Estructura de Células Procariotas PDF

Práctica 2 Estructura de células procariotas OBJETIVO El alumno será capaz de identificar las diferencias entre células eucariotas y procariotas, la forma taxonómica y morfológica de las bacterias, los fundamentos de la tinción de Gram y de la terapia antimicrobiana....

Práctica 2 Estructura de células procariotas OBJETIVO El alumno será capaz de identificar las diferencias entre células eucariotas y procariotas, la forma taxonómica y morfológica de las bacterias, los fundamentos de la tinción de Gram y de la terapia antimicrobiana. MATERIALES -Microscopio óptico -Aceite de inmersión -Cultivos bacterianos (Gram positivos y Gram negativos) -Asa bacteriológica -Puente de tinción -Cubeta para tinción -Cerillos o encendedor -Mechero de alcohol -Sanitas o servitoallas -Lápiz de tungsteno o rotulador para laminilla -Laminillas -Pipeta -Guantes -Agua destilada -Reactivos de tinción de Gram (yodo lugol, alcohol acetona, safranina y violeta de genciana) Introducción La rama de la biología encargada del estudio de las bacterias se denomina Bacteriología y su historia se remonta hasta 1673 cuando Antón Van Leeuwenhoek (Padre de la Microbiología) observó y describió diversos microorganismos, entre los cuales se encuentran las bacterias, realizando múltiples observaciones que sentaron las bases de esta rama de la biología. Posterior a esto el científico Louis Pasteur se encargo de demostrar que los procesos de fermentación son realizados por algunos de estos microorganismos entre los años 1857 y 1861 y algunos otros son causantes de múltiples enfermedades, a la par el científico Robert Koch realizo los postulados de kochen el año 1882 los cuales sirven para relacionar un microrganismo con una determinada enfermedad. 1  Sin embargo fue hasta 1977 cuando Carl Woese y colaboradores proponen las posibles relaciones genéticas de los seres orgánicos en base a sus características filogenéticas, agrupándolos en tres dominios (Bacteria, Archaea y Eukarya) unidos en un único ancestro en común (LUCA). Clasificación de Woese (sistema de 3 dominios) https://www.lifeder.com/dominios-biologia-woese/ Las bacterias son organismos procariotas los cuales se encuentran agrupadas en el dominio Bacteria y Archaea, mientras que en el reino Eukarya se encuentran distribuidos los organismos compuestos por células eucariotas. Dentro del dominio Archaea se encuentran organismos denominados extremófilos, los cuales tienen la característica de que pueden sobrevivir en condiciones ambientales extremas, estos microorganismos se clasifican en: Metanófilos: Microorganismos con la capacidad de generar a partir de CO2 e H+ metano para sus requerimientos metabólicos. Halófilos: Microorganismos con la capacidad de sobrevivir en medios extremadamente salados como el mar muerto cuyo contenido de sal es de 340 gramos por litro. Acidófilos: Microorganismos con la capacidad de sobrevivir en ambientes con pH extremadamente bajos entre uno y cero. Termófilos: Microorganismos con la capacidad de sobrevivir en temperaturas extremadamente elevadas o extremadamente bajas. 2 Práctica 2 GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS Las Bacterias son organismos unicelulares pertenecientes al reino procariota, que carecen de organelos membranosos como el núcleo, aparato de Golgi o retículo endoplásmico y tienen la capacidad de reproducirse de manera asexual. El tamaño de estos microorganismos va desde 0.1um hasta 5um. Membrana Celular La membrana celular es una estructura lipídica dispuesta en bicapa que rodea a la célula, cuya principal función es controla el transporte de sustancias entre el medio interno y el medio externo de la célula, permitiendo el intercambio de nutrientes y desechos metabólicos. Pared Celular La pared es el componente más externo de las bacterias (con excepción de las bacterias que poseen cápsula y aquellas que solo poseen membrana como Mycoplasma spp). La principal función de la pared celular es proteger a la bacteria de agentes externos. Es una estructura rígida de grosor uniforme (20 a 80 nm en las bacterias gram positivas) y que, como consecuencia del mismo, les da las formas características a las bacterias (cocos, bacilos y espiroquetas). La pared celular esta conformada mayoritariamente por peptidoglucano (también conocido como mucopéptido o mureína) (Figura 1), al cual se le pueden unir de forma covalente otras estructuras como lipopolisacáridos, ácidos teicoicos etc. Al contrario de los gram positivos, la pared celular tiene un grosor aproximado de entre 5 y 10 nm. El peptidoglucano está constituido de N-acetil glucosamina y N-acetil murámico. Estos se encuentran alternados en cadenas largas. Estos se encuentran entrelazados unos con otros a través e un tetrapéptido formado por L-alanina, G- glutamato, L-lisina y D-alanina que se extiende desde el N-acetil murámico. Estructuralmente hablando, la pared celular de las bacterias es mucho mas gruesa, debajo de la misma se encuentra la membrana celular. Figura 1. Estructura del peptidoglucano. Los peptidoglucanos es un polipéptido formado por N-acetil glucosamina y N-acetil murámico, los cuales están entrelazados en cadenas largas. Dichas cadenas pueden unirse entre si a través de tetrapéptidos formado por L-alanina, D-glutamato, L-lisina y D-alanina. Práctica 2 3 Contrario a la pared de las gram negativas, ya que la estructura más externa es la denominada membrana externa, seguida de una capa delgada de peptidoglucano, seguido de la membrana interna (figura 2). Estas diferencias en el arreglo estructural permiten a estas bacterias ser diferenciadas mediante técnicas de tinción. Figura 2. Pared celular de las bacterias. La pared celular de las bacterias gram positivas tiene una pared gruesa de peptidoglucano, mientras que la pared de las gram negativas tiende a ser más delgado, asi mismo, esta se encuentra entre la membrana interna y externa. Cápsula La capsula es una estructura externa gelatinosa hecha de polisacáridos que presentan algunos tipos de bacterias que tiene la finalidad de proteger a la bacteria contra la desecación y fagocitosis, ayuda en la adherencia a superficies y en la formación de biopelículas. Citoplasma El citoplasma es el medio que contiene la célula, es rico en agua, enzimas, nutrientes, desechos y gases, en el cual ocurren la mayoría de las reacciones metabólicas de la célula. Nucleoide El nucleoide es la región dentro del citoplasma no rodeada por una membrana, la cual contiene el ADN bacteriano, el cual se encuentra generalmente constituido como una molécula circular bicatenaria asociado a proteínas no histonicas la cual controla las actividades de la célula y la herencia. Práctica 2 3 Plásmidos Los plasmidos son pequeñas moléculas de ADN circular que se replican independientemente del ADN cromosómico, los cuales pueden conferir ventajas selectivas, como resistencia a antibióticos o capacidad de metabolizar compuestos inusuales. Ribosomas Los ribosomas son estructuras constituidas de ARN y proteínas que se encargan de la traducción proteica, tienen la característica de ser 70S y se encuentran formado por dos subunidades una 30S y otra 50S. Flagelos Los flagelos bacterianos son filamentos largos y delgados que se extienden desde la membrana celular los cuales proporcionan movilidad a la célula, permitiéndole moverse hacia ambientes favorables o alejarse de los desfavorables (quimiotaxis), según su ubicación podemos clasificar a las bacterias en monotricos, lofotricos, anfitricos, peritricos y atricas. ChatGPT. (2024). Clasificación de las bacterias según la ubicación de sus flagelos. Generado por ChatGPT de OpenAI. Fimbrias y Pili Son estructuras similares a pelos cortos y delgados en la superficie de la célula. Las fimbrias son importantes para la adherencia a superficies y en la formación de biopelículas. Los pili (especialmente el pili F o de conjugación) son importantes para la transferencia de material genético entre bacterias (conjugación). Práctica 2 5 Endosporas Las endosporas son estructuras resistentes formadas por algunas bacterias bajo condiciones adversas las cuales permiten la supervivencia en condiciones extremas de temperatura, desecación y radiación. Dato de nomenclatura: Las bacterias para su estudio se nombran siguiendo las siguientes reglas: Primero se coloca el género Segundo se coloca la especie La primera letra del Género debe ir en mayúsculas La primera letra de la especie debe ir en minúsculas Siempre se debe escribir el nombre en cursiva Ejemplo: Escherichia coli / E.coli spp CLASIFICACIÓN Existen diversas formas para poder clasificar a las bacterias , dentro de las que se destacan las clasificaciones: morfológica (Cocos, bacilos y espirilos), metabólica (Aerobios y anaerobios estrictos o facultativos) y de acuerdo a su pared celular (Gram positivos, Gram Negativos y BAAR), para fines de practicidad nos enfocaremos en la clasificación en base a su pared celular o también llamada clasificación de Gram. TINCIÓN DE GRAM La tinción de Gram es una de las técnicas más antiguas en cuanto a identificación de microorganismos se refiere. Fue introducida por primera vez por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1882 con el objetivo de identificar los patógenos causantes de neumonía. Actualmente la tinción se utiliza para la identificación microscópica en muestras clínicas o subcultivos de bacterias causantes de diversos cuadros infecciosos. En ese momento solo estaba disponible la tinción para la identificación del bacilo Mycobacterium tuberculosis causante de la tuberculosis. Gram incorporó a su método el colorante cristal violeta (violeta de genciana) como colorante principal. Posteriormente adicionó solución yodada como mordiente seguido de un tratamiento con etanol como decolorizante. Se percató que las bacterias causantes de neumonía se teñían de un color violeta. Gram demostró que su técnica teñía las bacterias causantes de la artritis supurativa seguida de la fiebre escarlata (Streptococcus del grupo beta hemolíticos). Por otro lado, se percató que la bacteria causante de fiebres entéricas (Salmonella tiphy) de decoloraba después del tratamiento con etanol. Así nacía la clasificación que utilizamos actualmente para la identificación de bacterias. Práctica 2 5  La tinción de Gram es una de las principales técnicas utilizadas en microbiología, ya que es el primer paso para la identificación de una bacteria. Esta tinción distingue entre las bacterias Gram positivas (color violeta) y las bacterias Gram negativas (color rojo). Así mismo, esta tinción nos permite ver las formas de las bacterias, se pueden observar cocos (bacterias redondas) o bacilos (bacterias alargadas). Además, esta tinción nos permite observar las estructuras de otros patógenos como hongos y parásitos. En la tabla 1 se muestran las bacterias de importancia clínica y al grupo que pertenecen según su coloración. Existen otro tipo de bacterias cuya particularidad estructural, como la ausencia de pared celular, capacidad para invadir células, la presencia de estructuras externas como capsulas u otras moléculas en la pared como los ácidos micólicos, dificultan su identificación mediante la tinción de Gram. Por lo tanto, se debe hacer otro tipo de tinciones especiales (como la tinción de Ziehl-Neelsen) para su identificación. En la tabla 2 se ejemplifican algunas de las bacterias que no se pueden identificar con la tinción de Gram. Tabla 1. Bacterias de importancia clínica y su tipo de coloración. 6 Práctica 2  Tabla 2. Bacterias de importancia clínica que tienen una coloración variable con la tinción de Gram y bacterias que no se tiñen con tinción de Gram. PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS DE LA TINCIÓN DE GRAM En solución acuosa el cristal violeta (Figura 3) se disocia en cristal violeta con carga positiva y iones cloro con carga negativa. Estos penetran a través de la pared y la membrana tanto de bacterias grampositivas como gram negativas. El cristal violeta, con carga positiva, interactúa con las estructuras bacterianas con carga negativa, tiñendo a la bacteria de un color azul/violeta. Cuando se agrega la solución yodada (I- o I3-) interactúa con el cristal violeta para formar complejos cristal violeta-yodo en el citoplasma membrana y pared celular, estos complejos son grandes y estables. El agente decolorizante (etanol o una solución de etanol y acetona) interactúa con los lípidos de la membrana de gram positivos y gram negativos. La membrana externa de los gram negativos se pierde dejando expuesto los peptidoglicanos de la pared celular. La pared celular de los gram negativos es delgada a comparación a los gram positivos. Tienen en promedio 3 capas de peptidoglucano, estas se vuelven permeables al entrar en contacto con el etanol, liberando así el complejo cristal violeta-yodo de la bacteria. Al contrario de las bacterias gram negativas, el peptidoglicano de la pared de las bacterias grampositivas es más grueso y está entrelazado, al agregar el etanol, la bacteria se deshidrata. Este proceso atrapa el complejo cristal violeta-yodo dentro del peptiglucano. Por esto, después de la decoloración, las bacterias gram positivas permanecen de un color azul/violeta. Al final de la decoloración, se agrega safranina, la cual tiñe las bacterias gram negativas, las cuales perdieron el colorante primario. Adicionalmente, otra de las ventajas importantes que tiene la tinción de Gram, es que deja sin teñir los núcleos de las células eucarióticas. Lo que permite realizar la tinción de Gram con diferentes tipos de muestras biológicas. 6 Práctica 2  Figura 3. Estructura del colorante primario cristal violeta (violeta de genciana). Al disolverse en agua el cristal violeta se disocia en cristal violeta de carga positiva y iones cloro de carga negativa. MANEJO DE LA MUESTRA ·Preferentemente la muestra deberá ser tomada antes de la tinción. ·Realizar el extendido en un portaobjetos limpio, el cual se deja secar a temperatura ambiente. ·Posteriormente el portaobjetos se fija con calor, evitando quemar la muestra. SUGERENCIAS PARA LA TINCIÓN ·Para los lavados, el agua corriente se puede sustituir por agua destilada, esto para evitar la presencia de sales en la muestra. ·Las causas de precipitación durante la muestra se pueden deber a que el portaobjetos no estaba limpio o a que la fecha de caducidad del colorante haya expirado. ·En caso de que el colorante presente precipitaciones, se recomienda filtrar el mismo con un papel filtro (hasta un máximo de dos filtraciones), de lo contrario se tiene que preparar nuevamente el colorante y guardarlo en un frasco ámbar lejos de los rayos directos del sol. 6 Práctica 2  METODOLOGÍA 1.Colocar el portaobjetos previamente fijado en un puente de tinción. 2.Cubrir el portaobjetos con cristal violeta e incubar 1 minuto. 3.Escurrir el colorante, posteriormente cubrir el portaobjetos con yodo Gram e incubar por 1 minuto. 4.Lavar con alcohol acetona para decolorar, se deja actuar entre 5 y 15 segundos para los frotis delgados y de 15 a 60 segundos para los frotis gruesos. 5.Se enjuaga con agua destilada para remover el decolorante. 6.El frotis se cubre con safranina, se deja incubar por 1 minuto. 7.Lavar repetidamente el frotis con agua destilada hasta aclarar el mismo. Secar a temperatura ambiente y observar a objetivo de inmersión 100X. Figura 4. Esquema del procedimiento de la tinción de Gram. Proceso para realizar la tinción de Gram de acuerdo a la metodología detallada anteriormente. Figura 5. Bacterias gram positivas y negativas. Imágenes del resultado obtenido después de realizar la tinción de Gram observadas a objetivo de inmersión 100X. 6 Práctica 2  PRÁCTICA 1. Rótulo de la muestra. Usa un lápiz de punta diamante para rotular cada laminilla con la respectiva bacteria que albergarán. 2. Esterilizar asa bacteriológica y tomar muestra. Esterilización con calor, flameando el asa con ayuda del mechero hasta obtener un rojo vivo. Enfriar el asa bacteriológica entre el agar y la pared de la caja Petri. Tomar una colonia del cultivo bacteriano del que se tomará la muestra. 3. Frotis. Se realiza el extendido de las bacterias sobre la laminilla correspondiente al agente bacteriano en la parte media de la laminilla de forma circular, procurando colocar una buena cantidad de muestra. Tras el extendido volver a esterilizar el asa bacteriana con calor. 12 Práctica 2  4. Fijación. Después del frotis se fijará la muestra mediante el uso de calor deslizando la laminilla con la muestra sobre la llama del mechero, cuidando no exceder el tiempo sobre la llama. 5. Tinción de Gram: Colocar muestras sobre la gradilla para realizar tinción. 1. Cristal violeta: Con ayuda de la pipeta tomamos colorante cristal violeta y colocamos sobre las muestras procurando cubrir toda la muestra. El colorante permanecerá sobre las muestras durante 1 minuto. 2. Lavar la muestra: Con agua destilada quitaremos el exceso de colorante de las muestras. 3. Mordiente Yodo Lugol: Ayudándonos de una pipeta se colocará la solución Lugol cubriendo todo el frotis y manteniendo por 1 minuto sobre las muestras. 4. Lavar la muestra: Con agua destilada quitaremos el exceso de Yodo de las muestras. 5. Decolorante alcohol acetona: Aplicar la mezcla alcohol acetona permaneciendo sólo 30 segundos con ayuda de una pipeta. 6. Lavar la muestra: Con agua destilada quitamos el exceso de alcohol acetona de las muestras. 7. Contratinción: Con una pipeta tomamos colorante de Safranina y lo vertemos sobre las muestras, permaneciendo 1 minuto sobre las muestras. 8. Lavar la muestra: Aplicando agua destilada quitamos el exceso del colorante Safranina de las muestras. 12 Práctica 2 6. Secado. Con mucho cuidado secamos las muestras con ayuda de papel absorbente, realizamos este paso con mucha precaución, cuidando no barrer las muestras bacterianas. 7. Observación a través del microscopio. Siguiendo los pasos aprendidos en la práctica de microscopía, se observarán las muestras, haciendo hincapié a sus características y diferencias. Práctica 2 13