Guiá P2 BCBD 2023-2024 (PDF)

P2 BCBD 1 P2 BCBD 2 P2 BCBD PRÀCTICA 2 La granota africana (Xenopus laevis), com a model de desenvolupament de vertebrats. OBJECTIUS GENERALS L’objectiu d’aquesta pràctica és estudiar els principals processos de creixement i diferenciació que tenen lloc durant les primeres etapes del desenvolupament...

P2 BCBD 1 P2 BCBD 2 P2 BCBD PRÀCTICA 2 La granota africana (Xenopus laevis), com a model de desenvolupament de vertebrats. OBJECTIUS GENERALS L’objectiu d’aquesta pràctica és estudiar els principals processos de creixement i diferenciació que tenen lloc durant les primeres etapes del desenvolupament embrionari dels vertebrats, des de la fecundació i l’establiment del zigot fins a la formació de l’organisme pluricel·lular. En aquesta pràctica s’utilitza com a model animal d’estudi la granota sud-africana Xenopus laevis. https://www.xenbase.org/ PER QUÈ XENOPUS? Per a l’estudi de processos complexos, com ara el desenvolupament embrionari, cal treballar amb organismes fàcilment manipulables. En el cas de la granota Xenopus es donen un seguit de característiques que l’han convertit en un dels principals models d’estudi en aquest àmbit. Les raons són les següents:      El manteniment d’un elevat grau de conservació dels mecanismes cel·lulars i moleculars més essencials. La facilitat d’obtenció de grans quantitats de material per a l’estudi (ous). El fet que els ous siguin grans (superiors a 1 mm de diàmetre) i fàcils de manipular. La facilitat de seguir-ne el desenvolupament amb el microscopi estereoscopi o lupa. Són organismes amb fecundació externa i per tant són fàcils de fecundar al laboratori. 3 P2 BCBD GAMETOGÈNESI Procés de formació dels gàmetes. Ovogènesi  formació i diferenciació dels gàmetes femenins o òvuls. El ous de Xenopus són del tipus heterolecítics perquè contenen vitel distribuït de manera heterogènia. Espermatogènesi  formació i diferenciació dels gàmetes masculins o espermatozoides. OBSERVACIÓ 1: seccions histològiques d’ovari i testicle de Xenopus o OVARI: Identifica els fol·licles ovàrics amb les cèl·lules fol·liculars, els oòcits (nucli, nuclèols, i plaquetes vitel·lines al citoplasma). En alguns nuclis es poden distingir els cromosomes plomosos. o TESTICLE: Identifica els tubs seminífers, la disposició cel·lular en forma d’anell en les seccions transversals dels tubs i les diferències fenotípiques de les cèl·lules en les diverses fases de l’espermatogènesi. Ovari Xenopus 200X Testicle Xenopus 200X Unitat de Biologia Cel·lular, Dept. de Biomedicina, UB Unitat de Biologia Cel·lular, Dept. de Biomedicina, UB 4 P2 BCBD FECUNDACIÓ Consisteix en la fusió de l’òvul i l’espermatozoide i la formació del zigot. A la fecundació externa es produeix l’expulsió dels ous de manera simultània a l’alliberació del líquid seminal al medi aquàtic. OBSERVACIÓ 2. Vídeo: “Obtenció i fecundació d’ous de Xenopus” o El vídeo mostra el procés experimental de l’obtenció d’ous de Xenopus i la fecundació in vitro. En condicions naturals, la femella ovula en resposta als canvis ambientals estacionals. El mascle abraça la femella i, a mida que ella va ovulant, ell va alliberant l’esperma sobre els ous. Al laboratori, l’ovulació s’indueix injectant l’hormona gonadotropina a la femella. La fecundació es fa en una placa de Petri, dipositant l’esperma obtingut del mascle a sobre de la posta d’ous. - Preparació hormonal de la femella per induir-ne l’ovulació: 200 U. I. de gonadotropina de sèrum d’euga 4 dies abans 800 U. I. de gonadotropina coriònica humana 12 hores abans - Obtenció d’esperma per a la fecundació després de la dissecció del mascle i aïllament dels testicles. - Fecundació: Amb un massatge suau es fan sortir els ous de la femella. Els ous s’adhereixen a la placa sense orientació específica. A continuació, es deposita l’esperma a sobre dels ous. Una solució de cisteïna serveix per dissoldre la coberta gelatinosa dels ous. - 40 minuts després de depositar l’esperma, se separa la membrana vitel·lina de la superfície de l’ou en aquells que s’han fecundat i s’engrandeix l’espai perivitel·lí. Així, es deixa espai per a la rotació de l’ou. Els ous fecundats s’orienten amb el pol animal (fosc) mirant cap amunt. - La primera divisió es produeix 90 minuts després de la fecundació. A continuació, se’n produirà una cada 20 o 25 minuts segons la temperatura. - Als embrions d’un dia després de la fecundació (fase 22 de la taula de Nieuwkoop and Faber) se’ls pot veure la línia de sutura del tub neural. Els embrions s’han allargat i estan dins de la membrana vitel·lina. - Els embrions de dos dies han trencat la membrana vitel·lina (eclosió) i ja poden desplaçarse per l’aigua gràcies als moviments de la cua. - Als embrions (larves) de tres dies se’ls pot observar l’allargament anteroposterior. - A partir dels quatre dies, les larves ja s’alimenten de la pols d’ortigues i del llevat que se’ls dona. - La metamorfosi es produeix uns dos mesos més tard. 5 P2 BCBD PRIMERES ETAPES DEL DESENVOLUPAMENT SEGMENTACIÓ Es caracteritza per divisions cel·lulars mitòtiques successives. És total (HOLOBLÀSTICA) i desigual. Les cèl·lules resultants s’anomenen blastòmers. Augmenta el nombre de cèl·lules, però la mida de l’embrió no varia. Gilbert Developmental Biology. 6a ed. 2000. http://www.sinauer.com/ OBSERVACIÓ 3: Seccions histològiques de blàstula de Xenopus o Identifica les diferents cèl·lules o blastòmers que formen l’embrió les quals que són més petites i pigmentades en el pol animal (micròmers), i més grans i sense pigment en el pol vegetal (macròmers). Diferencia la blàstula primerenca de la tardana. Identifica la cavitat dins la blàstula o blastocel. BLÀSTULA PRIMERENCA BLÀSTULA TARDANA Unitat de Biologia Cel·lular, Dept. de Biomedicina, UB 6 P2 BCBD GASTRULACIÓ Etapa en la qual, a partir d’una sèrie de moviments morfogenètics o reorganitzacions cel·lulars, s’estableixen les tres capes germinatives primordials: ectoderma, mesoderma i endoderma. S’inicia amb la formació d’una petita invaginació al costat dorsal de la blàstula: el llavi dorsal del blastòpor. Es forma una nova cavitat, l’arquènteron. L’embrió resultant s’anomena gàstrula. OBSERVACIÓ 4: Seccions histològiques de gàstrula de Xenopus o Identifica el llavi dorsal del blastòpor, la cavitat blastocel, la cavitat arquènteron, el blastòpor o tap vitel·lí, l’ectoderma, el mesoderma i l’endoderma. Unitat de Biologia Cel·lular, Dept. de Biomedicina, UB 7 P2 BCBD NEURULACIÓ Etapa caracteritzada pels fenòmens d’inducció. El mesoderma, concretament el notocordi, envia senyals moleculars a l’ectoderma dorsal per a la formació del tub neural. L’embrió resultant s’anomena nèurula. OBSERVACIÓ 5: Seccions histològiques de nèurula de Xenopus o Identifica el notocordi, la placa neural, les crestes neurals, el tub neural, els somites, l’ectoderma, el mesoderma i l’endoderma. Unitat de Biologia Cel·lular, Dept. de Biomedicina, UB 8 P2 BCBD TAULA DE NIEUWKOOP-FABER (NF) 9 P2 BCBD Nieuwkoop, P. D. and Faber, J. (1967) Normal Table of Xenopus laevis (Daudin), North Holland, Amsterdam. XENOPUS SENCERS EN DIFERENTS ETAPES DEL DESENVOLUPAMENT OBSERVACIÓ 6: o Observa a simple vista les preparacions en blocs de resina de Xenopus sencers en les diverses fases del cicle vital. OBSERVACIÓ 7: o Observa amb el microscopi estereoscòpic o lupa els ous no fecundats i embrions sencers de Xenopus en les diverses etapes del desenvolupament (mantinguts amb alcohol dins de flascons petits). o Observa els embrions i compara’ls amb els esquemes corresponents de la taula de NieuwkoopFaber, que és la taula d’identificació de les etapes del desenvolupament embrionari de Xenopus leavis. 10