Immunoanalyse avec traceur PDF

13/12/2022 Immunoanalyse avec traceur De nombreux types de traitements préalables de l’échantillon (prélèvements, ≠séparations, précipitations, ≠manipulations) Titre de l’Ac, ou/et {Ag}  Ou des immuncomplexes non-précipitants et non-agglutinants....

13/12/2022 Immunoanalyse avec traceur De nombreux types de traitements préalables de l’échantillon (prélèvements, ≠séparations, précipitations, ≠manipulations) Titre de l’Ac, ou/et {Ag}  Ou des immuncomplexes non-précipitants et non-agglutinants. Bcp d’opérations conduisent à une perte d’analyte (Quant. & qualit.) qui doit être évalué le + précisément possible ( ~ nmol/L) 1  13/12/2022 LE SYSTEME REVELATEUR formés de 2 éléments : un traceur (fluorochrome, enzyme, or colloïdal, etc.) qui permet de voir l'immunoréaction  (émetteur de signal) un système assurant la liaison entre le traceur et l'anticorps. $ Liant L’ensemble de ces deux éléments est souvent appelé marqueur ou sonde. $ Liant Libre ou lié sur support (artificiel ou naturel) L’antigène (protéine marquée) anticorps/antigène Immunodétection IgM IgG Le traceur (émetteur de signal) qui ne doit Radioactif pas modifier la réactivité Enzyme/Chromogène immunologique de Fluorescence l'antigène ou de l'anticorps. Particule métallique 2  13/12/2022 L’immunoanalyse avec sonde Radioactif Enzyme/Chromogène Fluorescence Particule métallique Approches d’étude (méthodes) ≠ I. M. Directes II. M. Indirectes III. M. Anti-complémentaires IV. M. Sandwich 3  13/12/2022 1. Une préparation (tissus, cellules, organites subcellulaires, virus, suspensions…) contenant l’antigène à étudier… 2. Un anticorps dirigé contre l’antigène recherché 3. un système d’observation ou/et de révélation qui permet de « visualiser » l’immunoréaction. Tissu, cell. Support naturel ou artificiel 13/12/2022 09:48 4  13/12/2022 Les marqueurs luminescents: « photoluminescents » ou « chimiluminescents » Les différents types de luminescence utilisés en immunoanalyse se distinguent par le type d'excitation et d'émission : Énergie d'excitation Type d'émission Lumineuse Photoluminescence Fluorescence Phosphorescence Chimique Chimiluminescence Réaction chimique Chimiluminescence Système enzymatique Bioluminescence Les types d'émission se distinguent par le mode de retour du traceur de l'état excité à l'état fondamental. 13/12/2022 09:48 E emission = h/lem < Eexcitation = h/lexc Fluorescence : émission s’arrête si l’excitation s’arrête Phosphorescence: émission continue même si l’excitation s’arrête 13/12/2022 09:48 5  13/12/2022 La longueur d'onde de la lumière d'émission est toujours plus élevée que celle de la lumière d'excitation. Loi de Stokes : Fluorophores e > a 13/12/2022 09:48 13/12/2022 09:48 6  13/12/2022 L’immunofluorescence 1-Si l'on veut détecter une substance X soluble ou non(donc fixée) dans la cellule, on l'utilise comme un antigène en l'injectant à un lapin. Celui réagit en fabriquant des anticorps (immunoglobulines) anti-X. 2-Sur la préparation cellulaire ou tissulaire, les anticorps anti-X se fixent spécifiquement sur X. 3-On pourrait fixer une molécule de fluorescéine directement sur ces anticorps mais il est plus aisé d'utiliser des anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de lapin soudés à une molécule de fluorescéine. 4-Sur la préparation cellulaire, les anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de lapin se fixent spécifiquement sur les anticorps de lapin anti-X. 5-Observée en lumière ultraviolette, la fluorescéine fixée « fluoresce » en vert et permet de localiser la substance X. Immunohistofluorimétrie 7  13/12/2022 L'immunohistochimie (IHC) est une méthode qui permet de détecter des protéines ou d'autres antigènes dans des sections de tissu. À cet effet, les sections sont exposées à des anticorps marqués dirigés contre des épitopes de la protéine cible. Il est alors possible de visualiser une cible à l'aide d'un marqueur, par exemple, d'un colorant fluorescent, Image A : Fixation formaldéhyde 4%, perméabilisation au méthanol. Anticorps primaire anti-GFAP (La protéine acide fibrillaire gliale : filament intermédiaire présent dans certaines cellules gliales du système nerveux central, les astrocytes) révélé par un anticorps secondaire couplé à l'Alexa 488. Image B : Triple marquage A2B5, GFAP, DAPI obtenu par la succession des réactions suivantes : Marquage de surface avec anticorps primaire monoclonal de souris A2B5 Fixation au formaldéhyde 4%, perméabilisation au méthanol Anticorps primaire de lapin anti-GFAP Révélation simultannée des 2 anticorps avec un anti-souris-Cy3 (rouge) et un anti-lapin- Alexa 488 (vert) Coloration au DAPI (bleu) pour le marquage des noyaux. 8  13/12/2022 Avantages : Avantages : immunoréaction la plus simple et la plus simple, rapide (une seule étape), bon marché idéal pour les marquages multiples, en principe plus sensible qu'une distance minimale entre traceur et antigène : immunoréaction directe : plusieurs anticorps c'est la technique de marquage la plus précise. secondaires peuvent en effet se fixer sur Inconvénients : l'anticorps primaire peu d'anticorps directement marqués : Inconvénient : fréquente nécessité de marquer soi-même Environ 2 fois plus long qu'une l'anticorps, immunoréaction directe ; il y a 2 étapes de plus sensibilité réputée inférieure à celle des que dans une réaction directe : 1 anticorps techniques "en plusieurs étapes" secondaire et 1 lavage supplémentaires. 9  13/12/2022 IF anti-complémentaire Techniques "sandwich" ou "bridge" Un anticorps est pris en sandwich (il sert de pont ou "bridge") entre l'anticorps primaire et le système révélateur. L'anticorps secondaire doit pouvoir reconnaître le premier et le troisième anticorps : ceux-ci doivent donc provenir de la même espèce (ou d'espèces voisines dont les immunoglobulines sont reconnues par le 2°anticorps). En A est illustrée une technique sandwich en 4 étapes où le marqueur est un anticorps dirigé contre le traceur Pour réduire le nombre d'étapes à 3, l'anticorps anti-traceur peut être combiné au préalable avec le traceur, et le complexe formé utilisé comme révélateur En B le traceur est chimiquement fixé sur le 3° anticorps ce qui réduit aussi à 3 le nombre d'étapes de marquage. 10  13/12/2022 Staphylococcus aureus L'anticorps secondaire (étape 2) peut être remplacé par la protéine A ou par la protéine G, qui permettent d'utiliser des anticorps primaires et tertiaires d'espèces différentes, comme indiqué sur le schéma ci-dessous. Attention ! Les protéines A et G ne réagissent cependant pas avec toutes les immunoglobulines Immunofluorescence : imagerie 11  13/12/2022 Epifluorescence Ils comportent deux filtres et un miroir particulier, « dichroïque » qui réfléchit certaines longueurs d'onde et qui est traversé par d'autres. Acquisition spectrale Signatures spectrales des sondes 12  13/12/2022 Immunofluorimétrie Spectrofluorimètre DOf= flCf C=[Ag-Ac] EXEMPLES DE REALISATION D'IMMUNOMARQUAGES Marquage de virus en suspension Marquage de cellules en suspension Marquage de cellules en culture Marquage de coupes de tissus frais Marquage de tissus en préinclusion Marquage de coupes de tissus (post-inclusion). 13  13/12/2022 Cytométrie de flux. (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter) La cytométrie de flux est une méthode fiable de comptage de cellules vivantes. utilisée en immunocytochimie pour l’étude des cellules. surtout pour le tri cellulaire Immunocytofluorimétrie de flux Principe de l’immunocytofluorimétrie échantillon Les cellules sont dispersées Composants Composants dans du sérum physiologique électroniques Optiques Buse et sont irradiées par un Fluorescence faisceau de lumière laser. Vibreur Rouge Lumière émise  30.000 cycles /s Les cellules qui émettent de la Verte fluorescence sont reconnues absorption par une cellule Faisceau diffusion laser photoélectrique particulière. Lumière transmise diffraction un système électronique pour fenêtre convertir les signaux optiques Analyse (photons) en des signaux informatique électroniques (volts). Les signaux sont ainsi récoltés par Gouttelettes chargées des photomultiplicateurs, afin SIGNAL DE TRI + Représentation - + ou - selon le signal d’être amplifiés, numérisés et ° de tri (ionisation) stockés dans un ordinateur graphique CHOIX DES Plaques CRITERES + - déflectrices Tri basse vitesse 3 000 Imprimante cellules/seconde (pour la majorité des types cellulaires) Stockage Tri haute vitesse 30 000 cellules des données par seconde. Cependant certains ICFF permet de types cellulaires ne supportent pas traiter 3000 C. /s t Collecte le tri à haute vitesse. d ’erreur # 1% des cellules 14  13/12/2022 Les cellules en suspension dans un flux liquidien passent une à une dans un faisceau laser. La diffusion physique de la lumière émise par la source lumineuse est dépendante de la taille et de la granularité cellulaire (contenu en granule, structure plus ou moins segmentée du noyau) La diffusion dans l’axe de la source lumineuse (forward scatter, FSC) renseigne sur la taille, la diffusion à 90°C (side scatter, SSC) renseigne sur la granularité ou structure 15  13/12/2022 "granulosité" 73% de granulocytes « MV23D » 12.5% LB 3.8% LT 1.8% monocytes Applications en Immuno: Mise en évidence d'Ag et/ou d'Ac au niveau cellulaire ou tissulaire Typages cellulaires: Lymphocyte T et B Recherche d'autoanticorps : Ex: Ac Anti-DNA (LED= Lupus Erythémateux disséminé), Ac Anti cellules b pancréatiques dans le diabète sucré, anticorps antimuscle dans certaines myopathies... Recherche de dépôts d'immuns complexes au niveau de certains organes dans les réactions d'hypersensibilités de type III. Applications en parasitologie: Diagnostic d'amibiase hépatique, de bilharziose, de kyste hydatique. Applications en mycologie médicale: Identification de champignons pathogènes. Dosage des anticorps IgG anti-tréponèmes Applications en virologie:herpès, condylomes, chlamydioses,. Mise en évidence de souches virale (grippe, poliomyélite, VIH...) Diagnostic de la syphilis (IF sur frottis de sérosité ou de chancre) Diagnostic de la coqueluche (IF sur frottis de mucus nasal) Recherche d' E.Coli entéropathogène chez le nourrisson. 16  13/12/2022 Les éléments du dosage des IgG anti-trépo Bactérie: Treponema pallidum Observation de l'émission Fixation du conjugué sur la de fluorescence quantité: Fixation des Anticorps partie Fc (chaînes gamma) charge bactérienne) sur les tréponèmes. des IgG. Immunophénotypage des Leucocytes du sang Mais Les érythrocytes non-nucléés constituent la population majeure dans le sang et leur grand nombre va réduire la vitesse d’analyse des leucocytes. donc les leucocytes ==> être isolés: - par centrifugation sur gradient de densité. - par lyse des érythrocytes anti-CD45 (Gp présente sur les leucocytes et non sur les plaquettes et les érythrocytes) - anti-Glycophorin A (erythr+/lympho-) LEUCEMIE LYMPHOME typage Grandes avancées sur la découverte des maladies cancéreuses du sang/ Diagnostic précoce. 17  13/12/2022 Principe de base: Au cours d’un immunodosage , et après la réaction Immun. Ag-Ac On effectue une réaction enzymatique sur un substrat approprié Produit dosable photométriquement par Absorption Ag-Enz + Ac  Ag-Enz + S  Ag-Enz- S Ac Ac Ag-P  Ag-ES Ac Ac DO=lC 18  13/12/2022 Le traceur enzymatique Rappels Une enzyme : mol de MM élevée, capacité de reconnaissance spécifique du substrat  induit réaction de transf. Spécifique. 2 parties : * protéique apoenzyme * non protéique le coenzyme Classement en 6 classes: Chaque classe est subsivisée en S/classes, SS/ 1. Les oxydoreductases classes… avec des n°  fonctions particulières 2. Les transferases 3. Les hydrolases 4. Les lyases 5. Les isomérases 6. Les ligases 19  13/12/2022 Couplage au moyen de la glutaraldéhyde Simple et efficace Très répandue en immunoanalyse 2 Ac/enzyme Couplage au moyen du périodate Oxydation de résidus hydroxyles en aldéhydes actifs. 20  13/12/2022 Couplage au moyen de la benzoquinone Fait intervenir des groupements amine et sulfhydryles des Ac Couplage au moyen du système avidine-biotine Avidine: glycoprotéine PM 66000 extraite de l’œuf elle lie 4 mol. de petite taille, la biotine ou Vit H. (Kd= 10-15 mol.l-1) 21  13/12/2022 L’ELISA ELISA : enzyme linked immuno sorbant assay « Ou dosage par révélation enzymatique d’un complexe antigène-anticorps adsorbé sur un support » Le support est une plaque de microtitration de 96 puits. Cette plaque est moulée dans un plastique qui peut adsorber des protéines, comme des Ac. Il existe plusieurs types d’ELISA, selon la molécule greffée à la surface. 22  13/12/2022 La méthode ELISA Principes de base (méthode classique) « Activation » plaque de PVC « Ac (bon titre) Adsorption » ajoute BSA + lavage 1 nuit glutharaldéhyde 1% étuve 90° «ajout de l’Ag » « ajout de second Ac » « ajout du substrat de l’enz» Lecture DO Incubation à 37°C ou Ag-Enz » Cinétique enzymatique par spectro ELISA +lavages Arrêt: inhibiteur, dénaturation chim ou therm Résumé ELISA 23  13/12/2022 Variante 2 1 Anti-IgG-Enz 2 Substrat 3 ELISA Indirecte Recherche et dosage des drogues ou substances anabolisantes dans les urines (Dopage): Les drogues (antigènes) sont les amphétamines, barbituriques, opiacés. Les substances dopantes: Les EPO Hormone glycoprotéique (actuellement fabriquée par génie génétique), cette substance est très dangereuse. C'est la version synthétique de l'hormone qui stimule chez l'homme la production de globules rouges du sang, transporteurs d'oxygène. Elle augmente ainsi les performances dans les sports d'endurance. Cette substance remporte un large succès auprès des sportifs du fait qu’elle est très efficace et également très difficile a détecter car le test permettant la détection est très coûteux (environ 1500$ par test) et nécessite plusieurs jours d’analyse. Du fait qu'elle épaissit le sang, L'EPO peut provoquer la formation de caillots et créer ainsi des accidents vasculaires cérébraux ou des infarctus. La transpiration excessive augmentent encore le danger de formation de caillots sanguins. 24  13/12/2022 Dosage radio-immunologique RIA C’est une méthode dosage et d’analyse quantitative basée sur le principe de la réaction antigène-anticorps associée à un complément radioactifs (un radio-isotope). Elle est caractérisée par sa grande sensibilité et sa grande spécificité. 25  13/12/2022 Rappels : Dans la nature, la plupart des noyaux d’atomes sont stables. Certains atomes ont des noyaux instables, Ils sont dits « radioactifs » et sont appelés « radio- isotopes » ou « radionucléides ». Lorsqu’un atome dont le noyau est instable se désintègre, une transformation nucléaire se produit. Ils émettent un ou plusieurs types de rayonnements (radiations): (α), (β) et (γ). Naturelle (14C, 10K, 226Ra …) 274 isotopes Artificielle (3H, 131 I, 35S …) 1200 isotopes On note Z le nombre de proton Z est le nombre de charge N° Atomique On note A le nombre de nucléon A est le nombre de masse On note N le nombre de neutron le même Z mais un A différent sont des isotopes proton p+ le même A mais un Z différent sont des isobares neutron n° le même N mais un Z différent sont des isotones électron e- Le carbone 12 (six neutrons) et le carbone 14 (huit neutrons) sont deux isotopes du carbone. Désintégration s’accompagne d’une émission de différents types de rayonnements: papier Feuille verre aluminium Radiation corpusculaire (peu pénétrante) -En perdant des protons et --des neutrons (alpha) -En transformant un neutron en proton (beta) Radiation électromagnétique Plaque Béton de plomb (très pénétrante) En émettant des photons 26  13/12/2022 Les isotopes utilisés en immunologie : Désintégration par Capture Electronique : un noyau atomique déficient en neutrons absorbe un électron situé sur une couche électronique de l’atome. 27  13/12/2022 Compteur g Compteur b Valable pour 14C, 24 Na, 35S, 125I car > 30 KeV. Ag-Ac marqués Solvant Fluorochromes Photons ( hg ) Électrons (e-) Analyseur Pré-ampli Amplificateur Discriminateur Compteur 28  13/12/2022 LES TYPE DE RADIODOSAGE METHODE PAR COMPETITION (RIA) (défaut Ac / excès Ag) METHODE SANDWICH (IRMA) (excès Ac / défaut Ag) [Ag froid] = Zero 100% 100% 40% [Ag froid] = faible quantité 100% 100% 33% [Ag froid] = quantité moyenne 100% 100% 20% 29  13/12/2022 [Ag froid] = quantité importante 100% 100% 13.3% Courbe de compétition % bound = B/F x 100 40% Courbe standard 33% « d ’affinité X? « d ’inhibition 20% « dose-réponse 13% « pulse-chasse y Concentration en antigène « froid » 30  13/12/2022 Dosage RIA type Le ligand radio marqué peut être la protéine A du staphylocoque, qui se fixe sur la région Fc des IgG ou indirectement sur un anticorps spécifique de l’anticorps à doser (on peut distinguer même des isotypes en utilisant un ligand spécifique d’une classe ou s/classe particulière d’Ig METHODE SANDWICH (IRMA) (excès Ac / défaut Ag) Elle se caractérise par : La présence d’Ac en excès L’utilisation d’un 2ème Ac marqué 31  13/12/2022 Autoradiographie Dot-Blot Immunoblot Anode + Western blot Cathode - 32