Summary

This document provides an overview of epigenomics, a field of biology that explores epigenetic mechanisms as a mean of gene regulation. It details methylation of DNA and modification of histones, epigenomic landscapes, and RNA-mediated epigenetic regulation. This document is a textbook on epigenomics.

Full Transcript

Epigenomika Epigenetski mehanizmi uravnavanja izražanja genov epi (gr.) – nad 1942, C. H. Waddington epigenetika veda, ki obravnava spremembe, ki vplivajo na izražanje genov, a niso vezane na spremembe v zaporedju DNA, npr. metilacija DNA, histonske modifikacije, utišanje...

Epigenomika Epigenetski mehanizmi uravnavanja izražanja genov epi (gr.) – nad 1942, C. H. Waddington epigenetika veda, ki obravnava spremembe, ki vplivajo na izražanje genov, a niso vezane na spremembe v zaporedju DNA, npr. metilacija DNA, histonske modifikacije, utišanje z mikro RNA ang.: epigenetics Uravnavanje aktivnosti genov s kromatinsko strukturo. Prof. dr. Tanja Kunej, Genomika, 2024-2025 1 Univerzitetni študijski program Biotehnologija, 2. bolonjska stopnja Glavne kategorije epigenetskih mehanizmov, ki modificirajo kromatinsko strukturo 1. Metilacija DNA 2. Histonske modifikacije: acetilacija histonov, metilacija histonov 3. Remodeliranje kromatina: 3a. vključevanje histonskih različic 3b. spreminjanje lokacije nukleosomov; repozicioniranje nukleosomov 4. Z RNA posredovano uravnavanje izražanja genov nekodirajoče RNA; mikro RNA, RNA-mediated epigenetics regulation 5. Epitranskriptomika, potranskcripcijske modifikacije, modifikacije RNA 6. Epiproteomika, potranslacijske modifikacije, modifikacije nehistonskih proteinov 7. Višje ravni organizacije kromatina Regije TAD (topologically associated domains), interakcije med kromosomi, kromatinske zanke Delujejo skupno, njihovi vplivi se prepletajo in urejajo dostopnost in kompaktnost kromatina in tvorijo tako imenovano epigenetsko pokrajino (epigenetic landscape). 2 Ključne besede Metilacija DNA CpG dinukleotidi, CpG otoki, bioinformacijske metode, eksperimentalne metode Histonske modifikacije: acetilacija, metilacija, ubikvitinacija Remodeliranje nukleosomov, remodeliranje kromatina: vključevanje histonskih različic spreminjanje lokacije nukleosomov; repozicioniranje nukleosomov Metode za analizo odprtih regij kromatina projekt ENCODE, Ensembl - regulome Vpletenost epigenetike v fiziologijo in razvoj bolezni Z RNA posredovano uravnavanje izražanja genov; RNA-mediated epigenetics regulation nekodirajoče RNA; mikro RNA Epiomike: epigenomika, epitranskriptomika, epiproteomika, epiomics Ključne besede genom, epigenom, epigenetska pokrajina, epigenetic landscape DNA-metiltransferaza; DNMT, DNA methyltransferase histonska acetiltransferaza; HAT, histone acetyltransferase histonska deacetilaza; HDAC, histone deacetylase histonska metiltransferaza; HMT, histone methyltransferase histonska demetilaza; HDM, histone demethylase pisalec, brisalec, bralec histon, histom, nukleosom, histonski kod kompleks kromatinskega remodeliranja, nucleosome remodeling machinery nekodirajoče RNA, mikro RNA (miRNA) inaktivacija kromosoma X, lionizacja, Xist; X-inactive specific transcript Genetsko vtisnjenje, imprinting 4 Epiomske ravni: Epigenomika, epitranskriptomika, epiproteomika Modifikacije na Potranskripcijske Potranslacijske ravni DNA modifikacije modifikacije 5caC RNA processing: -splicing, -5'-capping, -3'-polyadenylation + alternativni A-to-I: Adenosine-to-inosine RNA editing mehanizmi Encim ADAR: adenosine deaminase acting on RNA https://genesilico.pl/modomics/ https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/ Esteve-Puig R, Bueno-Costaa A, Esteller M. Writers, readers and erasers of RNA modifications in cancer. 2020 Method of the year 2016: Epitranskriptomika, potranskripcijske modifikacije RNA Pred sekvenciranjem se izvede imunoprecipitacija s protitelesi za potranskripcijsko modifikacijo. Uporaba protiteles anti-m6A: meRIP-seq - m6A-specific 2′-O-metiliran methylated RNA ribonukleozid N4-acetilcitidin N6-metiladenozin immunoprecipitation and sequencing, (Nm) N1-metiladenozin = m6A-seq = N6-methyladenosine- sequencing dRNA-seq: direct RNA-seq (Oxford Nanopore), PacBio N: katerikoli nukleotid Pisalec; writer: METTL3, Methyltransferase-like 3 (NCBI gene: 56339) Psevdouridilacija = 3 Brisalec; eraser: FTO, demetilacija izomerizacija uridina v psevdouridin. m6A, kodira RNA demetilazo (NCBI 6 -Vez dušik-ogljik (N–C), ki gene 79068) povezuje uracil s sladkorjem se prekine. Bralec; reader: m6A binding -Baza uracil se obrne za psevdouridin proteins 5-metilcitidin 180° vzdolž osi N3–C6. -Nastane nova vez ogljik- ogljik (C–C) med bazo in ADAR: adenosine deaminase RNA specific https://genesilico.pl/modomics/ sladkorjem. Cody in He, 2019. mRNA acetylation: a new addition to the epitranscriptome. Epiproteomika, potranslacijske modifikacije proteinov https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php Epigenomika je ena izmed omskih ravni MiRNomika je podkategorija epigenomike, obravnava se tudi kot samostojna omska raven. -bisulfitno sekvenciranje -MSP Analiza polimorfizmov -masna -methyl-Seq in izražanja spektrometrija, -jedrna magnetna -MeDIP-chip resonanca -MeDIP-Seq -ChIP-Seq MSP: methylation specific PCR MeDIP: methylated DNA immunoprecipitation – uporaba protiteles proti 5mC ChIP-Seq: chromatin immunoprecipitation sequencing Glavne kategorije epigenetskih mehanizmov 1. Metilacija DNA aktivacija 4. ncRNA represija DNMT Represija; zaviranje Z RNA-posredovano uravnavanje izražanja genov Proteini MBD izražanja genov RNA-mediated epigenetics regulation Short ncRNAs (miRNA) HAT Long ncRNAs (lncRNA) HDAC 2. Histonske modifikacije acetilacija aktivacija 3. Remodeliranje nukleosomov: 3a. vključevanje histonskih različic K4-HMT 3b. repozicioniranje nukleosomov HDM, HMT aktivacija H3K4me3 H2A metilacija represija H3K9me3 HP1 H2B K9-HMT Heterochromatin protein-1, H3 H3K27me3 Gen CBX5 S28 H4 H2A.Z fosforilacija aktivacija PRC1 Polycomb Repressive aktivacija Complex 1, 2 H3.3 ubikvitinacija PRC2 represija lncRNA HOX transcript Prost NFR -> aktivacija genov sumolacija represija HOTAIR antisense RNA Zaseden NFR -> represija Struktura kromatina Nukleosom – DNA vijačnica, ovita okoli histonske oktamere. Kromatin je kompleks DNA in proteinov. Kromatinska struktura je dinamična in nadzoruje izražanje genov in ostale celične procese. 10 Felsenfeld in Groudine, 2003. Controlling the double helix. 1. Metilacija DNA -kovalentna modifikacija citozinov na CpG dinukleotidih -CpG otoki – regije, bogate s CpG dinukleotidi, večinoma na 5‘ koncih genov, -60% promotorjev v genomu -metilirana DNA -> UTIŠANJE promotorja Metilacija DNA inhibira aktivacijo transkripcije - prepreči transkripcijskim dejavnikom (TF) vezavo na tarčna mesta; TFBS: transcription factor binding site 11 Tissue -specific Differentially Methylated Regions (T-DMRs) nemetilirani DMR: Differentially Methylated Regions metilirani CG dinukleotidi CG dinukleotidi epigenomska raven raven DNA oseba 1 oseba 2 12 Brena RM, Huang TH, Plass C. Toward a human epigenome. Nat Genet. 2006;38:1359-60. SNP CpG otoki, obale, police Metilacija na obalah CpG otokov kaže višjo povezavo z izražanjem genov kot otoki CpG. > 75% tkivno specifičnih diferencialno metiliranih regij se nahaja na obalah CpG otokov. odprto morje polica obala otok obala polica odprto morje N shelf N shore island S shore S shelf Illumina CpG otoki CpG otoki (1-2% genoma): kratka območja DNA (55%). CpG otoki – v bližini regulatornih območij genov in lahko vplivajo na uravnavanje prepisovanja genov. CpG: 5'-C-phosphate-G-3' Izražanje gena CpG dinukleotid je označen s črko „p“, da se loči od komplementarnih CG parov dveh verig. metilna skupina http://www.appliedbiosystems.com/index.cfm 14 Metilacija: DNA-metiltransferaze (DNMT) katalizirajo prenos metilne skupine s S-adenozil metionina na mesto 5'-citozina citozin 5-metilcitozin DNA metiltransferaza Demetilacija: -Aktivna: metilna skupina se S-adenosyl- S-adenosyl- hidroksilira z encimi TET. methionine homocysteine -Pasivna: izguba metilacije med replikacijo DNA v primeru izgube/znižanega izražanja DNMT. Metil-DNA vezavni proteini: MBD proteini (methyl-CpG binding domain protein) https://www.genenames.org/data/genegroup/#!/group/1025 (trenutno anotiranih 11 genov) Npr. MECP2: methyl CpG binding protein 2 MBD: methyl CpG-binding domain MBD-Seq – metilirane regije obogatene z MBD. 15 DNMT - DNA-metiltransferaze DNMT3: de novo metilacija; DNMT1: vzdrževalna metilacija; vzpostavijo začetni vzorec metilacije vzdrževanje vzorcev metilacije tekom zgodnjega razvoja (blastocista); med celično delitvijo; de novo DNMTs: DNMT3A, DNMT3B maintenance DNMT DNMT2: ne metilira DNA, ampak tRNA, novo ime TRDMT1; tRNA aspartic acid methyltransferase 1 (Asp / D) TRDMT1: Udeležena v uravnavanje translacije proteinov. Tarčno mesto za metilacijo tRNA je v bližini pozicije ohlapne baze (wobble base); na citozinu na mestu 38. Izražanje tRNA metiltransferaze je spremenjeno pri raku. Somatske mutacije gena TRDMT1 pri različnih tipih raka. 16 1. Metilacija DNA 2. Demetilacija DNA TET1, TET1, TET1, TET: Tet methylcytosine dioxygenases, TET2, TET2, TET2, TET1: Ten-eleven translocation DNMT TET3 TET3 TET3 methylcytosine dioxygenase 1 Gen je dobil ime, ker je udeležen v translokacijo t(10;11)(q22;q23), pri kateri nastane KMT2A/MLL - TET1 fusion protein. TET1 se nahaja 10q- in 11q+ KMT2A: lysine methyltransferase 2A na 10q21.3 (staro ime gena je MLL: mixed- lineage leukemia) se nahaja na 11q23.3 Shi in sod. 2017. New Insights into 5hmC DNA Modification: Generation, Distribution and Function. 1. Metilacija DNA 2. Demetilacija DNA TET1, TET1, TET1, TET2, TET2, TET2, DNMT TET3 TET3 TET3 deaminacija deaminacija BER BER timin 5hmU base excision repair Timin-DNA glikozilaza (TDG) prepozna 5hmU, 5fC in 5caC ter cepi glikozidno vez, kar povzroči nastanek AP mesta. AP site Demetilacija: ne pride do odcepitve metilne skupine, ampak apirimidinsko mesto metilna skupina se hidroksilira (encimi TET) ali pa se 5mC deaminira do timina. Mesta AP in pari T:G (mismatches) se nato popravijo z encimi BER -> citozin. Bayraktar G., Kreutz MR. The role of activity-dependent DNA demethylation in the adult brain and in neurological disorders. Front. Mol. Neurosci. 2018 Primer vprašanja za izpit 1. Metilacija DNA 2. Demetilacija DNA TET1, TET1, TET1, TET2, TET2, TET2, DNMT TET3 TET3 TET3 deaminacija BER deaminacija BER base excision repair Timin-DNA glikozilaza (TDG) AP site Orodja za določanje CpG otokov CpG Island Searcher: Kriteriji za določanje CpG otokov 1. Razmerje Obs/Exp CpG > 0,6 „Observed-to-expected CpG ratio“; opazovano/pričakovano razmerje CpG Obs = število CpG-jev; število dinukleotidov CG v zaporedju š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝐶 𝑥 š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝐺 N = dolžina nukleotidnega zaporedja Exp = 𝑁 C = citozin G = gvanin CpG = CpG dunukleotid Razmerje Obs/Exp CpG = š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝐶𝑝𝐺 𝑥 𝑁 š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝐶 𝑥 š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑜 𝐺 2. Vsebnost GC > 50 % (vsebnost G in C; vseh, ne samo dinukleotidov) 3. 200 bp - obseg nukleotidnega zaporedja CG: 19 (observed) C: 70 G: 31 taacatacttattgtttttaactactcgttttccattcgactcatcacgctccccccccccccccccccccttatccgttccgttcgacgtatttcgttgtctaatttctgacgtaacttgttccctgttaagtaccgtttatggcctatact ccggtatttaaaacgacgacgattccaccgtaaagccgtcaaccagatgaacgacctcgctcgttatatttttccggcaaaatccctatttccgattcgcttagtgctaccgacgctatatcgttccgcaattcctcgagatcatcg atttcttctccggcgacgtctcaagtttttccgttacaacgcgatctatcctgtaaattcgaccgcgctcattctcacgttttatacattgcgcagttgattacgctaaataatccgctgactgttaccttccctgttagattcgcgcatt ataaactacttactttaacaaacgattttcacagtttaatttctgcgatgacgtctaactcttcagttttaaccgataacaaccttctcgacacttcgtttcttataccatcctcgttatccatacccattcttaaatttctcactactatt ctctttacaaccacattagctctaatcttacatctaatttctatacataaaatgctccttctgctgtatgtttctctttctcataattacatttttaattactaaatccctcatccctcccacccatctattccaccatcaaggttatacacc atgtattactgtaaaacccactaatattaattgtcaccgatattaaacgaaattcattcacacaaatttcattaattaccttttcttattaattgcatatgtactctacatatactcaaccaactaaaaatcgatattttacatttgattt ctaatgtaccccacaactttcttgctttatgattgaacttagctttataataatagttatttaccctaacgcatatactcttatccttatatgaaccttgcttatttgttagatttatccaatctaaaccacagataatatcccttctctta cttcattttattatcaccattttcacttcttcctagatatatacaattatataactctattaccacattttcccttaactttctgttctgcactattatatttactctttttctaaaaccttcttaactttttcagatgca %GC = 70+31/200 19 𝑥 200 Razmerje Obs/Exp CpG = https://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html 70 𝑥 31 Določanje CpG otokov - promotor gena CHKB 1. Razmerje med opazovano / pričakovano pogostnostjo CpG dinukleotidov vsaj 0,6 (observed/expected CpG ratio) 2. GC% ≥ 50% 3. Obseg ≥ 200 bp 1. Iz brskalnika Ensembl pridobite zaporedje navzgor od gena CHKB https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Exons?db=core;g=ENSG00000100288;r=22:50578959-50601455;t=ENST00000406938 2. Zaporedje vnesite v orodje EMBOSS Cpgplot: https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/ Kuan in sod. 2014 CpG otoki na HSA19 (65 kb), 5 genov, 4 CpG otoki Promotorji genov OCEL1, NR2F6 in ANKLE1 se prekrivajo s CpG otoki (i, iii and iv), en CpG otok (ii) se prekriva s 3. eksonom NR2F6. CpG otoki CpG dinukleotidi (CpG dinucleotides, CpG sites) Illingworth in Bird, 2009. CpG islands – ‘A rough guide’. Določanje CpG otokov, orodje MethPrimer http://www.urogene.org/methprimer/index1.html 25 Li LC, Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002;18:1427-31. Določanje CpG otokov, orodje MethPrimer CpG otoki CpG dinukleotidi; CpG sites Cytosine-phosphate-Guanine 26 Pristopi za študij epigenomike in miRNomike na ravni celotnega genoma Whole genome study approaches -AbaSI Coupled with Sequencing Uporaba tehnologij NGS v epigenomiki -Bisulfite-Treated Chromatin-Immunoprecipitated DNA / ChIP of Bisulfite-treated chromatin-Bisulfite Sequencing / Chromatin Immunoprecipitation with Bisulfite Methylation Sequencing Assay -Bisulfite Amplicon Sequencing -Bisulfite Sequencing With Padlock Probes -Whole-Genome Bisulfite Sequencing -Chemical Modification_Assisted Bisulfite Sequencing -Double-Digest Restriction Site_Associated DNA Marker Generation with a Methylation-Sensitive Restriction Enzyme -5-Formylcytosine Chemical Modification_Assisted Bisulfite Sequencing -5fC Chemical Labeling and C-to-T Transition During PCR -A 5-Formylcytosine-Selective Chemical Labeling -Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation and Sequencing -J-Binding Protein 1 Sequencing -M.SssI Methylase-Assisted Bisulfite Sequencing -Methyl-CpG Binding Domain (MBD)-Based Capture and Sequencing / Capture of Methylated DNA Using the Methyl- CpG Binding Domain MBD domain of MeCP2 / Methyl-CpG Binding Domain-Isolated Genome Sequencing -Methylated DNA Immunoprecipitation/DNA Immunoprecipitation Followed by High-Throughput Sequencing -Methylated-CpG Island Recovery Assay (MIRA) -Methylation-Sensitive Restriction Enzyme Sequencing -Oxidative Bisulfite Sequencing -Post-bisulfite Adapter Tagging -Reduced Bisulfite Sequencing/5-Carboxylcytosine Methylase-Assisted Bisulfite Sequencing -Reduced-Representation Bisulfite Sequencing -Reduced-Representation M.SssI Methylase-Assisted Bisulfite Sequencing -Tet-Assisted Bisulfite Sequencing -Tet-Assisted 5-Methylcytosine Sequencing -Tagmentation-Based Whole-Genome Bisulfite Sequencing http://enseqlopedia.com/ Metode za analizo metilacije DNA Bisulfitno sekvenciranje: bisulfitna modifikacija + sekvenciranje po Sangerju Bisulfitna modifikacija + restrikcijska analiza MSP - methylation-specific PCR; za metilacijo specifični PCR BS-seq: WGBS (whole genome bisulfite sequencing) in RRBS (reduced representation bisulfite sequencing) MeDIP - Methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP-chip, MeDIP-seq hMeDIP - Hydroxymethylated DNA immunoprecipitation, hMeDIP-chip, hMeDIP-seq MBD-Seq: Methyl-CpG-Binding Domain Sequencing MRE-seq - Methylation-Sensitive Restriction Enzyme sequencing Mikromreže: Infinium HumanMethylation 450K BeadChip (Illumina Inc., ZDA) Infinium HumanMethylation 27K BeadChip (Illumina Inc., ZDA) EpiTYPER - MassARRAY assay Ugotavljanje metilacije DNA z metodo bisulfitne modifikacije Tkivo, celice izolacija DNA Genomska DNA modifikacija z natrijevim bisulfitom (NaHSO3) C → U Cm → C PCR z začetnimi oligonukleotidi, “MSP - methylation-specific PCR”: specifičnimi za modificirano DNA -začetni oligonukleotidi za metilirano DNA, -začetni oligonukleotidi za nemetilrano DNA. Začetni oligonukleotidi ne vsebujejo Začetni oligonukleotidi vsebujejo vsaj eno CpG CpG mest. mesto na 3’ koncu; zadnjih pet nukleotidov. sekvenciranje restrikcijska bisulphite sequencing analiza 30 Metoda bisulfitne modifikacije bisulfitna DNA+ reakcija bisulfitna mešanica (NaHSO3) komplet reagentov Qiagen PCR aparatura – 5 ur vezava Pufer BL - pospešuje vezavo modificirane enoverižne DNA na kolono EpiTect spiranje Pufer BW - Wash Buffer (spiranje odvečnega natrijevega bisulfita) Pufer BD - Desulfonation Buffer (NaOH) desulfonacija Pufer BW - Wash Buffer spiranje (2x) Pufer EB - Elution Buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) elucija Vir: EpiTect Bisulfite Handbook, Qiagen Ugotavljanje nukleotidnega zaporedja po bisulfitni reakciji Pred bisulfitno modifikacijo Po bisulfitni modifikaciji CpG dinukleotid: Če je C metiliran, potem je C pred G. Če C ne bi bil metiliran, bi bil na tem mestu T pred G. TIMIN -> TIMIN CITOZIN -> URACIL -> TIMIN 5-METILCITOZIN -> CITOZIN 32 Ugotavljanje nukleotidnega zaporedja po bisulfitni reakciji bisulfitna modifikacija PCR DNA replikacija: 5mC → CITOZIN URACIL → TIMIN TIMIN → TIMIN Določanje statusa metilacije DNA - promotor gena TFAM Mitohondrijski transkripcijski faktor A pri govedu Prisotnost metilacije DNA je bila dokazana za 7 CpG dinukleotidov. Metilacija DNA je lahko prisotna tudi izven CpG otokov. Ex 1 Intron 1 -994 C/T rs42159487C>T Na enem lokusu ugotovljeno sovpadanje metilacije CpG dinukleotida s SNP-jem. Kunej in sod. Acta Argiculturae Slovenica, 108, 2, 65–69. Gen TFAM pri govedu Promotor SNP-ji so označeni s sivo barvo Na mestu, kjer je metiliran citozin CpG dinukleotidi so podčrtani (CpG dinukleotid) je SNP C>T. 5‘UTR EKSON 1 Intron 1 Prisotnost metilacije DNA dokazana za 7 CpG dinukleotidov Za dve CpG mesti ugotovljena hemimetilacija. Kunej in sod. Acta argiculturae Slovenica, 108, 2, 65–69. Za metilacijo specifični PCR, methylation-specific PCR; MSP 1. Bisulfitna modifikacija 2. PCR pomnoževanje z dvema paroma začetnih oligonukleotidov v dveh ločenih reakcijah: -začetna oligonukleotida za metilirano DNA (par M - Methylated), -začetna oligonukleotida za nemetilrano DNA (par U - Unmethylated). (na 3’ koncu vsebujejo CpG). 3. Agarozna gelska elektroforeza: -amplifikacija para M: metiliran dinukleotid CpG, -amplifikacija para U: nemetiliran dinukleotid CpG, -amplifikacija obeh parov: hemimetilacija. Methylated Unmethylated CpG CpG Metilirane/ MeDIP - Methylated DNA immunoprecipitation hMeDIP hidroksimetilirane regije protitelesa anti-5mC Hydroxymethylated DNA se obogatijo s immunoprecipitation, protitelesi. protitelesa anti-5hmC, hMeDIP-chip, hMeDIP-seq MeDIP MeDIP + + array-hybridization high-throughput/ NGS = MeDIP-chip = MeDIP-seq sekvenciranje metilirane DNA -Del DNA, pridobljene po sonikaciji označimo s cianinom-5. -Metilirano DNA, obogateno z imunoprecipitacijo označimo s cianinom-3. -Označene vzorce DNA kohibridiziramo na mikromrežo in analiziramo relativno razmerje med vzorcema. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2763296/pdf/jove-23-935.pdf Metilirane regije MBD-Seq: Methyl-CpG-Binding Domain Sequencing se obogatijo z MBD. Na metilirane citozine se vežejo Sonikacija DNA proteini MBD (methyl-binding domain), ki so označeni z biotinom. Proteine MBD obogatimo z magnetnimi kroglicami s streptavidinom. https://www.creativebiomart.net/epigenetics/services/dna-methylation-analysis-service/methyl-cpg-binding-domain-sequencing/ Methyl-seq; MRE-seq: Methylation-Sensitive Restriction Enzyme Sequencing Vzorcu DNA dodamo restrikcijske encime; par restrikcijskih encimov MspI in HpaII. Vzorec se razdeli na dva dela, sledi visokozmogljivostno sekvenciranje. En vzorec inkubiramo z encimom Drugi vzorec inkubiramo z MspI, ki cepi ne glede na encimom HpaII, ki cepi samo na metilacijski status citozinov. mestih brez metilacije. Cepi na zaporedju C^CGG. Cepi na zaporedju C^CGG, če NI metilacije DNA. Izoshizomer: par restrikcijskih encimov, ki cepita zaporedje na istem mestu. Sledi popravilo koncev, in dodajanje adapterjev za analizo NGS. Primerjalna analiza podatkov sekvenciranja obeh reakcij omogoča določitev zaporedij, ki so metilirana. Par restrikcijskih encimov prepozna isto zaporedje DNA, vendar se razlikuje v prepoznavanju metilacije DNA, kar omogoča razlikovanje med metiliranimi in nemetiliranimi zaporedji DNA. https://www.france-genomique.org/technological-expertises/regulome/mapping-of-dna-epigenetic-marks-methyl-seq/?lang=en Mikromreža za analizo več kot 450,000 mest metilacije DNA na ravni celotnega genoma Mikromreža je dizajnirana tako, da omogoča analizo CpG dinukleotidov v različnih delih genov ter znotraj in izven CpG otokov. TSS: transcription start site polica obala otok obala polica Dva tipa analize: Infinium I in Infinium II Infinium II: en tip sond za vsak CpG lokus (CpG dinukleotid). Sonde se končajo s C. Status metilacije DNA se določi po hibridizaciji s podaljševanjem za en nukleotid (single base extension step). Na mikromrežo nanesemo vzorec DNA, pri katerem je bila izvedena bisulfitna modifikacija. CpG dinukleotid po bisulfitni modifikaciji: Če je C metiliran, potem je C pred G. Če C ni metiliran, potem je T pred G. https://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_humanmethylation450.pdf Infinium I: dva tipa sond za vsak CpG lokus (CpG dinukleotid); specifična za prisotnost ali odsotnost metilne skupine. Sonda M za detekcijo metiliranih mest (Methylated CpG site), sonda se konča s CG. Sonda U za detekcijo nemetiliranih mest (Unmethylated CpG site), sonda se konča s CA. 1. Sonda M, specifična za prisotnost metilne skupine, se konča s CG. 1. Sonda U, specifična za odsotnost metilne skupine, se konča s CA. 2. Metiliran CpG lokus na DNA vzorcu, ki ga analiziramo (C pred G). 2. Nemetiliran CpG lokus na DNA vzorcu, ki ga analiziramo (T pred G). 3. Zaporedji sta komplementarni, pride do hibridizacije, 3. Ujemanje nukleotidnih zaporedij, popolna komplementarnost podaljševanja za en nukleotid in detekcije signala. podaljševanje za en nukleotid in detekcija signala. 1. Sonda U, specifična za odsotnost metilne skupine, se konča s CA. 1. Sonda M, specifična za prisotnost metilne skupine, se konča s CG. 2. Metiliran CpG lokus na DNA vzorcu, ki ga analiziramo (C pred G). 2. Nemetiliran CpG lokus na DNA vzorcu, ki ga analiziramo (T pred G) 3. Neujemanje v enem nukleotidu v zaporedjih (single-base 3. Neujemanje v enem nukleotidu v zaporedjih (single-base mismatch), ni podaljševanja za en nukleotid in ni detekcije signala. mismatch), ni podaljševanja za en nukleotid in ni detekcije signala. https://emea.illumina.com/science/technology/microarray/infinium-methylation-assay.html?langsel=/si/ Primer asociacijske raziskave na ravni celotnega epigenoma -20 genov z razliko v ravni metilacije DNA med preiskovanci s PD in kontrolami. -17 genov z razliko v ravni metilacije DNA med preiskovanci s PD z/brez anksioznosti. -Gena FANCC in TNKS2 značilno povezana s PD z dvema metodama. 1. Infinium(®) HumanMethylation 450K beadchip (Illumina Inc., USA) Manhattan plot 2. EpiTYPER MassARRAY: 1. bisulfitna modifikacija genomske DNA, 2. pomnoževanje s PCR, desni ZO vsebujejo promotor T7 (T7 promoter tag), kar omogoča in vitro transkripcijo, 3. cepitev RNA z RNazo A; cepitev ob uracilu, 4. produkti cepitve se analizirajo z masno spektrometrijo (MassARRAY Analyzer). Metilirane in nemetilirane citozine ločimo s programsko opremo EpiTYPER. Metiliran CpG dinukleotid povzroči premik masnega spektra za 16 Da. cg14115740 = oznaka sonde https://emea.illumina.com/science/technology/beadarray-technology/infinium-methylation-assay.html https://www.cd-genomics.com/EpiTYPER-DNA-Methylation-Analysis.html Encimi prepoznavajo enako zaporedje, vendar različna občutljivost za metilacijo DNA Methyl-seq; MRE-seq: Methylation-Sensitive Restriction Enzyme Sequencing MspI HpaII C/CGG – cepi v vsakem primeru, ne glede C/CGG – če ni metiliran na metilacijo. DamID: DNA adeninemethyltransferase (Dam) IDentification DpnI DpnII Cepi GATC – če je metiliran Cepi GATC – če ni metiliran GAmTC

Use Quizgecko on...
Browser
Browser