Hücre Biyolojisinde Deneysel Modeller ve Teknikler (PDF)

Hücre Biyolojisinde Deneysel Modeller ve Teknikler Hazırlayan: Dr Öğr Üyesi Peyda Korhan Dr Öğr Üyesi Gülhas Solmaz Prof Dr Neşe Atabey Tıbbi Biyoloji ve GeneEk Hücre Biyolojisinde Deneysel Modeller Hücrelerin ortak bir atadan evrimleşmiş olması m...

Hücre Biyolojisinde Deneysel Modeller ve Teknikler Hazırlayan: Dr Öğr Üyesi Peyda Korhan Dr Öğr Üyesi Gülhas Solmaz Prof Dr Neşe Atabey Tıbbi Biyoloji ve GeneEk Hücre Biyolojisinde Deneysel Modeller Hücrelerin ortak bir atadan evrimleşmiş olması moleküler biyoloji için önemlidir Tüm hücrelerin temel özelliklerinin korunması nedeniyle , bir tip hücreden alınan bilgiler diğer hücreler için de uygulanabilir. Bazı organizma ve hücreler moleküler biyolojide yaygın şekilde modeli olarak kullanılır.  E. coli: E. coli ile çalışmanın kolaylığı onu moleküler biyoloji için temel model haline getirdi. Sadelikleri, hızlı çoğalmaları, basit besinsel gereksinimleri tercih sebebidir. Özellikle gene:k analizler, DNA replikasyonu, gene:k kod, gen ekspresyonu ve protein sentezinin anlaşılması gibi, moleküler biyolojik araşErmalarda avantaj sağlar. E. coli’nin genomu, yaklaşık olarak, 4,6 milyon baz çiftinden oluşur ve 4000 civarında gen içerir. İnsan genomu yaklaşık olarak bin kez daha buyüktür (yaklaşık 3 milyar baz çifti) ve 20.000 protein kodlayan gen içerdiği düşünülmektedir Bir gecede 108 kadar yüksek sayıda hücre içeren bakteri kolonileri gelişebildiğinden, penisilin gibi an:biyo:klere dirençli, mutant E. coli varyantlarının seçilimi hızlı ve kolaydır. E. coli’nin en hızlı bölündüğü besin karışımları; glukoz, tuzlar ile amino asitler, vitaminler ve nükleik asit öncülleri gibi çeşitli organik bileşikleri içerir. Bununla birlikte E. coli, sadece tuzlar, bir azot kaynağı (amonyum gibi) ile bir karbon ve enerji kaynağından (glukoz gibi) oluşan çok daha basit bir ortamda da çoğalabilir. Tüm amino asitlerini, nükleo:tlerini ve diğer organik bileşiklerini sentezlemek zorunda oldukları için, bu gibi ortamlarda bakteriler biraz daha yavaş çoğalırlar (yaklaşık 40 dakika bölünme süresi). Basitleş:rilmiş ortamda bu biyosente:k reaksiyonları gerçekleş:rme yeteneği, E. coli’yi, söz konusu biyokimyasal yolların aydınlaElmasında oldukça kullanışlı bir hale ge:rmiş:r.  Mayalar:ökaryotik hücreler için en basit modeldir. Ökaryo'k hücre biyolojisinin birçok temek yönünün çalışılması için önemli bir modeldir En sık çalışılan maya Saccharomyces cerevisiae’nın genomu 12 milyon baz çiftinden oluşur ve 6000 civarında gen içerir. Nükleer zarla çevrili belirgin bir çekirdeği vardır, genomik DNA’sı 16 doğrusal kromozom şeklinde düzenlenmiştir ve sitoplazmasında hücre iskeleti ve hücre içi organeller bulunur Mayalar, bakteriler kadar hızlı çoğalmasalar da her 2 saaFe bir bölünürler ve tek bir hücreden koloni halinde çoğaltılabilirler. maya mutantları; DNA replikasyonu, transkripsiyon, RNA işlenmesi, protein tasnifi ve hücre bölünmesinin düzenlenmesi dâhil ökaryotlardaki birçok temel işlevin anlaşılmasında önemli olmuştur.  Caenorhabditis elegans : hayvan gelişimi ve farklılaşması çalışmaları için basit bir modeldir. Bir nematod olan C. elegans genomu 100 milyon baz çiftine yakındır, 19.000 gen içermektedir Biyolojik olarak, nispeten basit yapılı birçok hücreli organizmadır. Erişkin kurtlar sadece 959 somatik hücre ile 1000-2000 germ hücresinden oluşmuştur. Laboratuvarda kolayca yetiştirilebilir ve genetik olarak manipüle edilebilir. C. elegans’ın sadeliği, gelişim sürecinin mikroskobik gözlemle incelenmesine olanak sağlar Bu analizler, erişkin kurdun tüm hücrelerinin embriyonik kökeninin ve soyunun devamlılığının izlenmesini sağlar. Genetik çalışmalarla da gelişimsel hatalardan sorumlu mutasyonların birçoğu tanımlandı. Benzer genlerin kompleks hayvanlarda işlev gördüğü bulunmuştur.  Drosophila melanogaster : gene'ği onu gelişim biyolojisinde anahtar bir model haline ge'rdi. Drosophila’nın laboratuvarda kolayca bakılıp çoğalDlabilmesi ve üreme dön- güsünün kısalığı (yaklaşık 2 haHa), onu geneJk çalışmalar için kullanışlı bir organizma yapmaktadır. Genler ve kromozomlar arasındaki ilişki gibi geneJğin birçok temel kavramı, yirminci yüzyılın başlarında Drosophila ile yapılan çalışmalarından türeJlmişJr Ç̧ok hücreli karmaşık organizmaların vücut planının oluşumu açısından, hayvan gelişimini yöneten moleküler mekanizmaların anlaşılmasında olağanüstü katkı sağladı.  Omurgalılar Zebrabalığı omurgalı gelişimi için önemli bir modeldir. Zebrabalığı omurgalı gelişiminin genetik çalışmaları için bir dizi avantajlara sahiptir. Bu balıkların laboratuvarda bakımı kolaydır ve 3-4 aylık üreme süreleri ile hızlı çoğalırlar. Embriyoları anne vücudunun dışında gelişir ve şeffaftırlar, bu nedenle gelişimin erken evreleri kolayca gözlenebilir. Kanserin oluşum ve ilerlemesinin araştırıldığı çalışmalarda tümör model oluşumu için kullanılır  Fare insan biyolojisi için en yakın modeldir. Memeliler arasında fare, geneJk analizler için en uygun olan canlıdır. spesifik mutant genlerin fare germ haPnda oluşturulması ve böylece bu genlerin gelişim üzerindeki etkilerinin veya diğer hücresel işlevlerin tüm hayvan bağlamında çalışılabildiği, transgenik farelerin üreJme önemli gelişmelerdendir. Şekil 1.21 İnsan gelişimi için model olarak fare Bir çocuk ve bir fare, embriyonik gelişim sürecinde melanositlerin (derinin İnsan gelişimi için farenin uygun bir model olduğu, sadece renklenmesinden sorumlu hücreler) normal göçü insan ve fare genomlarının benzerliğiyle değil, aynı zamanda için gerekli olan bir gendeki mutasyonların sonucu olarak, benzer pigmentasyon homolog genlerdeki mutasyonların her iki türde de benzer bozuklukları (piebaldism) gösterirler. (R. A. gelişim bozuklukları ile sonuçlanmasıyla da gösterilmişJr; Fleichman’ın izniyle, Markey Cancer Center, University of Kentucky.) piebaldism (bir pigmentasyon defekJ) çarpıcı bir örnek oluşturmaktadır  Hayvan hücre kültürü Çok hücreli organizmaların hücrelerini incelemek için önemli bir yaklaşım, kontrollü laboratuvar koşullarında manipüle edilebilecekleri kültürde izole edilmiş hücreler yeJşJrmekJr. Kültürlenmiş hücrelerin kullanımı, DNA replikasyonu, gen ekspresyonu, protein sentezi, işlenmesi ve hücre bölünmesi mekanizmalarını açıklayan deneyler de dâhil olmak üzere memeli hücre biyolojisinin birçok yönünün incelenmesine izin vermişJr. hayvan hücrelerinin kültür ortamında büyütülebilme yeteneği, bütünlüğü korunan organizma içinde hücre büyümesini ve farklılaşmasını kontrol eden sinyal mekanizmalarının incelenmesine olanak sağlamışDr Embryonik kök hücre: erken embriyodan alınarak hazırlanan bu hücreler, erişkin organizmalarda mevcut tüm hücre Jplerine farklılaşabilme özelliklerini korurlar. Embriyonik kök hücreler, gelişim ve farklılaşmanın araşBrılmasında önemli bir rol oynamanın yanı sıra, nakil (transplantasyon) terapileri için bir doku kaynağı sağlayarak insan hastalıklarının tedavisine katkıda bulunma imkanı sunmaktadır  Hayvan hücre kültürü Bir dokudan hazırlanan başlangıç hücre kültürlerine birincil kültürler denir.) Birincil kültürdeki hücreler, kültür kabının yüzeyini kaplayıncaya kadar çoğalırlar. Daha sonra, kültür kabından alınabilir ve seyrelElerek, ikincil kültürleri oluşturmak üzere, tekrar kültür kaplarına konulabilir. Bu işlem defalarca tekrarlanabilir, ancak normal hücrelerin çoğu kültürde sonsuza kadar çoğalOlamaz. Örneğin, normal insan fibroblastları genellikle, 50 ile 100 kez populasyonu ikiye katlar, sonra üremeyi durdurur ve ölürler. Embriyonik kök hücreler ve tümörlerden alınan hücreler çoğunlukla, kültürde süresiz çoğalırlar ve ölümsüz hücre hatları olarak tanımlanırlar. Oluşturulan ilk insan hücre haW, 1951’de serviks kanserinden izole edilen ve binlerce laboratuvarda insan hücre biyolojisinin çalışılması için kullanılmış olan HeLa hücreleridir  Virüsler hücreleri çalışmak için basit modellerdir. Virüsler, kendi başlarına çoğalamayan hücre içi parazitlerdir. Konakçı hücreleri enfekte edip, hücre mekanizmasını zorla kullanarak, daha çok virüs par@külü oluşturmak üzere çoğalırlar. En basit şekliyle virüsler, bir protein kılıfla sarılmış olan genomik nükleik asiDen (DNA ya da RNA) ibareKr Hücre fonksiyonlarının incelenmesinde kullanılabilecek basit sistemlerdir Hayvan virüslerinin genomları, yaklaşık 3000 ile 300.000 baz çiOi içerirler, 12’den daha az gen içerir, Bazı hayvan virüsleri taraTndan enfeksiyonun normal hücreleri kanser hücrelerine dönüştürebileceği de dikkat çekicidir. İlk olarak 1911 yılında Peyton Rous taraTndan tanımlanan bu kansere neden olan virüsler üzerine olan çalışmalar, sadece hücre ve moleküler biyoloji düzeyinde mevcut kanser anlayışımızın temelini oluşturmakla kalmadı, aynı zamanda hayvan hücresi büyümesini ve farklılaşmasını kontrol eden birçok moleküler mekanizmanın açıklanmasına da imkan tanıdı.  Hücre Biyolojisinin Araçları: Mikroskobi ve Hücre Altbirimlerine Ayırma Robert Hooke 1665’de basit bir ışık mikroskobu ile bir şişe mantarı parçasını gözlemleyerek “hücre” sözcüğünü ilk kez kullanmıştır. Hücrelerin çoğu gözle görülemeyecek kadar küçüktür (İnsan gözünün çözünürlük sınırı yaklaşık 0,1 mm veya 100 mikrondur). Bu nedenle mikroskoba gereksinim vardır.  Oküler Işık Mikroskobu Işık mikroskobunda ışık, kondansatör merceği ile numune üzerine odaklanır. Numune üzerinden geçen ışık, objek>f merceği ile toplanır. Objek>f merceğinde numunenin Kondansör büyütülmüş ara bir görüntüsü oluşur Işık ve kaynagı diyafram Bu ara görüntü oküler lens (göz merceği) taraFndan tekrar büyütülür Böylece numune büyütülmüş olarak Objek&f lens Oküler lens Toplam büyütme incelenebilir. 10X 10X 100X Toplam büyütme = objek>f lens taraFndan 40X 10X 400X yapılan büyütme × oküler lens taraFndan 100X 10X 1000X yapılan büyütme  Işık Mikroskobu Işık mikroskobu kullanılarak 1-100μm çapında olan hücreler ile çekirdek, kloraplastlar ve mitokondriler gibi hücre içindeki büyük organeller de izlenebilir Bu boyuPan küçük hücreler ve hücre yapıları için ışık mikroskobunun çözünürlüğü yeterli değildir. Çözünürlük: Bir mikroskobun küçük mesafelerle ayrılmış objeleri ayırt etme kapasitesi  Işık Mikroskobu Çeşitleri Aydınlık-alan mikroskobu: En basit ışık mikroskobudur Işık direkt olarak numuneden (hücreden) geçer. Hücrenin farklı bölgelerini ayırt edebilme kapasitesi, görünen ışığın hücre bileşenleri tarafından soğurulmasından kaynaklanan kontrasta bağlıdır Hücrelerin farklı bölgelerini ayırt edebilmek amacıyla kontrast oluşturabilmek için hücreler genellikle proteinlere ya da nükleik asitlere bağlanan boyalar ile boyanır Boyama öncesinde, numunenin yapılarını stabilize etmek ve korumak için numune aseEk asit, alkol, formaldehit gibi sabitleyicilerle (fiksa7f) muamele edilir (=fiksasyon) Fiksasyon hücreleri öldürerek hücre yapısını koruduğu için, canlı hücreler ile yapılacak araşOrmalar için uygun değildir Boyanmış benign böbrek tümör kesidinin aydınlık-alan mikroskop görüntüsü  Işık Mikroskobu Çeşitleri Faz-kontrast mikroskobu ve diferansiyel interferens-kontrast mikroskobu: Canlı hücrelerin görüntülenmesinde kullanılırlar Hücrenin farklı bölgeleri arasındaki yoğunluk veya kalınlık farklılıklarını, elde edilen görüntüde kontrast farklılıklarına dönüştüren opEk sistemler içerirler. Bu sebeple, düşük soğurma yapan saydam hücre yapılarını bile boyama yapmadan canlı hücrede incelemeye olanak sağlarlar. İnsan yanak hücrelerinin (A) faz- kontrast ve (B) diferansiyel interferens-kontrast mikroskobisi ile elde edilen görüntüleri Floresan Mikroskobu ve GFP Hücre içindeki ve hücre yüzeyindeki belirli moleküller, işaretleme yöntemleri ile görüntülenebilmekte ve hücre içi/yüzeyi lokasyonları belirlenebilmektedir: Spesifik genler ve RNA transkriptleri à komplementer diziye sahip nükleik asit probları ile Proteinler à proteine spesifik anEkorlar ile işaretlenebilir Floresan mikroskobisinde, canlı veya sabitlenmiş (fikse edilmiş) hücrelerdeki tespit edilmek istenilen molekül, bir floresan boya ile işaretlenir. Floresan boya (florofor ya da florokrom): belirli bir dalga boyundaki ışığı (genellikle UV) absorbe edip nanosaniyeler içinde daha uzun dalga boyunda ışık yayan moleküller. Her floresan boyanın kendine özgü bir absorpsiyon (uyarma/eksitasyon) spektrumu ve emisyon spektrumu vardır. Floresan Mikroskobu ve GFP Floresan mikroskobisi; bir doku ya da hücredeki belirli proteinleri, floresan boyalar ile bağlanmış an>korlarla işaretleyerek proteinin hücredeki lokasyonunu ve dağılımını saptamak için sıklıkla kullanılır. Ø Örnekte tespit edilmek istenilen proteine spesifik floresan işaretli an2korlar ile örnek muamele edilir. Ø Floresan mikroskobunun ışık kaynağından çıkan ışık, eksitasyon filtresinden geçerek belirli bir dalga boyunda objek2f lensi ve dikroik ayna aracılığıyla numune üzerine gönderilir. Ø Numunedeki an2jene bağlanmış floresan işaretli an2korlar uyarılır. Ø Uyarılan floresanlı an2korlardan belirli dalda boyunda ışık yayılır. Ø Yayılan bu ışık, objek2f lensi aracılığıyla emisyon filtresine yönlendirilir. Ø Emisyon filtresinden sadece an2jene spesifik an2korun işaretlendiği floresan boyaya özgü bir dalga boyundaki ışık geçer ve detektöre ulaşır. Ø Detektör ile tespit edilen sinyal sayesinde tespit edilmek istenilen an2jenin numunedeki lokasyonu ve ekspresyonu görüntülenir.  Floresan Mikroskobu ve GFP Denizanası yeşil floresan proteini (GFP), canlı hücrelerin içindeki proteinlerin floresan mikroskobu ile görüntülenmesini mümkün kılmaktadır: Ø GFP, standard rekombinat DNA teknolojileri kullanılarak, tespit edilmek istenilen proteinle birleştirilir ve böylece GFP-eklentili protein hücrede eksprese oldukça, GFP proteini de eksprese olur Ø Böylece, hücreyi fikse etmeye ve boyamaya gerek olmadan, tespit edilmek istenilen protein floresan mikroskobu ile görüntülenebilir. Ø Mavi, sarı, kırmızı emisyona sahip çeşitli floresan boyalar ile aynı hücredeki iki farklı protein işaretlenerek bunların eş zamanlı görüntülenmesi mümkün olmaktadır. GFP ile işaretlenmiş bir proteinin floresan mikroskobisi. GFP ile füzyon oluşturmuş bir mikrotübül ilişkili protein, fare nöron kültüründeki hücrelere aktarılarak floreasan mikroskobu ile görüntülendi. Çekirdek DAPI ile maviye boyandı. Proteinlerin hücre içindeki hareketlerinin mikroskop ile takip edilmesi Foto-ağartma sonrası floresan ışımanın geri kazanımı (FRAP): GFP işaretli proteinlerin hareketlerinin çalışılmasında yaygın olarak kullanılır. Hücrede GFP işaretli bir proteinin eksprese edildiği bir bölge, lazer gibi yüksek yoğunluklu ışığa maruz bırakılarak ağartılır. Ağartılmamış bölgedeki GFP işaretli proteinler, ağartılmış bölgeye göç ettiklerinde, o bölgedeki floresan sinyali tekrar kazanılır. Floresan sinyalinin geri kazanım hızı, proteinin hücre içindeki hareket hızının ölçümünü sağlar. Proteinlerin hücre içindeki etkileşimlerinin mikroskop ile takip edilmesi Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET): Bir hücre içindeki iki proteinin birbiri ile etkileşimlerinin analizinde kullanılır. FRET ile analiz edilecek iki protein hücre içinde fiziksel olarak birbirlerine yakın ( 100.000 rpm) çeviren bir cihaz) ile bir dizi santrifüjasyon aşaması San[ifügasyon ile hücre bileşenleri büyüklüklerine ve yoğunluklarına göre santrifüj ;pinin dibine doğru hareket ederler ve çökel; oluştururlar à En büyük ve en ağır olan hücre bileşenleri en hızlı çöker Hücre Altbirimlerine Ayırma (Subcellular frac,ona,on) Diferansiyel santrifüj ile zenginleştirilmiş fakat hala saf olmayan organel fraksiyonları elde edilir. Örneğin: mitokondri, lizozomlar ve peroksizomlar aynı fraksiyonda toplanabilir Daha ileri düzeyde saflaştırma için à yoğunluk-gradient santrifügasyonu 1. Hız santrifügasyonu ile: Örnek, sükroz gradientinin üzerine tabaka oluşturacak biçimde eklenir Farklı büyüklükteki partiküller, gradient içerisinden geçerken farklı hızda çökerler ve ayrı bandlar halinde hareket ederler Gradientin tek tek fraksiyonların toplanması ile, mitokondri, lizozomlar ve peroksizomlar gibi benzer büyüklükteki ayrı organeller farklı fraksiyonlarda toplanabilir. Hücre Altbirimlerine Ayırma (Subcellular frac,ona,on) Yoğunluk-gradient santrifügasyonu 2. Denge santrifügasyonu ile: Örnek, yüksek sükroz veya sezyum klorür içeren bir gradientte santrifüjlenir Örnek içindeki hücre yapıları, çökme hızına göre ayrışmak yerine, kaldırma kuvvetlerinin çevredeki sükroz/sezyum klorür çözeltisine eşit olduğu denge pozisyonuna gelecek şekilde ayrışırlar ve bandlar oluştururlar. Farklı zar tiplerine sahip hücre yapılarının birbirinden ayrılmasında kullanılabilir Örneğin: granüllü (ribozom içeren) ve granülsüz (düz, ribozom içermeyen) endoplazmik retikulumdan gelen veziküllerin ayrıştırılması Ribozomlar, çok fazla RNA içerdikleri için, granüllü endoplazmik retikulum vezikülleri daha yoğundur à granüllü endoplasmik retikulumun sükroz içinde dengeye gelebilmesi, gradientte daha yoğun sükrozun olduğu tüpün alt kısımlarında olacaktır Subgingival diş plağı görüntüsü. Ağız epitelinde kolonize olmuş maya Yoğun iplik şeklinde hücre dışı matriks (Candida albicans) hücreleri Çubuk şeklinde bakteriler Kırmızı: Candida albicans Mavi: hücre çekirdekleri Yeşil: Sitoplazma