smalle absorptiepieken of lijnen. 2.2 Molecuulabsorptie Absorptie door moleculaire systemen is veel complexer omdat het aantal mogelijke energietoestanden veel groter is dan bij atomen. De totale energie van een molecule is de som van de elektronische energie (Ee ), de vibratie-energie (Eν\, energie gekoppeld aan de trillingen van de atomen in de molecule) en de rotatie-energie (Er, energie gekoppeld aan het draaien van de molecule rond haar zwaartepunt) : Etot = Ee + Eν + Er Voor elke elektronische energietoestand van een molecule zijn er meerdere vibratietoestanden mogelijk, en voor elk van deze laatste zijn er vele rotatietoestanden mogelijk. Bijgevolg is het aantal energieniveaus voor een molecule veel groter dan voor een atomair deeltje. Figuur 8: Gedeeltelijk energiediagram van een molecule De rotatieniveaus zijn niet getekend om de voorstelling niet onnodig te compliceren. Zoals uit Figuur 8 blijkt, is het energieverschil tussen de elektronische grondtoestand en een elektronisch geëxciteerde toestand groot, vergeleken met het verschil tussen twee vibratieniveaus binnen één elektronische toestand. Het energieverschil tussen twee op elkaar volgende rotatieniveaus binnen één vibratietoestand is nog veel kleiner. ΔEe » ΔEν > ΔEr Wanneer een molecule een UV- of VIS-foton absorbeert dan wordt de foto-energie (h.ν) gebruikt om een bindingselektron of een buitenste elektron in een aangeslagen toestand 18 te brengen. Gelijktijdig hiermee veranderen mogelijk de vibratie- en/of de rotatie-energie van de molecule. h.ν = ΔEe + ΔEν + ΔEr IR-straling is niet in staat een elektronische excitatie te veroorzaken, wel vibratie- excitatie al dan niet gepaard gaand met rotatie-excitatie. In tegenstelling tot de atomaire spectra die slechts enkele scherpe lijnen bevatten (lijnenspectrum), vertonen moleculaire spectra in het UV en VIS bredere absorptiebanden (bandenspectrum). Elke band bestaat dan uit meerdere dicht op elkaar volgende scherpe absorptiepieken zoals bvb. te zien is in het spectrum van gasvormig benzeen (Figuur 9, spectrum opgenomen met een spectrometer van hoge resolutie). Figuur 9: Absorptiespectrum van gasvormig benzeen. In de vaste toestand of in oplossing verdwijnen die individuele pieken, en de spectra vertonen eerder bredere golvende absorptiebanden. (Figuur 10 en Figuur 11). Figuur 10: absorptiespectrum van benzeen in hexaan Figuur 11: absorptiespectrum van bifenyl in hexaan 19  Relaxatieprocessen: De levensduur van een atoom of molecule geëxciteerd door absorptie van straling is gewoonlijk zeer kort (10-8 s of korter). De terugval naar de grondtoestand kan stralingloos gebeuren waarbij de energieafgifte in vele kleine stapjes gebeurt. Op deze manier wordt de excitatie-energie omgezet in kinetische energie via botsing met andere moleculen. Een verwaarloosbare temperatuurstijging is hiervan het gevolg. Relaxatie naar de grondtoestand kan in bepaalde gevallen optreden via het emitteren van fluorescentiestraling. Hierop wordt ingegaan in een later hoofdstuk. 3 Emissie van EMS Op dit ogenblik beschouwen we enkel emissie van straling door vaste stoffen, vloeistoffen en gassen bij hoge temperatuur (d.i. de zogenaamde thermische straling). 3.1 Vaste stoffen en vloeistoffen bij hoge temperatuur Wanneer vaste stoffen opgewarmd worden tot gloeihitte, dan wordt er een continu spectrum uitgestraald dat eerder karakteristiek is voor de temperatuur van het emitterend oppervlak dan voor de samenstelling van het materiaal. Een continu spectrum betekent dat binnen een eerder ruim golflengte-interval alle mogelijke golflengten aanwezig zijn. In vaste en vloeibare toestand zijn de atomen en de moleculen zo dicht op elkaar gepakt dat er geen sprake is van onafhankelijk gedrag. Door onderlinge beïnvloeding en verstoring is er een oneindig aantal thermische excitatiemogelijkheden (veel meer dan bij onafhankelijke atomen of moleculen), en bijgevolg ook een uitermate groot aantal terugvalmogelijkheden met emissie van straling. Theoretische beschouwingen bij de emissie door gloeiende vaste lichamen en vloeistoffen leiden tot volgende conclusies : - de stralingscurve (energie E i.f.v. λ ) vertoont een maximum bij een golflengte die omgekeerd evenredig is met de absolute temperatuur T (d.i. de wet van Wien) (Figuur 12). - de totale geëmitteerde energie (de oppervlakte onder de curve is hier een maat voor) per tijds- en materiaaloppervlakte-eenheid is evenredig met de vierde macht van de absolute temperatuur (di. de wet van Stefanen Boltzmann) : E = k. T4 vb. als de temperatuur met een factor 10 stijgt (400 K —› 4000 K) dan neemt de uitgestraalde energie 10 000-voudig toe (Figuur 12). 20  Figuur 12: Spectrale energieverdelingscurven bij verschillende T Bij 500 K ligt het gehele energiegebied buiten de zichtbare straling. Bij 900 K komt de curve in de buurt van 700 nm: de meeste stoffen beginnen te gloeien bij deze temperatuur. Bij hogere temperatuur komen er steeds meer kortere golflengten voor: de straling gaat over van rood naar geel om tenslotte het ganse zichtbare gebied (witgloeiend) te bestrijken. Bij 3000 K (de temperatuur van een gloeilampdraad) ligt λmax bij 1000 nm. Een kleiner deel van de curve bestrijkt het zichtbare gebied. Een gloeilamp zet 8 % van haar totale emissie-energie om in de vorm van zichtbare straling en heeft dus een laag rendement. De zon daarentegen zendt, met een oppervlaktetemperatuur van 6000 K, een energiespectrum uit met λmax = 500 nm m.a.w. in het midden van het zichtbare gebied en met een rendement van 42 %. Zeer hoge temperaturen zijn vereist opdat een thermisch geëxciteerde bron een aanzienlijk deel van haar energie als U.V.-straling zou vrijgeven. Sterk verhitte vaste materialen worden in analytische instrumenten gebruikt voor de productie van infrarode, zichtbare en langere - golflengte-ultraviolette straling. 3.2 Atomen in gasfase bij hoge temperatuur Ten gevolge van de grote kinetische energie die atomen in een gloeiend gas bezitten, gaan deze zo hevig tegen elkaar aanbotsen dat de buitenste elektronen (valentie- elektronen) in een hogere onbezette baan verder van de kern gebracht worden. De toegevoegde thermische energie wordt in een atoom via botsing omgezet in verhoogde potentiële energie van de buitenste elektronen t.o.v. de kern. Door de specifieke bouw van elke atoomsoort is er slechts een beperkt aantal nieuwe energietoestanden mogelijk. Deze aangeslagen toestanden zijn onstabiel en na zeer korte tijd vallen de elektronen terug naar hun oorspronkelijke baan onder afgifte van een bepaalde energiehoeveelheid AE1, AE2, AE3,... (Figuur 13) ΔE1 = Ee1 - Ee0 ΔE2 = Ee2 - Ee0 ΔE3 = Ee3 - Ee0 21  De vrijgekomen energie vertoont zich als zichtbare en U.V. straling. Figuur 13. Elektronenbanen en energieniveaus van een atoom De verzameling golflengten die wordt waargenomen hangt direct af van de inwendige bouw van het atoom en verschilt van element tot element. Het emissiespectrum is een lijnenspectrum en is a.h.w. de "vingerafdruk" van de atoomsoort. Voorbeeld : een natriumatoomdamp emitteert de dubbele gele lijn namelijk 589,0 en 589,6 nm. Het 3s valentie-elektron wordt door energieoverdracht in een botsing naar de 3p orbitaal geëxciteerd en bij terugval naar de oorspronkelijke orbitaal wordt die karakteristieke straling geproduceerd. De energietoevoer (m.a.w. de temperatuur van het gasmedium) heeft een dubbel effect op het waargenomen spectrum : - het spectrum wordt rijker aan lijnen bij hogere temperatuur: bij hogere kinetische energie-inhoud van de botsende deeltjes worden ook de hoger gelegen elektronische energieniveaus bereikbaar - (grotere energieoverdracht) - de bestaande lijnen worden intenser omdat de botsingsefficiëntie (het aantal botsingen op honderd dat excitatie veroorzaakt) toeneemt, en bijgevolg stijgt het aantal fotonen dat per tijdseenheid uitgestraald wordt. Atomen kunnen ook vaak geëxciteerd worden door een elektrische ontlading (stroomdoorgang) te veroorzaken in die gasfase. Hetzelfde lijnenspectrum wordt dan bekomen als bij thermische excitatie. 3.3 Moleculen in gasfase bij hoge temperatuur Gloeiende gassen van twee- of meeratomige moleculen die niet thermisch gesplitst zijn, geven een heel ander spectrum. Naast de elektronische energie moeten hier ook vibratie- en rotatieenergieën beschouwd worden. Door thermische excitatie kunnen deze drie energietoestanden toenemen en bij terugval naar de grondtoestand gekwantiseerde emissie geven. Het spectrum kenmerkt zich door een ongemeen grote rijkdom aan lijnen, die dicht bij elkaar aansluiten en als het ware een band vormen. Het molecuulemissiespectrum is dan ook een bandenspectrum. 22 3.4 Ionen in gasfase bij hogere temperatuur Een atomair gassysteem kan bij hogere temperatuur gedeeltelijk ioniseren. Het gevormde positief ion gaat een nieuw bestaan voeren met totaal verschillende energietoestanden in vergelijking met het moederatoom doordat bij het ontstane ion de kern een grotere interactiekracht zal uitoefenen op de resterende elektronen. Deze ionen zullen na thermische excitatie ook een lijnenspectrum emitteren. Bij grotere energietoevoer (hogere temperatuur van het gasmedium) zal de ionisatiegraad toenemen, het atoomspectrum verzwakken en het ionenspectrum in intensiteit en lijnenaantal toenemen. Bij nog hogere temperatuur kunnen er zelfs twee- of driewaardige ionenspectra ontstaan. 4 Andere interactiemechanismen In de voorgaande punten werden de absorptie- en emissieprocessen besproken; daarbij werd de straling voornamelijk als een fotonenstroom (deeltjestheorie) beschouwd. Andere interactietypes zoals breking, weerkaatsing, verstrooiing, interferentie, dispersie, diffractie en polarisatie worden best verklaard door straling als golfverschijnsel te beschouwen. Sommige van deze interacties vormen de basis van een reeks analytische technieken en spelen frequent een essentiële rol bij het ontwerpen van optische instrumenten. Hierna volgt een korte bespreking van een aantal voornoemde interactietypes. 4.1 Breking en dispersie Wanneer een lichtstraal niet loodrecht op het scheidingsvlak met een ander medium valt, wordt ze gebroken. De breking is het gevolg van de onveranderlijkheid van de frequentie en de verandering van de snelheid v in een ander medium. Wanneer straling vanuit het vacuüm (bovenaan in Figuur 14) in een transparante stof (vb. glas) binnentreedt, wordt ze naar de normaal toe gebroken. α = invalshoek β = brekingshoek Figuur 14: Breking 23  In onderstaande tabel zijn enkele brekingsindices bij 589 nm samengebracht: medium brekingsindex lucht 1,00029 water 1,33 glas 1,5 tot 1,8 diamant 2,5 (grootste index) De snelheid in de middenstof hangt vooral af van de aard van deze stof, doch ook enigszins van de golflengte, en wel zo dat de snelheid van stralen met kortere golflengte kleiner is dan die met langere. Ze hebben dus een grotere brekingsindex. Door de lichtbreking wordt een polychromatische straal van golflengten gesplitst in zijn afzonderlijke componenten, zodat de kleinste golflengte het sterkst zal afbuigen (Figuur 15). Dit verschijnsel noemt men kleurschifting of dispersie. Aangezien n geen lineaire functie is van X, zal de dispersie niet lineair verlopen: het spectrum is uitgerekt naar het UV en samengedrukt in het rode gebied. Figuur 15: Breking van een polychromatische straal Deze kleurschifting is storend wanneer we de lichtbreking gebruiken om een bundel wit licht in een bepaalde richting te sturen (in optische instrumenten); door de dispersie wordt dan elke lichtbundel een bundel van gekleurde stralen (chromatische aberratie). De dispersie is echter een goed hulpmiddel om stralenbundels ruimtelijk te scheiden (om spectra te bekomen). Hiervoor worden prisma's gebruikt, waarbij de breking tweemaal optreedt namelijk bij het invallen en het verlaten van het prisma. We voelen intuïtief aan dat uit materialen met hoge en sterk variërende brekingsindex de beste prisma's zullen vervaardigd worden (zolang tenminste geen aanzienlijke absorptie van straling in het prismamateriaal optreedt). 4.2 Weerkaatsing Telkens wanneer licht valt op het scheidingsvlak tussen media met verschillende brekingsindices, treedt er reflectie op. Wanneer het oppervlak weinig of geen oneffenheden vertoont, is de invalshoek α (Figuur 16) gelijk aan de reflectiehoek γ. 24 Figuur 16: Reflectie Het weerkaatsend vermogen (= verhouding van gereflecteerde intensiteit Ir en invallende intensiteit I0) stijgt naarmate de invalshoek toeneemt, om gelijk te worden aan 1 bij 90°. Voor het speciale geval van straling loodrecht invalt op het scheidingsvlak (het meest voorkomende geval wanneer straling doorheen een monster gaat) wordt Ir/I0 gegeven door: Hieruit blijkt dat de weerkaatsing belangrijker wordt naarmate het verschil tussen de brekingsindices groter wordt. Voorbeeld : Bereken de procentuele afzwakking (stralingsverlies) van een gele stralingsbundel wanneer deze door een glazen cuvet treedt (loodrechte belichting) die met water gevuld is. Er treedt geen absorptie op, enkel reflectie veroorzaakt de intensiteitsvermindering (Figuur 17). De n-gegevens voor gele straling zijn: nglas = 1,50 n H20 = 1,33 nlucht = 1,00 Figuur 17: Intensiteitsvermindering door reflectie De invallende intensiteit op het tweede scheidingsvlak, namelijk de overgang glas - water is gelijk aan 0,960 I0. 25 4.3 Verstrooiing Transmissie (doorlaten) van straling in een materiaal kan voorgesteld worden als het zeer kortstondig ophouden van stralingsenergie waardoor geïnduceerde dipolen in ionen, atomen of moleculen ontstaan, gevolgd door een reëmissie in alle richtingen bij de terugkeer naar grondtoestand. Wanneer de deeltjes klein zijn t.o.v. de golflengte van de straling dan zal nagenoeg alle straling geëmitteerd worden in de oorspronkelijke richting van de straal (ten gevolge van destructieve interferentie). Nauwkeurige observatie toont aan dat een zeer kleine fractie van de straling (de verstrooide straling) transmissie vertoont onder alle hoeken t.o.v. de originele richting en dat de intensiteit van de verstrooide straling toeneemt met deeltjesgrootte. Wanneer de partikels colloïdale afmetingen bezitten (orde van grootte 1 µm) dan wordt de verstrooiing voldoende intens om met het blote oog waargenomen te worden (het Tyndall effect). Verstrooiing door moleculen met afmetingen die merkelijk kleiner zijn (