İZTÜ Tıp 1 Doku Hazırlama ve Boyama Teknikleri 2024-2025 PDF

Doku Hazırlama ve Boyama Teknikleri Dr. Öğretim Üyesi: Emine Özçınar İZTÜ Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı İZTÜ-Tıp1, 2024-2025 Öğrenim Hedefleri Dokuların ışık mikroskobu ile incelenebi...

Doku Hazırlama ve Boyama Teknikleri Dr. Öğretim Üyesi: Emine Özçınar İZTÜ Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı İZTÜ-Tıp1, 2024-2025 Öğrenim Hedefleri Dokuların ışık mikroskobu ile incelenebilmesi için gerekli olan doku hazırlama tekniklerini doğru basamaklandırarak açıklar. Doku boyama tekniklerini ve dokuların boyanma özelliklerini kimyasal etkileşimleri ile açıklar. Histoloji ❖Histolojik teknik: Organizmadan ayrılan dokuların (biyopsi materyali, vb) mikroskopla görülebilecek duruma getirilmesi için uygulanan işlemlerin tümüdür. Canlı doku incelenmesi Cansız doku incelenmesi Canlı Doku İncelenmesi: Unicellülar (tek hücreli) organizmalar veya kompleks bir organizmadan ayrılmış serbest hücreler (ovum, sperm) Lökositlerin ameboid hareketleri ve fagositik aktiviteleri, vb ✓ Faz-kontrast mikroskobu ile boyanmadan incelenebilir ✓ Vital, supravital boyalarla boyanarak incelenebilir Canlı Doku İncelenmesi: Sperm Hücrelerinin Canlı Olarak Faz- Sperm Hücrelerinin Rutin Boyama İşleminden kontrast mikroskopu ile incelenmesi Sonra Cansız Olarak İncelenmesi Canlı Doku İncelenmesi: Vital boyama; boyalar canlı hayvana enjekte edilir, seçici bir sekilde bazı hücreler tarafından absorbe edilir (örn.makrofajların Tripan mavisi ile boyanması). Supravital boyama; organizmadan çıkarılmış olan hücrelerin ortamına boya maddesi ilave edilir (örn.canlı hücrelerde mitokondrilerin Janus yeşili, lizozomların Nötral kırmızısı, sinir hücreleri ve sinir liflerinin Metilen mavisi ile boyanması). ❖ Mitokondriler Janus Yeşili İle Vital Boyanmış Cansız Doku İncelenmesi: Histolojik çalışmanın en uygun yolu, kalıcı bir şekilde korunabilen preparatların mikroskop altında incelenmesidir. Bir kesit, tesbit edilmiş (fikse edilmiş) doku parçasından ince bir dilim alınarak hazırlanır, boyanır, lam üzerine monte edilir ve lamel ile kapatılarak preparat haline getirilir. Histolojide rutin ışık mikroskobik inceleme için doku hazırlama aşamaları; ❖Anestezi altındaki bir canlıdan veya canlının ölümünü takiben, en kısa sürede alınan doku incelenebilmek için şu basamaklardan geçirilir; 1) Fiksasyon (Tespit etmek): Doku canlı haline en yakın şekliyle korunabilir. ▪ Fiksatifler; Formaldehid (%4’lük, %10’luk), alkol, merkurik biklorid, potasyum bikromat , bazı asitler (pikrik, asetik, osmik asit gibi) ▪ Fiksasyonun ideal olması için doku 1mm³ ve fiksatif miktarı dokunun 10 katı kadar olmalıdır. Histolojide rutin ışık mikroskobik inceleme için doku hazırlama aşamaları; 2) Dehidratasyon: Fiksasyondan sonra doku yıkanır, yıkanmış doku, derecesi artan alkol serisinde (%70 → %100 etanol) bekletilerek suyu alınır. 3) Şeffaflaştırma: Dokuya nüfus etmiş alkol gömme materyali parafin ile etkileşmediği için önce uygun bir çözücü (ksilen) ile yer değiştirilir. 4) Gömme: Doku genellikle parafin gömme materyali ile (37 derecede) infiltre edilir, daha sonra doku parçaları taze hazırlanmış gömme materyali içerisine gömülerek bloklar (oda ısısında) elde edilir. Histolojide rutin ışık mikroskobik inceleme için doku hazırlama aşamaları; 5) Kesit alma: Parafin bloklardan 3-10 mikron kalınlığında mikrotom ile kesitler alınır. ❖Frozen; Cerrahi müdahale sırasında hızlı sonuç vermek için doku kriyoprotektan içinde hızlı bir şekilde dondurulur (-50, -80), kriyostat ile 5-10 mikron kalınlığında kesilir. Yağ dokusu Ksilen içinde eridiği için frozen tekniği yağ doku için de kullanılabilir. Histolojide rutin ışık mikroskobik inceleme için doku hazırlama aşamaları; 6) Boyama: Çeşitli doku ve hücre bölümlerinin boyaları farklı şekilde tutmaları esasına dayanır. (Histokimya) ❖ Boyanan kesit üzerine ışığı kırma indeksleri camınkine eşdeğer monte maddesi (Kanada balsamı, entellan) damlatılır, lamel ile kapatılır, kurutulur. Preparat uzun yıllar mikroskop ile incelenmeye uygundur. Boyanmanın Kimyasal Özellikleri Boyalar ile: ▪ Hücrenin asidik ve bazik yapıları ayırt edilebilir (örn:Hematoksilen ve eosin (eozin) ile nukleus mavi, sitoplazma pembe-kırmızı boyanır) ▪ Ekstraselüler matriksin fibröz yapıları ayırt edilebilir (örn: Mallory Trichrome (kombine boyalar) ile fibröz yapılardan olan kollajen lifler mavi boyanır) ▪ Metalik tuzlarla dokularda çökeltiler oluşturularak yapılar ayırt edilebilir (örn: gümüş boyama ile sinir hücre uzantıları koyu renkte boyanır) Mallory Gümüş Boyama H&E Trichrome Boyanmanın Kimyasal Özellikleri Kullanılan boyalar asidik veya bazik olarak kabul edilirler, fakat gerçekte boyalar nötral tuzlar olup, hem asidik ve hem de bazik radikallere sahiptirler. Boyanın renklendirici maddesi nötral tuzun bazik radikali içerisinde ise boya bazik olarak kabul edilir ve bu boya ile boyanan yapılar da bazofil olarak tanımlanır. Bazik boyalarla boyanan bazofilik yapılar asidik yapıdadır (çekirdeğin nukleik asitlerini (DNA) ve ribonukleik asit (RNA) gibi sitoplazmanın asidik bileşenleri) Boyanın renklendirici maddesi, nötral tuzun asidik radikali içerisinde ise, boya asidiktir ve bu boya ile boyanan yapılar da asidofildir (örn; sitoplazma). Boyanmanın Kimyasal Özellikleri Bazofili: Anyonik gruplar; – Nukleik asidlerin fosfat grupları – Glikozaminoglikanların sulfat grupları – Proteinlerin karboksil grupları Anyonik gruplar + Bazik boya= BAZOFİLİK BOYANMA Boyanmanın Kimyasal Özellikleri Metakromazi: Bazı bazik boyalar doku komponentleriyle kendi renginden farklı bir reaksiyon gösterir (Toluidin mavisi). Mast Hücrelerindeki Metakromatik Histamin Granülleri Boyanmanın Kimyasal Özellikleri Asidofili: Katyonik Gruplar + Asidik boya= ASİDOFİLİK BOYANMA Asidik boyalar dokunun farklı bileşimlerini seçici boyadığından kombinasyonlar şeklinde kullanılır. Boyanmanın Kimyasal Özellikleri Bazik boyalar: En yaygın kullanılan hematoksilen'dir. Diğer örnekler toluidin mavisi, metilen mavisi, pyronin G. ❖Bazik boyalar ile çekirdek mavi görülür. Çekirdekteki heterokromatin ve nukleolus kısımları nukleik asitlerdeki iyonize fosfat grupları nedeniyle bazofili gösterir. Asidik boyalar: En yaygın kullanılan eosin’dir. Diğer örnekler asit fuksin, oranj G., anilin mavisi ❖Sitoplazmayı kırmızı-pembe renge boyar. H&E http://www.patoloji.med.ege.edu.tr/pratik/41LD04/pro/images/7.jpg Histolojik kesitlerin çoğunluğu hem asidik ve hem de bazik boyalarla birlikte boyanmaktadır. En yaygın olarak kullanılan kombinasyon Hematoksilen ve Eozindir Çekirdek yapılar koyu mor veya mavi, bütün sitoplazmik yapılar ile hücrelerarası maddeler pembe-kırmızı boyanır. Bazı Biyolojik Maddelerin Tayini İçin Histolojik Teknikler İyonlar :Bazı iyonlar, dokudaki proteinler ile birlikte sabitlenir (Örn: eritrositlerdeki demir ve kemikteki fosfat). Lipidler : Organik fiksatifler ile erirler ancak donmuş kesit ile korunabilirler. – Işık mikroskobunda lipidler, lipidte daha iyi çözünen boyalar (Sudan black ve kırmızı yağ-O)ile gösterilir. Bazı Biyolojik Maddelerin Tayini İçin Histolojik Teknikler Nukleik Asit: DNA ve RNA özel veya özel olmayan metotlar ile gösterilebilir. – DNA çekirdekte yer alır. – RNA hem çekirdekte hem de sitoplazmada yer alır. 1- Feulgen reaksiyonu: DNA boyasıdır. Hidroklorik asid DNA’yı kısmen hidrolize ederek serbest aldehitler oluşturur. 2- Akridin orange: Nukleik asit-akridin orange kompleksi bir miktar fluoresan yayar. ▪ Floresan Sarı-yeşil→ DNA Kırmızı-turuncu → RNA 3- Bazik boyalar: DNA ve RNA için non spesifik boyalardır. Bazı Biyolojik Maddelerin Tayini İçin Histolojik Teknikler Proteinler ve Amino Asidler: Enzim sınıfları histokimya ile özel proteinler immunhistokimya ile gösterilebilir Karbonhidratlar: 1-Periyodik Asit Schiff (PAS): Polisakkaridleri ve glikojeni göstermek üzere kullanılır. Schiff ajanı aldehitler ile reak. kırmızı-mor çökelti oluşturur. 2- Alcian Blue: Sulfatlı glikozaminoglikanları göstermek üzere kullanılır. (örn: kıkırdak dokusu) 3- Rutenyum kırmızısı: Spesifik olmayan polianyonlara bağlanır. Elektron mikroskobunda polisakkaridleri göstermek üzere kullanılır. 4- Lektinler: İşaretli lektinler, oligosakkaridlerin terminal şeker kalıntılarını lokalize edebilir. Katekolaminler: Epinefrin ve norepinefrin içeren bu grubun floresan olabilmesi için formaldehiti ısıtıp 60 °C’de buharlaştırmak gerekir. H&E Mallory Trichrome Boyası (birkaç asidik boya kombinasyonundan oluşur) Trakea Epiteli Kollajen ve retiküler lifler mavi, nükleus ve stoplazma kırmızı Cajal Altın Boyama Cerebellum’daki Purkinje Hücreleri İmmünohistokimya Spesifik hücre ve doku antijenlerini saptamak için işaretli antikorlar kullanılır. A. Antikor Çoğaltmak: Proteinler, glikoproteinler, proteoglikanlar gibi antijenlerin enjeksiyonu B lenfositlerin plazma hücresine dönüşmesine ve antikor üretmesine neden olur. Bu antikor antijenin özel bölgesi (epitopuna) bağlanır. 1-Poliklonal antikor 2-Monoklonal antikor B. İşaretli Antikorlar: Yaygın işaretler florokromlar (florescein,rodamin) C. Dokudaki Antijenin yerinin saptanması 1- Direkt metod: antijen içeren dokuya özel işaretli antikor solusyonunda inkube edilir. 2- Dolaylı metod: antijen içeren dokuya özel işaretsiz antikor (primer antikor) ile inkube edilir, daha sonra işaretli sekonder antikor uygulanır. DİREKT İMMUNOHİSTOKİMYA DOLAYLI İMMUNOHİSTOKİMYA İMMUNOHİSTOKİMYA TEM SEM Çalışma Soruları 1) Dokudaki antijenik yapıları saptamak için kullanılan histolojik teknik ………………………. dır. 2) Hematoksilen ve eosin ile boyanan dokularda hücre nükleusu …………….. renkte görülür. 3) Rutin ışık mikroskobik inceleme için doku genellikle ………………… içine gömülür. 4) Asidofilik yapılar …………………… boyalar ile boyanabilir. 5) Rutin ışık mikroskupu ile ……………. büyütme elde edilebilir.